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[rAAV] rAAVの精製方法,2016 – ID2532 [2019/10/04]

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[rAAV] rAAVの精製方法,2016 – ID2532 [2019/10/04]
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rAAVの精製方法

最終的には超遠心によりAAVベクターを濃縮精製するが、その超遠心は、CsCl濃度こうはいは使用しない方法を提供する。この遠心操作を多用したAAVベクター精製は、遠心機があれば簡単に行える。

Transfection of HEK293, and post culture

20 Flasks of T-150, 3 Plasmid PEI

Centrifugation / cell pellet

3,000 xg 10min

(A) Lysis by Freeze-thaw, and (B) Nuclease, (C) sodium deoxycholate

(A) 50mM Tris-HCl, 0.15M NaCl, 2mM NgCl2, pH8, Dry ice-ethanol ︎ 37℃ water
(B) Benzonase: 50u/mL, RNase: 10U/mL, 37℃, 30min
(C) 0.5% sodium deoxycholate, 37℃, 30min

cfg (2,500 g x 10min)/sup

Pooling with cell culture supernatant

PEG 8000, NaCl Treatment / ppt

1. 8% PEG 8000, 0.5M NaCl by 40% PEG 8000, 2.5M NaCld, incubation 1h, RT.
2. centrifuge 2,000g x 30min
3. Re-suspend with HEPES buffer

Chloroform Extraction / cfg-sup /Evaporate

疎水性タンパクとPEGを除去
1. Add equal volume of chloroform
2. Vortex going , 2min , RT.
3. cfg (370g x 5min) (おそらく水層にAAV)
4.. Evaporate 30min , RT

PEG 8000, AmSO4 Treatment / AAV in sup

1. 10% PEG 8000, 13.2% AmSO4 pH8.0 adjusted by stocked solution
2., Incubation at RT.
(Impurity salt out in ppt), HEPES buffer pH has to be kept at pH8.0, AAV stable is Alkaline that acid.

Dialysis using 50kDa

diligent: PBS or MEMEM media with 0.001% puluronic F68 for preventing the aggregation.

文献

Inexpensive, serotype-independent protocol for native and bioengineered recombinant adeno-associated virus purification: http://www.jbmethods.org/jbm/article/download/102/90

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