rAAV vectorの精製方法
沈澱化と遠心分離、および超遠心機を使用する従来からのAAV精製方法を以下に2種類を示しました。工業化するには、超遠心機の使用は不適切です。何か代替できる方法に切り替える検討が工業化には必要です。具体的には、クロマトグラフィへの切り替えです。適切な吸着担体と詳細な条件検討により工業化を進める必要があります。
| Standard purification | Optimized purification |
| Transfection | Transfection |
| ⬇︎ | ⬇︎ |
|
Centrifugation (Cell Pellet by 2,500g x 10min) | Same as left |
| ⬇︎ | ⬇︎ |
| Freeze-thaw Lysis (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM MgCl2, pH8.0) | Same as left |
| ⬇︎ | ⬇︎ |
| cfg (2,500g x 10min) | Same sa left |
| ⬇︎ | ⬇︎ |
| cfg-sup | cfg-sup + culture supernatant |
| ⬇︎ | ⬇︎ |
| ⬇︎ | 8% PEG, 0,5M NaCl by adding 40% PEG 8000, 2.5M NaCl, 2h on ice |
| ⬇︎ | ⬇︎ |
| ⬇︎ | cfg (2,500g x 30min) |
| ⬇︎ | ⬇︎ |
| ⬇︎ | cfg-ppt |
| ⬇︎ | ⬇︎ |
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Resuspend (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM MgCl2, pH8.0) |
| ⬇︎ | ⬇︎ |
| DNase Treatment (100U/mL, 1h, 37’c) | Same as left |
| ⬇︎ | ⬇︎ |
| Ultracentrifugation (104,000g x 24h, 20’c) | Same as left |
| ⬇︎ | ⬇︎ |
| Dialysis vs PBS (overnight) | Same as left |
| ⬇︎ | ⬇︎ |
| Ultracentrifugation (182,000g x 24h, 20’c) | Same as left |
まとめ
上記表には，文献の精製手順の比較により，その詳細を示した．その内のOptimized Methodについて概略フローを，以下に示した．従来法と異なる点は，PEG8000による沈殿化である．
Culture -> Cell -> Lysate -> Clarification -> Polyethylene Glycol (PEG) 8000 -> Ultracentrifugation -> Dialysis ->Ultracentrifugation
注) UltracentrifugationをGradientと業界では読んでいるようで，おそよく塩化セシウムの濃度勾配を使用することが，それをGradientと称しているものと推察される．
編集履歴
2019/09/26, Mr.HARIKIRI
2023/10/25, 修正(まとめ)