[Bio-Edu] CHO細胞培養プロセス – スケールアップ – 温度シフトの検討は欠かせない [2020/10/30]

はじめに

培養規模をスケールアップする目的は、コンスト低減化、需要対応などが上げられます。スケールアップした結果、生産性や品質を維持できない場合があります。それは技術移管が失敗したか、そもそもロバストネスな培養条件ではなかった可能性があります。

この記事では、スケールアップする場合の技術移管の考慮点を解説し、パラメータとして生産性や品質にどのように関わっているかも一部示したいと思います。

培養のスケールアップ

バイオロジクスの製造では、商用化に備えてコマーシャル製造に対応した製造所での製造を行うことになります。そうすると、開発サイトからコマーシャルサイトへの技術移管のプロスセか発生します。

大半の場合、その技術移管には、コマーシャルでの需要が増えることを見越してスケールアップが伴うことがほとんどです。

今回、Sartoriusの発表を解説します。プロス開発(15mL培養スケール)から生産規模(2000Lスケール)までの培養スケーラビリティの確保は、Sartoriusが開発したscale-convert toollを使うコトで容易であるとのことです。

基本的な制御パラメータは、以下の投稿をご参照ください。

[Bio-Culture] CHO細胞の培養における制御パラメータ、添加物及び装置・設備の事例 – ID6721[2020/09/08] ID6721

目的

スケールアップの目的は、実製造スケールまでのスケーラビリティを確認する事です。その後、コマーシャルでのスケールアップもあるかも知れませんが、スケールアウトの手法を取ることもあります。スケールアウトとは、例えば、2,000Lでのスケールアップが確認できているとして、その2,000Lでの実製造をマルチに実施する手法です。

スケールアップの結果、以下のことは、最低限必要な事項です。

• 設計品質 (QbD)の維持
  • 品質が変わらないこと
• Key Performance Indicator (KPI)とCritical Process parameter (CPP)に悪影響を与えない

考慮事項

インプット因子

• 製造所の違い (Location) : 培養における外部環境的な影響
• スケールの違い (Scale up) : スケーラビリティに影響
• Bioreactorのデザイン (geometry and design) : スケーラビリティに影響
• 攪拌方法(agitation, impeller type) : 細胞の生育
• ガス供給方法(gassing and sparging) : 細胞の生育
• 温度/pH : グリカン・プロファイル(CQA)に影響
  • プロダンション培養において、途中37℃の培養温度をそれより低い温度(37℃/pH7.0→31℃/pH7.0)にシフトさせることで、mAbの生産性を高めることができる。その場合、pH6.8では生産性の改善効果はあまり見られず、pH7.0で著名な改善が見られたref 2)
• 重要品質特性(Critical Quality Attribute; CQA)

