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[Bio-Edu] ウイルスの等電点(pI) – 組換えAAVでは,empty/fullの違いでpIは異なる – 分離精製は工業化の課題である △- ID24561 [2021/02/23]

[Bio-Edu] ウイルスの等電点(pI) – 組換えAAVでは,empty/fullの違いでpIは異なる – 分離精製は工業化の課題である △- ID24561 [2021/02/23]

はじめに

遺伝子治療用のウイルス・ベクターとしてAAVを使用した場合、目的通りに目的の遺伝子をAAVの殻にパッケージングできるとは限りません。導入する遺伝子の大きさが大きい程、その導入効率は低下してくると考えられます。実際に、動物細胞または昆虫細胞に対して、遺伝子導入試薬を使って目的の遺伝子を導入させ(トランスフェクション)、AAVベクターを作る時、目的遺伝が含まれないAAVも多数産生されます。AAVはヒトにとって病原性が無く最もよく使われるウイルス・ベクターですが、ウイルスの殻の抗原性が問題になるため、極力、目的遺伝子を含まないAAVベクター(Empty)については精製で除去すべきです。目的遺伝子を含むAAVベクター(Full)との分離には、AAVベクターとしての等電点(pI)に違いを利用することが多く、陰イオン交換体を使用したカラムクロマトグラフィが使用できます。

なぜ、FullとEmptyとで、電荷が異なるかについては明確にはわかっていませんが、遺伝子であるDNAのパッケージの有無に関わることから、DNAのマイナス電荷の有無に関わるものと考えられます。完全にパッケージされているなら、その電荷がウイルスの殻の外に影響するとは考えにくいのですが、完全に否定することはできません。パッケージされることでウイルスの殻を構成していカプシドタンパク質のアミノ酸レベルで、プラスチャージのアミノ酸が殻の内側に向くこともあり得ます。その結果、殻の表面の電荷が変化することもあるでしょう。

また、完全にハッケージされる場合と全くされないという二極化をイメージしてはいけません。物理現象は、連続的なので、そのような短絡的なイメージではなく、途中の状態も存在することも考えてみましょう。例えば、殻が、完全な閉鎖形になっていなくて、例えば、映画「スターウォーズ」の「デススター」のように、表面が欠けている場合です。その欠け方も範囲の小さいものから大きいものまであると考えるべきです。そうすると、一部の遺伝子DNAが殻の隙間から飛び出ているAAV粒子もあることは想像できます

以上、多様な粒子としてAAVベクターが産生されており、その中からFullのみを分離精製することが、医薬品を作り上げていく上で、downstream; 精製工程における工業化の課題となる訳です。一方、upstream; 生産工程における工業化の課題は、パッケージング効率と産生量が工業化の課題となります。

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ウイルスの等電点(pI or IEP)

以下,文献によるとウイルスの表面電荷は,およそ酸性から中性域にあります(2.1~8.3).平均値は,5.0±1.3です.ウイルス精製では,陰イオン交換体クロマトグラフィ(AEX)による吸着/溶出で可能です.等電点とは,環境pHに応じて電気的に中性となるpHを等電点(pI or IEP: isoelectric point)と言います.今回紹介する文献では,公開されているウイルスのIEPを再度検証しています.1938年以降に行われた104のウィルスのIEPのデータがまとめられています.

図1. タンパク質上のカルボキシル基とアミノ基の電荷の変化
環境のpHに応じて,カルボキシル基とアミノ基の電荷が変化する.

