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AAV BIOLOGICS transfection

[rAAV-Production] – 治療用AAV Vector製造 – 考慮事項 – SM-ID12844 [2020/10/14]

[rAAV-Production] – 治療用AAV Vector製造 – 考慮事項 – SM-ID12844 [2020/10/14]
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ウイルス・ベクターと宿主細胞の準備

  • ベクターに適合した宿主細胞(master cell bank, working cell bank)
  • ベクター
    • construction
    • generation
    • premaster seed
    • master seed
    • working seed
  • PCLとは
    • Packaging or Producer Cell Line
    • Three Plasmid Transfectionに代わる生産系である
    • 目的遺伝子以外のAAVベタクー産生に必要な遺伝子を既に組み入れた生産細胞、または、目的遺伝子さえも組み入れた生産細胞
    • Oxgene、Vigeneなどが持っている
[用語] PCL – Packaging Cell Line/Producer Cell Line – ID22010 [2020/08/23]

Post Views: 36 目次1 Producer Cell LineとPackaging Cell Lineの違い2 FDAガイドライン2.1 遺伝子治療ベクターの遺伝子解析3 対応できる企業4 PCL関連文献リン […]

目標のAAVベタクー発現量

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15cm ディッシュ1枚から 1-2×1011 genome copies (GC)、または、1011-1012 GC/mL(各細胞あたり 2×104 – 1×105 ウイルス粒子)

Material

Plasmid DNA Batch

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ITRに組換えが少ないプラスミドを得る。

プラスミドの品質: 形質転換後の ITRs による組換えは、プラスミドのサイズを減少させるので、これを抑制させる。Life Technologies社の Stbl3 コンピテントセルをプラスミドの増幅に用いる。

Plasmidの精製

  1. プラスミドDNAをE.coliに形質転換
  2. シングルコロニー
  3. 拡大培養
  4. アルカリSDS法による粗精製
    • アルカリ-SDSは、大腸菌染色体DNAを細胞壁とともに除去するため、プラスミドDNAのみを得るのに信頼性の高い方法 (Lab向き)
  5. クロマト精製
  6. 脱塩
  7. 濃縮
  8. Sterile Filtration
  9. 分注
  10. 凍結保存(-30℃)
  11. 二種カルタヘナ法対応(GMP製造開始前)

pDNA培養特許

大腸菌中でプラスミドdnaを製造規模で生産するための流加発酵法及び培地 (特許, 2011), link

pDNA精製特許

プラスミド精製 (2007), link

Cytivaによる精製ストラテジー

ヒトおよび動物の遺伝子治療用プラスミドの精製プラスミドDNA (2007), link

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アルカリSDS法レジメ

ラボでの調製のレジメを以下に示した。

  1. 大腸菌の培養
  2. 遠心/E.coli
  3. 添加・懸濁(25mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 50mM Glucose), 100μL
  4. 穏やかに添加・撹拌(0.2M NaOH, 1% SDS), 200μL
  5. Incubation 4℃ for 5min
  6. 添加・懸濁 (7.5M 酢酸アンモニウム、pH7.6、氷冷)、150μL
  7. Incubation 4℃ for 5min
  8. 遠心(15,000rpm x 10min)/sup回収
  9. Sup/(100+200+150=450μL)
  10. 添加・懸濁(イソプロパノール), 270μL
  11. Incubation R/T for 10min
  12. 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
  13. 添加・懸濁(2M酢酸アンモニウム、pH7.6)、50μL
  14. Incubation 4℃ for 5min
  15. 遠心(15,000rpm x 10min)/sup回収 (pptにはタンパク質)
  16. 添加・懸濁(イソプロパノール)、50μL
  17. Incubation R/T for 10min
  18. 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
  19. 添加・懸濁(70% EtOH)、
  20. 遠心pptを乾燥
  21. 添加・懸濁; TE(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA pH8.0), 25μL
  22. RNA分解: 添加(リポヌクレアーゼA)、1μL
  23. Incubation 37℃ for 30min
  24. 反応停止: 添加・懸濁(2M酢酸アンモニウム、pH7.6)、12.5μL
  25. 添加・懸濁(イソプロパノール)、37.5μL
  26. Incubation R/T for 10min
  27. 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
  28. 添加・懸濁(70% EtOH)、適量
  29. 遠心pptを乾燥
  30. 溶解: TE(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA pH8.0), 25μL

