タグ: transfection

  • [Bio-Equipment] 遺伝子導入装置 ; Transfection for Plasmid to cells

    [Bio-Equipment] 遺伝子導入装置 ; Transfection for Plasmid to cells

    遺伝子導入装置

    バイオ医薬品の目的タンパク質をコードする遺伝子を産生細胞株に注入する装置。その操作の後、導入できた細胞のセレクション → クローニングへと進む。

    transfection

    MaxCyte ExPERT™ 遺伝子導入装置 (MaxCyte)

    https://kiko-tech.co.jp/products/maxcyte-expert-transfection-system/

    MaxCyte

    https://www.maxcyte.com

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  • [用語] Transfection ; トランスフェクション – 遺伝子を細胞内に入れる

    [用語] Transfection ; トランスフェクション – 遺伝子を細胞内に入れる

    transfection

    transfection ; トランスフェクションは、遺伝子組換え技術の基本である目的遺伝子(plasmid)を細胞 (Host Cell)の中に入れる操作です。使用する薬剤として強カチオンを使用したり、薬剤ではなく電気パルスで細胞膜を緩め小さな穴を作って挿入したりする方法があります。

    [Bio-Equipment] 遺伝子導入装置 ; Transfection for Plasmid to cells

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    [用語] Transfection ; トランスフェクション – 遺伝子を細胞内に入れる

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    [rAAV-Design] – 治療用AAV Vectorの設計 – 考慮事項 – ID12947 [2020/06/24]

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    [rAAV-Production] – 治療用AAV Vector製造 – 考慮事項 – SM-ID12844 [2020/10/14]

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    [Bio-Edu] バイオ医薬品における生産細胞株の構築の方法 – ID5029 △[2020/08/19]

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    [Data Link] ウイルスベクターによる遺伝子導入と発現(4) – ID4158 [2019/12/09]

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    [Bio-rAAV] rAAV vector製造でplasmidを細胞に導入するトランスフェクション試薬 – ID3336 [2020/07/21]

    [Bio-rAAV] rAAV vector製造でplasmidを細胞に導入するトランスフェクション試薬 – ID3336 [2020/07/21] はコメントを受け付けていません
    編集履歴
    2020/08/24 Mr.はりきり
    2021/10/14,追記(電子パルスについて)
  • [rAAV-Design] – 治療用AAV Vectorの設計 – 考慮事項 –  ID12947 [2020/06/24]

    [rAAV-Design] – 治療用AAV Vectorの設計 – 考慮事項 – ID12947 [2020/06/24]

    もとの設計図

    天然のアデノ随伴ウイルス(AAV)のゲノムは、1本鎖DNA (single stranded DNA; ssDNA)です。両端に遺伝子複製に関わるITRがあり、その間にAAVが複製に必要な構成タンパク質や機能性タンパク質の遺伝子が格納されています。

    REP遺伝子とCAP遺伝子は、1本ずつですが、翻訳開始位置をずらして翻訳されタンパク質が作られ、異なる構成タンパク質が作られるという効率的な遺伝子になっています。

    AAVは、ウイルスの中でも最も小さいウイルスの1つのParvoviarusであり、そのコンパクトさは遺伝子を使い回す設計にあるようです。

    図1. AAV Genome Map
    編集履歴
    2020/04/08 はりきり(Mr)
    2020/06/24 追記(もとの設計図)
    追記予定 : Biomarinが開発したF.VIII遺伝子治療AAV5には、FullのF.VIII遺伝子は大きさ的に入らないはずだが、どのような設計を行ったのか調べてみたい。

    治療用の設計

    治療用の設計では、単に遺伝子をカセットしてしまえば済むものではありません。

    効力面では、標的細胞からAAVの血清型を選択することも必要です。

    安全性面では、挿入する遺伝子にリスクがないのかもを考慮しなければなりません。

    詳細については、今後、取りまとめていきたいと思っています。今、思いつく事は、以下の通りの項目です。

    • 発現量関連
      • プロモーター : 強力
      • エンハンサー
    • 効力関連
      • 組織特異性
        • 血清型
      • 生体内分布
        • 中和抗体にすぐにやられなければ、血流に乗り続けて全身に及ぶことが可能なはず
    • 安全性関連
      • 癌化リスク配列
      • 生殖細胞への感染
        • 生体内分布と関連すると考えられる
      • 染色体への挿入
        • AAVベクターでは、rep/cap遺伝子は、目的plasmidに組み込まれないため、AAVの持つ染色体へのインテグレート機能は基本的に持たないが、相同組換えなどの偶然のケースは考えられる
      • 増殖(rcAAV)
    • 中和抗体対策関連
      • 血清型
      • 変異株
        • Lonzaでは、Ancestor AAV株の提供が可能
      • 自然免疫応答(ssDNA)

