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AAV BIOLOGICS formulation production

[rAAV] rAAVの精製方法 – 澄明ろ過及び膜製品による精製 – ID2532 [2019/11/05]

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rAAVの精製方法

2016年の文献よりAAVの精製について解説する。また、Pall製品による精製について解説する。

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文献によれば、最終的には超遠心によりAAVベクターを濃縮精製するが、その超遠心は、CsCl濃度こうはいは使用しない方法を提供する。この遠心操作を多用したAAVベクター精製は、遠心機があれば簡単に行える。

  • Transfection of HEK293, and post culture
    • 20 Flasks of T-150, Three (3) Plasmid PEI
  • Centrifugation
    • 3,000 xg 10min
    • Cell pellet
  • (A) Lysis by Freeze-thaw, and (B) Nuclease, (C) sodium deoxycholate
    • (A) 50mM Tris-HCl, 0.15M NaCl, 2mM NgCl2, pH8, Dry ice – ethanol ←→ 37℃ 交互に細胞破砕
    • (B) Benzonase: 50 u/mL, RNase: 10U/mL, 37℃、30min
    • (C) 0.5% sodium deoxycholate, 37℃, 30min
  • Centrifugation
    • 2,500 g x 10min/sup
    • Pooling with cell culture supernatant
  • PEG 8000, NaCl Treatment / ppt
    • 8% PEG 8000, 0.5M NaCl by 40% PEG 8000, 2.5M NaCl
    • Incubation 1h , RT
    • Centrifugation 2,000 g x 30min
    • Re-suspend with HEPES buffer
  • Chloroform Extraction / cfg-sup / Evaporate
    • 疎水性タンパク質とPEGを除去する目的
    • Add equal volume of chroroform
    • Vortex going , 2min, RT
    • cfg (370 g x 5min), おそらく水槽にAAV
    • Evaporate 30min, RT
  • PEG 8000, AmSO4 Treatment / AAV in sup
    • 10% PEG 8000, 13.2% AmSO4 pH8.0 adjusted by stocked solution
    • Incubation at RT
    • (Impurity salt out ppt), HEPES buffer pH has to be kept at pH8.0, AAV stable is Alkaline that acid
  • Dialysis using 50kDa
    • diligent: PBS or MEMEM media with 0.001% puluronic F68 for preventing the aggregation

清澄ろ過

Pall製品による清朝濾過。

  • PHD11 : cellulose based capsule
  • PDP8 + Bio 10 : Bio 10のみではろ過量が少ないが、PDP8の組み合わせで良好にろ過が可能
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AEX Membrane

Pall 製品とこれらを用いたPallとのCo-Developingがサービスとして可能です。

  • Mustang Q membrane chromatography for enriched full capsids
    • Labの超遠心の代替
    • Mustang Membrane: 8000A pores vs polymer matrix:Packed 40-90μm beads 300-1000A pores
  • AAV5 gradient Elution by Mustang Q XT Membrane in Acrodisc Capsule
    • Step elution : Empty in 1st elution, full in 2nd elution
    • Peak 1 : 10 mS/cm, 13E11
    • Peak 2 : 14 mS/cm, 7E11
  • TFF
    • 100kDa for AAV, 300kDa for LV
    • TMP : 0.5 ~ 0.8 bar
    • Shear rate : <4,000 second-1 for hollow fibers; <4 L/min/m2 for cassettes.
    • J=K*ln(Cbulk/Cconc)

文献

Inexpensive, serotype-independent protocol for native and bioengineered recombinant adeno-associated virus purification

http://www.jbmethods.org/jbm/article/download/102/90
編集履歴
2019/10/04 Mr.Harikiri
2020/10/01 文言整備
2020/11/05 追記 (Pall膜製品による精製 Pall Webinarより)
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