GMPグレード/pDNAの調達

  • タカラバイオ – GMPグレードでのブラスミドDNA製造受託 – サイト
  • 和研薬 – プラスミドベクター製造 – サイト
  • WAKO – GMP準拠設備での高品質なプラスミド生産 – サイト
  • メディリッジ – 高品質 プラスミドDNA製造 – サイト
  • 徳島大学医学部 – 【学外受託サービス】 プラスミドDNA精製受託 – サイト

種類

  1. pAAV
  2. pRC
  3. pHelper

品質試験

  • 無菌試験 (JP 4.06, USP71, Ph Eur 2.6.1)
  • Endotoxin (JP 4.01, USP 85, Ph Eur 2.6.14)
  • 純度 (紫外線分光)
  • 制限酵素地図試験(アガロース電気泳動)
  • 塩基配列 (サンガー法)
  • CCC含量試験(アガロース電気泳動)
  • 宿主DNA (qPCR)
  • pH (JP 2.54)

日本薬局方

https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/0000066530.html

薬局方の国際調和

https://www.pmda.go.jp/rs-std-jp/standards-development/jp/0005.html

E.coli 産生株

治療用rAAV Vectorの調製には、3種類のPlasmid DNAが消耗品として必要である。

Plasmid DNAの調製にもGMP製造で行う必要があるため、Plasmid DNAを増やすための産生株(E.coli)の構築が必要となる。

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試験項目

  • ファージ否定試験(寒天培養)
  • 生菌数(コロニー)
  • コロニー形成能(目視)
  • 栄養要求試験(チアミン要求性、寒天培養)
  • 生化学反応(菌種同定試験)
  • 表現型試験(UV感受性、寒天培養)
  • プラスミド保持率試験(コロニー形成)
  • プラスミドコピー数(qPCR)
  • 制限酵素地図試験(アガロース電気泳動)
  • 塩基配列試験(サンガー法)

Master Cell Bank

継代数の少ない、健康な 293 細胞を使用する

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製造に関しての考慮事項

Transfection

以前は、以下のリン酸カルシウムが使用されたりしていたが、最近は、ポリエチレンイミン (PEI)を使用するが、よりグレードの高いPEIが開発されている。

  • コストを抑えるためにリン酸カルシウムを使用できるが、pHにセンシティブ(0.05の変動でも影響を受ける)であるため、HBSバッファの使用を推奨する

阻害要因

トランスフェクションの阻害要因には、以下のDNAセンサーに関わるものが考えられるsource: invivogen.com。

いずれも、多少なりとも細胞死に関わっている。

  • 細胞質の核酸センサー : dsDNAの感知
    • AIM2
      • AIM2は、パターン認識受容体 (その他にNLRP3)
      • dsDNAに強く反応、カスパーゼ1の活性化、炎症性サイトカイン誘導(IL-1β、IL-18)[1]
    • サイクリックGMP-AMPシンセターゼ(cGAS)
      • STING / TBK1 / IRF3シグナル伝達、1型IFN刺激因子(ISG)の発現誘導

Post Transfection Culture

プラスミドの濃度や比率、PEIの比率、加えて、培養条件によっては、発現効率は異なってくると考えられる。DoE手法による詳細な検討の実施が必要である。

  • 培地の血清の有無によって、発現量が異なる。Serotypeによっても異なる
  • トランスフぇクション後、72時間後まで引っ張れば、効率的であったとの報告もあるが、5日後で効率的であったとの報告もある(44)

44)
Lock M., Alvira M., et al.
Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum. Gene Ther. 2010;21(10):1259-1271. [PubMed]

Harvest & Clarification

目的rAAV以外の不純物は、ヒトへの投与では炎症の元となる

  • 細胞由来たんバク質
  • 細胞由来DNA
  • 血清タンパク質
  • 培地成分
  • ヘルパーDNA または、ヘルパーウイルス


References:

[1]. Patrick, K.L. et al. 2016. For Better or Worse: Cytosolic DNA Sensing during Intracellular Bacterial Infection Induces Potent Innate Immune Responses. J Mol Biol 428, 3372-3386.