    AAVのセロタイプの違いや現在の臨床治験、治療応用について解説しますアデノ随伴ウイルス(AAV)とは

    コスモ・バイオ株式会社 -より

    https://www.cosmobio.co.jp/support/technology/a/adeno-associated-virus-aav-apb.asp
    変異修理歴
    2020/04/08 Mr.HARIKIRI

    アデノ随伴ウイルス(AAV)ベ クターの開発 と 血友 病B遺 伝子治療 への応用、村 松 慎 一
    Recombinant Adeno-associated Virus Vectors -Application to Gene Therapy bor Hemophilia B-

    https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjsth1990/9/1/9_1_13/_pdf
  • [rAAV-Production] – 治療用AAV Vector製造 – 考慮事項 – SM-ID12844 [2020/10/14]

    [rAAV-Production] – 治療用AAV Vector製造 – 考慮事項 – SM-ID12844 [2020/10/14]

    ウイルス・ベクターと宿主細胞の準備

    • ベクターに適合した宿主細胞(master cell bank, working cell bank)
    • ベクター
      • construction
      • generation
      • premaster seed
      • master seed
      • working seed
    • PCLとは
      • Packaging or Producer Cell Line
      • Three Plasmid Transfectionに代わる生産系である
      • 目的遺伝子以外のAAVベタクー産生に必要な遺伝子を既に組み入れた生産細胞、または、目的遺伝子さえも組み入れた生産細胞
      • Oxgene™️、Vigeneなどが持っている

    目標のAAVベタクー発現量

    15cm ディッシュ1枚から 1-2×1011 genome copies (GC)、または、1011-1012 GC/mL(各細胞あたり 2×104 – 1×105 ウイルス粒子)

    Material

    Plasmid DNA Batch

    [ignore]

    • non-GMP製造(14.0千万円/3 x Plasmid/200L/3m)
    • GMP製造(16.0千万円/3xPlasmid/200L/3m)
    • 分析(0.5千万円/3 x Plasmid/3m)
    • カルタヘナ申請 (0.5千万円/3m)

    [/ignore]

    ITRに組換えが少ないプラスミドを得る。

    プラスミドの品質: 形質転換後の ITRs による組換えは、プラスミドのサイズを減少させるので、これを抑制させる。Life Technologies社の Stbl3 コンピテントセルをプラスミドの増幅に用いる。

    Plasmidの精製

    1. プラスミドDNAをE.coliに形質転換
    2. シングルコロニー
    3. 拡大培養
    4. アルカリSDS法による粗精製
      • アルカリ-SDSは、大腸菌染色体DNAを細胞壁とともに除去するため、プラスミドDNAのみを得るのに信頼性の高い方法 (Lab向き)
    5. クロマト精製
    6. 脱塩
    7. 濃縮
    8. Sterile Filtration
    9. 分注
    10. 凍結保存(-30℃)
    11. 二種カルタヘナ法対応(GMP製造開始前)

