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[Bio-Edu] Surfactant – PF-68, PS80 の添加は常識 – 凝集の抑制 – ID12904 [2020/05/26]

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界面活性剤

タンパク質の凝集抑制には、、古くから界面活性剤 (surfactant)の添加で改善されることが知られている。いろいろな界面活性剤の研究実績が積まれて、現在では、プルロニック (Pluronic)とポリソルベート (Polysorbate)の2種類が、その役割を代表するようになった。抗体医薬品では、殆どがPolysorbate 80が使用されるまでになっている。

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  • Pluronic
  • Polysorbate

Pluronic F-68 (ploxamer 188)

F-68は、凝集抑制に多用される

特許において、0.001% PF-68の添加することは、常識のようで有る

AAVベクターの凝集を防ぐための組成物およびその方法 (特許, 2012)
【課題】凝集なく、ビリオン、特にAAV(アデノ随伴ウイルス)ビリオンの高濃度ストック溶液を調製するための組成物および方法の提供。

【解決手段】ビリオン調製物におけるビリオンの凝集を防ぐ方法であって、少なくとも約200mMのイオン強度を達成するためにビリオン調製物に1種類以上の賦形剤を添加することを含む、方法。高いイオン強度および適度な浸透圧のこの組合せは、クエン酸ナトリウムのような高い価数の塩を用いて達成される。

https://patents.google.com/patent/JP2014111625A/ja

AAV Purification by Iodixanol Gradient Ultracentrifugation – イオジキサノール勾配超遠心によるAAV精製

https://www.addgene.org/protocols/aav-purification-iodixanol-gradient-ultracentrifugation/

その他情報

製品情報、毒性関連、分析手法など。

  • molecular weight : 8.4kDa (approx.)
  • 製品
    Non-ionic surfactant (100x) – Thermo Fisher Scientific –
    https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/24040032
  • 哺乳類細胞培養液中の界面活性剤プルロニックF-68の測定のためのアッセイの開発 (1998)
    • 動物細胞培養液中のプルロニックF-68の比色測定法
    • 以前に肝臓組織でプルロニックを測定するために開発された「チオシアン酸コバルト」との複合体の形成に基づく
    • 複合体の吸光度を328 nmで測定にり感度アップ
    • 複合体を酢酸エチルで洗浄 → アッセイの再現性が向上
    • 培養液の未知の成分によって引き起こされる干渉を低減には、臨界量のエタノールの添加が必要
    • 無血清培地でのプルロニック濃度が0.01から0.2%(w / v)の間で直線的
    • 0.01%(w / v)の低い検出レベルでは、相関係数(R2)は0.998
    • 培地中血清の存在は、感度を低下させるが、0.04から0.16%(w / v)プルロニックまで直線的
    • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9735146/
  • F-68は、試験した範囲の用量で末梢運動、感覚、または動機付けの影響を混乱させることなく、神経伝達物質の取り込みと放出を減らし、ラットに学習と記憶障害を引き起こす
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC311314/
  • 細胞培養の攪拌翼により生じる剪断力から細胞を保護、トリプシン損傷細胞を修復し膜の多孔性の減少、細胞付着を低減する :
    Pluronic Enhances the Robustness and Reduces the Cell Attachment of Mammalian Cells –
    https://www.researchgate.net/publication/5523814_Pluronic_Enhances_the_Robustness_and_Reduces_the_Cell_Attachment_of_Mammalian_Cells/link/09e414fa0ed97088ed000000/download
  • プルロニック F-68の分析方法 (2010):
    Determination of Pluronic F-68 in High Protein Matrices by HPLC-RAM-ELSD, – Helen Chung, Melissa Khor, and Jinshu Qiu* Amgen Inc., One Amgen Center Dr., Thousand Oaks, CA 91320
    http://imtakt.com/jp/Support/UserReport/@USA-Amgen/2010-05-18_HPLC_2010_Poster_v3.pdf
    • Cadenza HS-C18 (150 x 3.0 mm, 3μ)
    • restricted access media (RAM) 固定層
    • HPLC system
      • pump, 0.4 mL/min
      • autosampler
      • column switching valve
      • evaporative light scattering detector (ELSD)
    • 0.1% acetic acid (HAc)
    • 0.1% HAc in acetonitrile
    • gradient elution
      • 0 – 5.0 min : 0% B
      • 5.1 – 10.0 min : 10% B
      • 10.1 – 15.0 min : 45% B
      • 15.1 – 25.0 min : 100% B
      • 25.1 – 35.0 min : 0% B
    • Proteins eluted in the void volume
    • while PF-68 eluted at 14.5 min
    • sensitivity (10 mg/L quantitation limit)
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Polysorbate

特にPolysorbate 80は、日本油脂から高純度品が市販されたことで、多くのバイオロジクスで使用されている。

molecular weight : 1,310 Da

Information for the package leaflet regarding polysorbates used as excipients in medicinal products for human use – EMA/CHMP 2018

https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/draft-information-package-leaflet-regarding-polysorbates-used-excipients-medicinal-products-human_en.pdf

BIoPharm International 22(6) 32-48 Best Practices for Formulation and Manufacturing of Biotech Drug Products

https://www.researchgate.net/publication/279558359_Best_Practices_for_formulation_and_manufacturing_of_biotech_drug_products

Concise Review: Considerations for the Formulation, Delivery and Administration Routes of Biopharmaceuticals

https://www.heighpubs.org/hjb/abb-aid1004.php
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参考 UF/DF関連

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Control of Protein Particle Formation During Ultrafiltration/Diafiltration Through Interfacial Protection (2014)

この研究は、限外濾過/ダイアフィルトレーション(UF / DF)中のタンパク質粒子形成のメカニズムを調査し、攪拌がタンパク質界面の吸着と脱着を促進することにより粒子形成を促進することを発見しました。導電率が低く、界面活性剤が存在しているため、小規模の攪拌試験では粒子形成のレベルが低下し、ポンプとUF / DFでも同じ傾向が見られました。ポリソルベート80(PS80)およびヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(HPβCD)は、UF / DFでの粒子形成をそれぞれ15倍および4倍減少させました。構造安定性、コロイド安定性、および表面張力の測定により、PS80がタンパク質界面の吸着を防ぐことで粒子形成を防ぎ、低導電率がタンパク質のコロイド安定性を改善し、HPβCDの作用メカニズムが不明であることを示しました。

Control of Protein Particle Formation During Ultrafiltration/Diafiltration Through Interfacial Protection
編集履歴
2020/04/07 はりきり(Mr)
2020/05/26 追記 (PF-68の事例)、誤記訂正
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用語の解説、関連タグ付き投稿の抽出

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[rAAV-Edu] rAAV9の精製方法 – 特許,2018 – ID2559 [2019/10/05]
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surfactant

[Bio-Edu] Surfactant – PF-68, PS80 の添加は常識 – 凝集の抑制 – ID12904 [2020/05/26]

界面活性剤

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