発現タイターの検討

GFP コントロールウイルスでトランスフェクション効率条件を検討する。

Process Development

  • USP/DSP
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2015年現在、AAVの精製の報告

  • rAAV1
    • Poros 50HQ→Poros 10HQ→Sephacryl S-300 HR (AEX/AEX/SEC)
    • Iodixanol→HiTrap (UC/AEX)
    • AVB sepharose HP (IAC)
    • CsCl→Mustan S→Mustang Q (UC/DIAM)
    • CHT→AEX→HIC/SEC (Apatite/AEX/HIC/SEC)
  • BAP rAAV1
    • Monomeric avidin agarose (IAC)
  • rAAV2
    • Poros 20PI (AEX)
    • Poros 50HQ→Poros 50HQ (AEX/AEX)
    • Poros 50hS→Poros 50HS (CEX/CEX)
    • Poros 50HS→Q-Sepharose xl (CEX/AEX)
    • SP Sepharose HP→HiTrap Q (CEX/AEX)
    • SP Sepharose HP→Source 15Q (CEX/AEX)
    • Poros 20 HE (HEAC)
    • Iodixanol→HiTrap Q (UC/AEX)
    • Iodixanol→Herain (UC/HEAC)
    • Sulfonated cellulose (AC)
    • Iodixanol Poros HE (HEAC)
    • Poros HE (HEAC)
    • Poros 20 HE→Poros 50 PI (HEAC/AEX)
    • CHT→DEA Macroprep→Cellufine sulfate (Apatite/AEX/AC)
    • Heparin (HEAC)
    • Heparin→Phenyl-Sepharose→Heparin (HEAC/HIC/HEAC)
    • AVB sepharose (IAC)
    • Mono Q HR→Superdex 200 (AEX/SEC)
  • His6rAAV2
    • Ni-NTA agarose (IMAC)
  • rAAV4
    • Poros PI→Poros HQ (AEX/AEX)
    • Poros HQ (AEX)
  • rAAV5
    • Mustang S→Mustang Q (DEAM
    • Mono Q HR→Superdex 200 (AEX/SEC)
    • Iodixanol→HiTrap Q (UC/AEX)
    • SP Sepharose HP→Source 15 Q (CEX/AEX)
    • Poros PI (AEX)
    • mucin coupled Sepharose (AC)
  • rAAV6
    • Poros 50HQ→Poros 50HQ (AEX/AEX)
  • rAAV8
    • SP Sepharose HP→Source 15Q (CEX/AEX)
    • CsCl→Mustang S→Mustang Q (UC/DIAM)
    • Sephacryl S-300 HR→Poros 50HQ (SEC/AEX)
    • Pep8-agarose→HiTrap ! (IAC/AEX)
  • His6rAAV8
    • Ni-NTA agarose (IMAC)
  • rAAV9
    • CHT→Poros 50HS→CsCl (Apatite/CEX/UC)

Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties. 2015, Curr Pharm Biotechnol. 2015 Aug; 16(8):684-695

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5388796/?report=classic

Analytical Development

  • USP DevelopmentやDSP Developmentと同様に、その品目に特異的な分析法の開発が必要

AAV Vector drug substance batch

  • non-GNP Batch
  • GMP Batch
  • Relase Test
  • Characterization ( if needed)
  • Stability Test
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AAV Vector drug product Batch

  • non-GMP Batch
  • GMP Batch
  • Release Test
  • Stability Test
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編集履歴
2020/03/31 Mr.HARIKIRI
2020/10/14 追記(pDNAの精製、GMPグレード受託情報)

Cell bank

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参考文献

セルバイオラボ(Cell Biolabs)社 アデノ随伴ウイルス(AAV)発現/パッケージングシステム (コスモバイオ)

アデノ随伴ウイルス(AAV)とは (コスモバイオ)

STRATAGENEカタログ (コンピテントセル、トランスフェクション試薬

Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties, 2015

各SerotypeのrAAVの精製方法の文献からreviewした文献

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5388796/?report=classic
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