    pDNA培養特許

    大腸菌中でプラスミドdnaを製造規模で生産するための流加発酵法及び培地 (特許, 2011), link

    pDNA精製特許

    プラスミド精製 (2007), link

    Cytivaによる精製ストラテジー

    ヒトおよび動物の遺伝子治療用プラスミドの精製プラスミドDNA (2007), link

    アルカリSDS法レジメ

    ラボでの調製のレジメを以下に示した。

    1. 大腸菌の培養
    2. 遠心/E.coli
    3. 添加・懸濁(25mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 50mM Glucose), 100μL
    4. 穏やかに添加・撹拌(0.2M NaOH, 1% SDS), 200μL
    5. Incubation 4℃ for 5min
    6. 添加・懸濁 (7.5M 酢酸アンモニウム、pH7.6、氷冷)、150μL
    7. Incubation 4℃ for 5min
    8. 遠心(15,000rpm x 10min)/sup回収
    9. Sup/(100+200+150=450μL)
    10. 添加・懸濁(イソプロパノール), 270μL
    11. Incubation R/T for 10min
    12. 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
    13. 添加・懸濁(2M酢酸アンモニウム、pH7.6)、50μL
    14. Incubation 4℃ for 5min
    15. 遠心(15,000rpm x 10min)/sup回収 (pptにはタンパク質)
    16. 添加・懸濁(イソプロパノール)、50μL
    17. Incubation R/T for 10min
    18. 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
    19. 添加・懸濁(70% EtOH)、
    20. 遠心pptを乾燥
    21. 添加・懸濁; TE(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA pH8.0), 25μL
    22. RNA分解: 添加(リポヌクレアーゼA)、1μL
    23. Incubation 37℃ for 30min
    24. 反応停止: 添加・懸濁(2M酢酸アンモニウム、pH7.6)、12.5μL
    25. 添加・懸濁(イソプロパノール)、37.5μL
    26. Incubation R/T for 10min
    27. 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
    28. 添加・懸濁(70% EtOH)、適量
    29. 遠心pptを乾燥
    30. 溶解: TE(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA pH8.0), 25μL

    GMPグレード/pDNAの調達

    • タカラバイオ – GMPグレードでのブラスミドDNA製造受託 – サイト
    • 和研薬 – プラスミドベクター製造 – サイト
    • WAKO – GMP準拠設備での高品質なプラスミド生産 – サイト
    • メディリッジ – 高品質 プラスミドDNA製造 – サイト
    • 徳島大学医学部 – 【学外受託サービス】 プラスミドDNA精製受託 – サイト

    種類

    1. pAAV
    2. pRC
    3. pHelper

    品質試験

    • 無菌試験 (JP 4.06, USP71, Ph Eur 2.6.1)
    • Endotoxin (JP 4.01, USP 85, Ph Eur 2.6.14)
    • 純度 (紫外線分光)
    • 制限酵素地図試験(アガロース電気泳動)
    • 塩基配列 (サンガー法)
    • CCC含量試験(アガロース電気泳動)
    • 宿主DNA (qPCR)
    • pH (JP 2.54)

    日本薬局方

    https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/0000066530.html

    薬局方の国際調和

    https://www.pmda.go.jp/rs-std-jp/standards-development/jp/0005.html

    E.coli 産生株

    治療用rAAV Vectorの調製には、3種類のPlasmid DNAが消耗品として必要である。

    Plasmid DNAの調製にもGMP製造で行う必要があるため、Plasmid DNAを増やすための産生株(E.coli)の構築が必要となる。

    [ignore]

    • 製造(1.0千万円/3m)
    • 分析(0.5千万円/3m)

    [/ignore]

    試験項目

    • ファージ否定試験(寒天培養)
    • 生菌数(コロニー)
    • コロニー形成能(目視)
    • 栄養要求試験(チアミン要求性、寒天培養)
    • 生化学反応(菌種同定試験)
    • 表現型試験(UV感受性、寒天培養)
    • プラスミド保持率試験(コロニー形成)
    • プラスミドコピー数(qPCR)
    • 制限酵素地図試験(アガロース電気泳動)
    • 塩基配列試験(サンガー法)

    Master Cell Bank

    継代数の少ない、健康な 293 細胞を使用する

    [ignore]

    • 製造(1.5千万円/1y)
    • 分析(2.5千万円/1y)

    [/ignore]

    製造に関しての考慮事項

    Transfection

    以前は、以下のリン酸カルシウムが使用されたりしていたが、最近は、ポリエチレンイミン (PEI)を使用するが、よりグレードの高いPEIが開発されている。

    • コストを抑えるためにリン酸カルシウムを使用できるが、pHにセンシティブ(0.05の変動でも影響を受ける)であるため、HBSバッファの使用を推奨する

    阻害要因

    トランスフェクションの阻害要因には、以下のDNAセンサーに関わるものが考えられるsource: invivogen.com。

    いずれも、多少なりとも細胞死に関わっている。

    • 細胞質の核酸センサー : dsDNAの感知
      • AIM2
        • AIM2は、パターン認識受容体 (その他にNLRP3)
        • dsDNAに強く反応、カスパーゼ1の活性化、炎症性サイトカイン誘導(IL-1β、IL-18)[1]
      • サイクリックGMP-AMPシンセターゼ(cGAS)
        • STING / TBK1 / IRF3シグナル伝達、1型IFN刺激因子(ISG)の発現誘導