温度シフト

組換え大腸菌において、温度シフトして低温にすることは、目的産物の増量が可能であることが知られており、一般的に採用されている。

動物細胞においても、培養の途中で低温にすることで目的産物の増量が見られる。その原理については、多数の文献からある程度の理解が進んでいる³⁾

• 哺乳類細胞における生理学的温度以下でのmRNA翻訳とタンパク質合成が増加する
• 生理学的温度でない場合、細胞全体的におけるタンパク質合成速度が低下するように考えられるが、コールドショック時に、グローバルなmRNAの翻訳と代謝が減少し、代謝負荷の減少と、mRNAの安定性の増加/分解の減少が相まって、組換えタンパク質のmRNA量が増加する
• まとめると、タンパク質合成自体は減少しますが、翻訳およびタンパク質の折り畳み/分泌機構に関して、組換えmRNAと内因性mRNAとの競合が少なくなる。したがって組換えタンパク質の収量が向上します。
• ただし、哺乳類細胞からの組換えタンパク質収量の潜在的な増加を支えるメカニズムは、以下で説明するように、これよりもはるかに複雑です。
• 開始因子eIF2αのリン酸化を介したmRNA翻訳とタンパク質合成の全体的な減少に加えて、哺乳類細胞のコールドショックはストレス顆粒（SG）と呼ばれる細胞質構造の形成につながると報告されている。
• 最近のデータでは、AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）の活性化によってタンパク質合成も並行して弱められ、ミトコンドリア機能障害の結果としてmTORシグナル伝達が阻害されることを示唆している。
• さらに、マイクロRNA（miR）の発現は、生理学的温度に移行するとCHO細胞でも調節されるが、これらの小さな非コードRNAは、主にターゲットmRNAの3′-UTRに結合することにより、特定のmRNAターゲットの翻訳の負の調節因子として機能する。 このようなmiRの人工的な操作は、CHO細胞に機能的な効果をもたらす。
• 特に、内因性miR-7の発現は、37°C​​で維持された細胞と比較して、培養で経時的に低温にシフトしたCHO細胞で大幅に減少することが示されていますが、miR-7が37°Cで一時的に過剰発現した場合 これにより、細胞増殖が効果的にブロックされたが、miR-7量の阻害は細胞増殖に影響を与えなかった。 しかし、37°C​​でのmiR-7の過剰発現は、細胞特異的な生産性の増加をもたらす。
• miR-7を過剰発現するCHO細胞のプロテオームに関するその後の研究では、miR-7の過剰発現により93個のタンパク質の発現が減少し、74個のタンパク質の発現が増加することが示された。 翻訳制御、RNAおよびDNAプロセシングに関与するタンパク質は、発現が減少したタンパク質に富んでおり、タンパク質の折り畳みおよび分泌に関与するタンパク質は、上方制御されたカテゴリーに富んでいた。
• グローバルな内因性タンパク質合成は哺乳類細胞の生理学的温度以下で減少するが、特定のタンパク質の合成はアップレギュレートされると報告されている。おそらくこれらはコールドショックに対する細胞応答と生存に必要または不可欠なタンパク質です。
• 伝えられるところによると、2つの哺乳類の低温誘導CSP、Rbm3（RNA結合モチーフタンパク質3）とCIRBP（低温誘導性RNA結合タンパク質）があり、これらは細菌のCSPと配列相同性がありません。生理学的温度以下で哺乳類細胞で発現が変化する20以上の追加の遺伝子とタンパク質を説明する報告がある。
• 低温ショックによって誘発されるタンパク質のアップレギュレーションを定義する際には注意が必要です。タンパク質分解は生理学的温度以下でも低下するため、タンパク質発現の増加ではなく、代謝回転の低下によりタンパク質量が明らかに増加する可能性もあります。
• これら2つの効果（タンパク質合成の増加と存在量の増加）の寄与は、新生ポリペプチド鎖の代謝放射性標識によって研究があり、それによると、新たに合成された材料と総タンパク質溶解物の標準タンパク質分析を決定できることを利用して、37°C​​と32°Cで合成されるタンパク質の範囲はほぼ同じであることがわかったが、32°Cでは37°Cと比較して全体的なタンパク質合成が減少するが、発現するポリペプチドは、いくつかある場合を除きます。 増加しているものもある。

温度を低くすることで、以下の具体的な影響が考えられる ³⁾。

• CHO cell phenotype : Response upon subphysiological temperature culturing
• Cell proliferation : ↓
• Biomass accumulation : ↓
• Cell viability : 延びる
• Apoptosis : ↓
• Culture duration : 延びる
• Metabolism : ↓(lactateなど)
• Tolerance to shear stress : ↑
• Cell-specific and volumetric productivity : ↑ or →
• Protein folding : おそらく改善
• Product quality : 増量可能

アウトプット因子

• 主要プロセス指標(KPI)
  • 生細胞濃度(VCC) : mAb生産性
  • 細胞生存率 : 不純物含量
  • 細胞直径 : (?)
  • 製品力価
  • グリカン : 品質

手段

スケールダウンモデル(Scale-down Model; SDM)では、以下に示すパラメータが、スケールアップや、その他、Bioreactorの違いなどに応じて変更が生じる可能性がある。

scale-convert toolは、Sartoriusのバイオリアクター製品に応じて、それぞのパラメータを提案する。

• 体積ガス流量(VVM)
• 単位体積あたりの電力(P/V)
• 物質移動係数(K_LA)
• ガス転送速度
• 攪拌速度