[rAAV] AVB SepharoseによるrAAVの精製, 2009 – ID2461 [2019/09/28]

はじめに

rAAV (recombinant AAV)は、天然に存在するAAV(ウイルス)を遺伝子改変したものです。一般的にウイルスの電荷は負であるため、陰イオン交換体に吸着させて、精製度を高めることが可能です。しかし、負の電荷を持っている物質は、精製対象となるウイルスを含む培養液には多種多様が含まれているため、特異的な精製方法ではありません。そこで、得意的にAAVに結合性を有する生成機材が求められています。

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特異的な精製機材

AVB Sepharose (TM) によるsf9細胞由来のrAAVの精製

AAVを精製するクロマト機材

1. Sf9 cell (10e8)のバキュロウイルスによるTransfection 1hr処理
2. その後3daysの培養後
3. cellをharvestして、Detergent処理して抽出液を回収
4. capside化しなかったDNAなどをBenzonase処理により分解処理
5. Affinity Column精製 (10 mm x 100 mm, AVB Sepharose High Performance)
6. Washing: PBS(pH7.4)
7. Elution: low pH glycine-HCl (pH2.7)
8. Elution peak tiger: 1.7 x 10e13 particles/mL
9. Purity: >90% (4-12% SDS-PAGE)
10. AAV-1のVP1(81.4kDa), VP2(66.2kDa), VP3(59.6kDa)

Abbreviations: NRP, nuclease-resistant paticle; TU, transduction unit.

評価

nuclease resistance particles/cell: 3.7 x 10e4 ~ 9.6 x 10e4

文献

A Simplified Baculovirus-AAV Expression Vector System Coupled With One-step Affinity Purification Yields High-titer rAAV Stocks From Insect

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616308000

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編集履歴

2019/09/28, Mr.Harikiri
2022/01/12,追記(はじめに)

rAAV-production

…end

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