    Post Transfection Culture

    プラスミドの濃度や比率、PEIの比率、加えて、培養条件によっては、発現効率は異なってくると考えられる。DoE手法による詳細な検討の実施が必要である。

    • 培地の血清の有無によって、発現量が異なる。Serotypeによっても異なる
    • トランスフぇクション後、72時間後まで引っ張れば、効率的であったとの報告もあるが、5日後で効率的であったとの報告もある(44)

    44)
    Lock M., Alvira M., et al.
    Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum. Gene Ther. 2010;21(10):1259-1271. [PubMed]

    Harvest & Clarification

    目的rAAV以外の不純物は、ヒトへの投与では炎症の元となる

    • 細胞由来たんバク質
    • 細胞由来DNA
    • 血清タンパク質
    • 培地成分
    • ヘルパーDNA または、ヘルパーウイルス


    References:

    [1]. Patrick, K.L. et al. 2016. For Better or Worse: Cytosolic DNA Sensing during Intracellular Bacterial Infection Induces Potent Innate Immune Responses. J Mol Biol 428, 3372-3386.

    発現タイターの検討

    GFP コントロールウイルスでトランスフェクション効率条件を検討する。

    Process Development

    • USP/DSP

    [ignore]

    (2.0千万円/50L/6m)

    [/ignore]

    2015年現在、AAVの精製の報告

    • rAAV1
      • Poros 50HQ→Poros 10HQ→Sephacryl S-300 HR (AEX/AEX/SEC)
      • Iodixanol→HiTrap (UC/AEX)
      • AVB sepharose HP (IAC)
      • CsCl→Mustan S→Mustang Q (UC/DIAM)
      • CHT→AEX→HIC/SEC (Apatite/AEX/HIC/SEC)
    • BAP rAAV1
      • Monomeric avidin agarose (IAC)
    • rAAV2
      • Poros 20PI (AEX)
      • Poros 50HQ→Poros 50HQ (AEX/AEX)
      • Poros 50hS→Poros 50HS (CEX/CEX)
      • Poros 50HS→Q-Sepharose xl (CEX/AEX)
      • SP Sepharose HP→HiTrap Q (CEX/AEX)
      • SP Sepharose HP→Source 15Q (CEX/AEX)
      • Poros 20 HE (HEAC)
      • Iodixanol→HiTrap Q (UC/AEX)
      • Iodixanol→Herain (UC/HEAC)
      • Sulfonated cellulose (AC)
      • Iodixanol Poros HE (HEAC)
      • Poros HE (HEAC)
      • Poros 20 HE→Poros 50 PI (HEAC/AEX)
      • CHT→DEA Macroprep→Cellufine sulfate (Apatite/AEX/AC)
      • Heparin (HEAC)
      • Heparin→Phenyl-Sepharose→Heparin (HEAC/HIC/HEAC)
      • AVB sepharose (IAC)
      • Mono Q HR→Superdex 200 (AEX/SEC)
    • His6rAAV2
      • Ni-NTA agarose (IMAC)
    • rAAV4
      • Poros PI→Poros HQ (AEX/AEX)
      • Poros HQ (AEX)
    • rAAV5
      • Mustang S→Mustang Q (DEAM
      • Mono Q HR→Superdex 200 (AEX/SEC)
      • Iodixanol→HiTrap Q (UC/AEX)
      • SP Sepharose HP→Source 15 Q (CEX/AEX)
      • Poros PI (AEX)
      • mucin coupled Sepharose (AC)
    • rAAV6
      • Poros 50HQ→Poros 50HQ (AEX/AEX)
    • rAAV8
      • SP Sepharose HP→Source 15Q (CEX/AEX)
      • CsCl→Mustang S→Mustang Q (UC/DIAM)
      • Sephacryl S-300 HR→Poros 50HQ (SEC/AEX)
      • Pep8-agarose→HiTrap ! (IAC/AEX)
    • His6rAAV8
      • Ni-NTA agarose (IMAC)
    • rAAV9
      • CHT→Poros 50HS→CsCl (Apatite/CEX/UC)

    Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties. 2015, Curr Pharm Biotechnol. 2015 Aug; 16(8):684-695

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5388796/?report=classic

    Analytical Development

    • USP DevelopmentやDSP Developmentと同様に、その品目に特異的な分析法の開発が必要

    AAV Vector drug substance batch

    • non-GNP Batch
    • GMP Batch
    • Relase Test
    • Characterization ( if needed)
    • Stability Test

    [ignore]

    • non GMP Batch (13.0千万円/3m)
    • GMP Batch (16.0千万円/3m)
    • Release Test (2.0千万円/3m)
    • Characterization (??)
    • Stability Test (2.0千万円/0,1,3,6,12,24,30,36)

    [/ignore]

    AAV Vector drug product Batch

    • non-GMP Batch
    • GMP Batch
    • Release Test
    • Stability Test

    [ignore]

    • non-GMP Batch (0.4千万円/3m)
    • GMP Batch (0.6千万円/3m)
    • Release Test (2.0千万円/3m)
    • Stability Test (2.0千万円/0,1,3,6,12,24,30,36)

    [/ignore]

    編集履歴
    2020/03/31 Mr.HARIKIRI
    2020/10/14 追記(pDNAの精製、GMPグレード受託情報)

    Cell bank

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    Page: 1 2

    参考文献

    セルバイオラボ(Cell Biolabs)社 アデノ随伴ウイルス(AAV)発現/パッケージングシステム (コスモバイオ)

    アデノ随伴ウイルス(AAV)とは (コスモバイオ)

    STRATAGENEカタログ (コンピテントセル、トランスフェクション試薬

    Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties, 2015

    各SerotypeのrAAVの精製方法の文献からreviewした文献

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5388796/?report=classic
  • [Bio-Edu] バイオ医薬品における生産細胞株の構築の方法 – ID5029 △[2020/08/19]

    [Bio-Edu] バイオ医薬品における生産細胞株の構築の方法 – ID5029 △[2020/08/19]

    細胞株の構築

    最近のバイオ医薬品の生産細胞株構築フローを以下に示します。

    1. Host Cell : 目的のタンパク質を発言させるために使用する出発材料である最適化された細胞。目的遺伝子を導入する予定の細胞。
    2. Transfection : 遺伝子の導入プロセス
    3. Selection & Cloning : 高い生産性と増殖による世代安定性を維持するモノクローンを選択するプロセス
    4. Cell Bank : Master Cell Bank (MCB)の候補となる細胞株
    5. MCB : 品質試験されて正式に決定した生産細胞株(Characterized Cell Bankという言い方もある)
    6. Working Cell Bank (WCB) : Expanded MCB/マスターセルバンクの拡大培養により細胞を増やして、MCBと土曜用に品質試験されて正式に決定した生産細胞株。ルーチン製造に使用される。

    生産細胞株の構築フロー

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    Post Views: 240 Host Cell 目的のタンパク質を発現させるために使用する出発材料となる最適化された細胞のこと 編集履歴 2020/08/24 Mr.はりきり

    導入遺伝子の構築

    • gene配列の合成
    • Plasmid DNAの合成
    目的遺伝子をのりしろ付きで合成し、Plasmidにパッケージする

    制御遺伝子には、Promoter、Enhancer などがあり、高い生産性を目的とする。抗生物質耐性遺伝子は、目的遺伝子が正しく細胞に導入された場合、それと共に発現するため、抗生物質を添加した培地でも生き延びることが可能となる。遺伝子が導入できなかった細胞は、死滅させることができる。

    遺伝子導入とは

    遺伝子の導入 (transfection)するの目的は、ある細胞に目的遺伝子を導入(Transfection)することで、宿主細胞の力を借りて、その遺伝子にコードされている蛋白質を生産させることである。

    どんな細胞を使うか

    一般的に通常の細胞は寄り添います。たとえば、皮膚細胞は、それぞれの細胞は積み上がることなく横に広がる性質があります( monolayer cell ).

    バイオ医薬品に使用される細胞は、1個1個の細胞が単独で浮遊するように改良が加えられており、細胞の培養において、個々の細胞に栄養分が均一に行き渡らせることが可能です。コントロールしやすい細胞になっています。

    長い歴史の中で、HEK細胞、CHO細胞などが、遺伝子導入する細胞として適しているとして多くのバイオロジクスで使用されています。

    原材料

    細胞とPlasmid DNAについて

    • 1個の細胞を使って1のPlasmid DNAを、その細胞に導入できる技術は、世の中にはありません。
    • 細胞もPlasmid DNAも物理化学的に不安定な部類です。人工的な処理やある環境下では、一定の確立で死ぬか壊れてしまいます。
    • 実際の導入には、細胞やPlasmidが、死ぬか壊れるかを考慮し、確実に細胞に遺伝子を導入するために、細胞数として数十万個、あるいは数百万個を用意します。
    • 細胞の中に導入したいPlasmid DNAも細胞に対して等倍はあり得ず、複数倍を用意します。経験則も存在します。

    導入 ( Transfection )

    導入法の種類

    • リン酸カルシウム
      • リン酸カルシウム溶液とPlasmid DNA複合微粒子を細胞に混和すると、プラス荷電化によりマイナス荷電している細胞膜表面に結合し、その後、エンドサイトーシス機構で取り込まれる
    • 陽イオン性脂質 (lipofection*1)
      • Plasmid DNAを包含したリン脂質と細胞膜が膜融合する原理で導入する
      • 試薬 ThermoFisher
    • マグネットフェクション (magnetofection)
      • 作製した磁気ナノパーティクルとPlasmid DNAの結合物を、底に沈めた細胞がある容器に注入し、細胞へ向かうように容器の下から磁気をかけて導入する
      • 試薬 funakoshi
    • エレクトロポレーション (electroporation)
      • エレクトロトランスポレーターを使用して電気のパルスをかけて細胞膜に小さな穴を開けてPlasmid DNAを導入する
      • 装置 参考記事*
    • ウイルス (virus vector)
      • 原理的にはLipofectionと類似。包含体としてのキャリアとしてウイルスを使われる。retrovirusなどが使われる

    参考記事

    遺伝子導入から細胞株構築まて

    遺伝子増幅

    生産量を増加させるには、導入遺伝子の増幅が行われるDHFR(Dihydrofolate reductase)系、GS(Glutamine synthetase)系などがある。

    • DHFR
      • DHFRの拮抗剤である MTX(methotrexate)の添加
      • dhfr 遺伝子が増幅す る現象を利用
      • dhfr 欠損 CHOを使用する
        • DG44
        • DXB11
      • 増幅方法 : MTX の濃度を徐々に上げていく

    蛋白質科学会アーカイブ, 2, e050 (2009)

    http://www.pssj.jp/archives/files/articles/050.pdf

    スクリーニングとクローニング

    スクリーニングとモノクローニングは、手法によって前後することができる。

    スリーニング

    スクリーニングの目的

    染色体DNAに導入された数十・数百万個の細胞には、以下のような違いが生じます。それを均一な集団にしていく作業がスクリーニングです。

    • 導入操作によって死んでいたり、弱っているいる細胞が混在している
    • 導入位置よっては、今は死んでいないが、数世代の分裂増殖によって細胞が弱わり死んでしまう細胞が混在している
    • 目的遺伝子による目的蛋白質の生産性が低い細胞が混在している
    • 元気がよく、目的蛋白質の生産性が高い細胞が非常に低い確立で含まれている

    スクリーニングの操作

    • まだ、クローンになっていない段階をプール(株)といいます。トランスフェクション後の細胞について、大まかな集団を一塊として、選別を行なっていきます。
    • 選別基準
      • 高い細胞増殖性 : 組み込んだ遺伝子により、生産される目的物質の生産量が培養当に多くなる
      • 高い培養期間生産性 : 一定の培養期間で高い生産性により、生産される目的物質の生産量が培養当に多くなる
      • 培養安定性 : スクリーニング過程では、継時的な培養が進められます。その過程では、細胞の世代数が進んで行きます。即ち老化です。すると、死んでいくプールもあり脱落します。元気に生きていくプールが残って行きます

    クローニング

    クローニグの目的

    スクリーニングによって元気が良く、目的蛋白質の生産性が高い細胞について、何種類かを選別できたあと、1つの細胞から増やしてクローン株として取得します。

    クローニングの操作

    • 先ずは、目的達成のために、処理する母数を増やす
    • 最終的には、1個の細胞のみを小さい容器に振り分ける操作の実施(限界希釈法)
      1. 数十個から数百個の細胞プールとして小さい容器に振り分ける(数千から数万プール)
      2. 培養装置により増殖させて元気がいい細胞プールを選別する。
      3. 1と2を何回か繰り返し、細胞プールを数十に絞る
      4. 限界希釈法により計算上1の細胞になるよう容器に振り分ける
      5. 元気が良いものを選び、生産性も高い10個程度の方法細胞を選出する
      6. 最終的には、生産する蛋白質の品質を確認し良い細胞1つに決定する。
      7. 選んだ細胞がモノクローンであることを確認する。

    Cell Bankの調製

    限外希釈により、1個の細胞しか、1の培養ウェルに入っていないことを確認して、拡大培養させます。ある程度の細胞数が得られたたら、それをCell Bankとして、クリオバイアルに分注して、液体窒息保管します。

    細胞融合法

    トラディショナルな技術です。

    ELISA用の抗体など、試薬に使用する抗体は、マウス由来の免疫抗体がほとんどです。ずいぶん昔では、このような抗体でもそのままか、抗体のフレームにヒトの配列と差し替えたりしてキメラ化した抗体が、医薬品として使用されていたこともあったようですが、免疫原性の問題を解決すべく、最近の抗体医薬は、完全ヒト化がほとんどです。

    細胞融合法による抗体産生細胞株の作成方法の概要は以下の通りです。

    • 細胞融合法の手順
      • 抗原取得(精製品)→
      • 動物に接種(免疫)→
      • サクリファイ→
      • 抗体産生細胞の取得(脾臓)→
      • 不死化細胞と細胞融合(ミエローマ; SP2/0, etc)→
      • ハイブリドーマ(hybridoma cell)→
      • スクリーニング→
      • 増殖性を獲得した抗体産生モノクローナル細胞
    • 細胞融合法には。
      • 融合効率は、1e-6 ~ 1e-4 (細胞1万個から100万個から1個)
      • PEG法
      • 電気融合法 (以下に最初の文献リンク)

    高効率細胞融合技術の開発

    https://www.tosoh.co.jp/technology/assets/2009_02_02.pdf

    Human Hybridoma Cells Produced by Electro-Fusin
    FEBS Letters, Vol.147, Issue 1, 1982

    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/6982832/

    用語

    *1: Lipofection : DNAを封入した脂質二重膜を細胞と接触させて、膜融合の現象により、DNAを細胞内に取りませんるTransfection手法の1つ

    参考文献

    徹底網羅!トランスフェクションにおける化学的手法、生物学的手法、物理的手法まとめ

    https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/gene-delivery-technologies/

    MATra-Magnet Assisted Transfection / Lipofection - マグネットフェクションとリポフェクションの原理に関する参考文献

    https://www.nacalai.co.jp/update/pdf/Information-441-light.pdf

    MSD マニュアル プロフェッショナル版 – 医療についての情報サイト

    https://www.msdmanuals.com/ja-jp/プロフェッショナル

    MSD マニュアル 家庭版 – 医療についての情報サイト

    https://www.msdmanuals.com/ja-jp/ホーム

    3.遺伝子導入と発現シリーズ 遺伝子導入と発現(1),

    https://www.jstage.jst.go.jp/article/manms/7/2/7_2_92/_pdf

    安定型細胞株作成のガイドライン

    http://www.lonzabio.jp/tech/pdf/tech_12.pdf

    トランスフェクション手法の紹介・比較

    https://www.funakoshi.co.jp/contents/65100
    編集履歴
    2020/01/11 はりきり(Mr)
    2020/04/23 追記 (Cell Bankの調製)
    2020/06/26 追記 (細胞融合法によるHybridoma cell取得)
    2020/08/19 追記 (構築フロー)
  • [Bio-rAAV] rAAV vector製造でplasmidを細胞に導入するトランスフェクション試薬 – ID3336 [2020/07/21]

    [Bio-rAAV] rAAV vector製造でplasmidを細胞に導入するトランスフェクション試薬 – ID3336 [2020/07/21]

    PEI

    Polyethylenimine (PEI)は、カルシウムよりも安定的に遺伝子を細胞に導入できます。そのトランスフェクション効率についても、研究が進められており、一般的なPEIより、10倍以上の効率が高められた製品も市販されています。

    医薬品の製造には、更に品質試験と品質管理された製品が必要です。

    • トランスフェクション効率
    • 品質
    • GMP適用品

    Polyplus Transfection社

    Polyplus社のサイト

    N/P ratio

    AAV2 production with optimized N/P ratio and PEI-mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3775943/

    FectoVIR®-AAV: a giant step for AAV large scale 

    https://insights.bio/cell-and-gene-therapy-insights/journal/articles/fectovir-aav-a-giant-step-for-aav-large-scale-manufacturing/

    Scalable Production of AAV Vectors in Orbitally Shaken HEK293 Cells

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6305802/

    Pharmaceutical Development of AAV-Based Gene Therapy Products for the Eye

    https://link.springer.com/article/10.1007/s11095-018-2554-7