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ウイルスの等電点の検証結果の詳細

表1. ウイルスのIEP
Host kingdomVirus speciesStrainIEP(s)MethodPurityReference
AnimaliaAdeno‐associated virus – 4Adeno‐associated virus – 42·6IEF‐DAHighSalo and Mayor (1978)
AnimaliaAlastrimButler3·4EM‐LMHighDouglas et al. (1969)
AnimaliaCowpoxBrighton4·3EM‐LMHighDouglas et al. (1969)
AnimaliaCowpoxBrighton (egg)4·3EM‐LMHighDouglas et al. (1966)
AnimaliaCowpoxBrighton (rabit)4·3EM‐LMHighDouglas et al. (1966)
AnimaliaCowpoxKampen5·4IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaCowpoxLeuwarden5·2IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaEncephalomyocarditis virusMengovirus L8·1 and 4·6IEF‐PAHighChlumecka et al. (1973)
AnimaliaEncephalomyocarditis virusMengovirus M4·4 and 6·3IEF‐PAHighChlumecka et al. (1973)
AnimaliaEncephalomyocarditis virusMengovirus M8·4 and 4·6IEF‐PAHighChlumecka et al. (1977)
AnimaliaEncephalomyocarditis virusMengovirus S4·6 and 6·8IEF‐PAHighChlumecka et al. (1973)
AnimaliaFeline panleukopenia virusCanine parvovirus5·0IEF‐A?Weichert et al. (1998)
AnimaliaHepatitis A virusHepatitis A virus2·8IEF‐DA?Nasser et al. (1992)
AnimaliaHuman adenovirus CHuman adenovirus 54·5EM‐LS?Trilisky and Lenhoff (2007)
AnimaliaHuman enterovirus BHuman coxsackievirus B 54·75 and 6·75IEF‐DALowButler et al. 1985
AnimaliaHuman enterovirus BHuman echovirus 15·6 and 5·1IEF?Murray and Parks 1980
AnimaliaHuman enterovirus BHuman echovirus 14·0IEF‐DALowButler et al. (1985)
AnimaliaHuman enterovirus BHuman echovirus 1 (4CH‐1)5·5IEF‐A?Zerda and Gerba (1984)
AnimaliaHuman enterovirus BHuman echovirus 1 (R115)6·2IEF‐A?Zerda and Gerba (1984)
AnimaliaHuman enterovirus BHuman echovirus 1 (V212)6·4IEF‐A?Zerda and Gerba (1984)
AnimaliaHuman enterovirus BHuman echovirus 1 (V239)5·3IEF‐A?Zerda and Gerba (1984)
AnimaliaHuman enterovirus BHuman echovirus 1 (V248)5·0IEF‐A?Zerda and Gerba (1984)
AnimaliaHuman enterovirus CHuman coxsackievirus A 216·1 and 4·8IEF?Murray and Parks (1980)
AnimaliaHuman rhinovirus AHuman rhinovirus 26·8CIEFLowSchnabel et al. (1996)
AnimaliaHuman rhinovirus AHuman rhinovirus 26·4IEF‐DALowKorant et al. (1975)
AnimaliaInfluenza A virusH1N1 (Leningrad)4·5, 4·35, 4·25, 4·0*EM‐LMHighMolodkina et al. (1986)
AnimaliaInfluenza A virusH3N16·5–6·8IEF‐PALowBrydak (1993)
AnimaliaInfluenza A virusH3N2 (Leningrad)5·0EM‐LMHighMolodkina et al. (1986)
AnimaliaInfluenza A virusPR85·3EM‐LMLowMiller et al. (1944)
AnimaliaInfluenza A virusInfluenza A virus6·5–7·0EDN‐FET?Patolsky et al. (2004)
AnimaliaMammalian orthoreovirusSerotype 3 (Dearing)3·8EM‐LMLowTaylor and Bosmann (1981b)
AnimaliaMammalian orthoreovirusSerotype 3 (Dearing)3·9IEF‐DALowFloyd and Sharp (1978)
AnimaliaMonkeypoxChimpanzee Paris6·2IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaMonkeypoxCopenhague6·5IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaMonkeypoxDenmark3·4EM‐LMHighDouglas et al. (1969)
AnimaliaNeuro‐VacciniaLevaditi4·2EM‐LMHighDouglas et al. 1969
AnimaliaNorwalk virusFunabashi5·9CIEF?Goodridge et al. (2004)
AnimaliaNorwalk virusHawaii virus6·0CIEF?Goodridge et al. (2004)
AnimaliaNorwalk virusKashiwa5·5CIEF?Goodridge et al. (2004)
AnimaliaNorwalk virusNarita5·5CIEF?Goodridge et al. (2004)
AnimaliaNorwalk virusNorwalk virus5·9CIEF?Goodridge et al. (2004)
AnimaliaNorwalk virusSeto6·0CIEF?Goodridge et al. (2004)
AnimaliaPapillomavirusPapillomavirus5·0AggregationHighBeard and Wyckoff (1938)
AnimaliaPoliovirusPV‐17·4 and 4·0IEF‐DA?Nasser et al. (1992)
AnimaliaPoliovirusPV‐16·9IEF?Brioen et al. (1985)
AnimaliaPoliovirusPV‐1 Brunender7·4 and 3·8IEF‐DA?La Colla et al. (1972)
AnimaliaPoliovirusPV‐1 Brunhilde7·1IEF‐A?Zerda and Gerba (1984)
AnimaliaPoliovirusPV‐1 Brunhilde7·1 and 4·5IEF‐DAHighMandel (1971)
AnimaliaPoliovirusPV‐1 Chat7·5 and 4·5IEF‐PA?Ward (1978)
AnimaliaPoliovirusPV‐1 LSc2ab6·6IEF‐A?Zerda and Gerba (1984)
AnimaliaPoliovirusPV‐1 LSc2ab6·6??Murray and Parks (1980)
AnimaliaPoliovirusPV‐1 LSc2ab6·75 and 4·1IEF‐DALowButler et al. (1985)
AnimaliaPoliovirusPV‐1 LSc2ab6·75 and 4·5IEF‐DALowButler et al. (1985)
AnimaliaPoliovirusPV‐1 Mahoney8·3IEF‐DALowFloyd and Sharp (1978)
AnimaliaPoliovirusPV‐2 Sabin T26·5 and 4·5IEF?Murray and Parks (1980)
AnimaliaRotavirus ASimian rotavirus A/SA118·0IEF‐DALowButler et al. (1985)
AnimaliaSmallpoxButler5·7IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaSmallpoxDjibouti5·6IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaSmallpoxHarvey5·9IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaSmallpoxHarvey3·4EM‐LMHighDouglas et al. (1969)
AnimaliaSmallpoxMoloya5·6IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaSmallpoxSidi Amock5·9IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaSmallpoxTeheran5·6IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaSmallpoxVannes5·6IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaVacciniaChaumier5·0IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaVacciniaConnaught4·9IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaVacciniaLister5·1IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaVacciniaLister3·9EM‐LMHighDouglas et al. (1969)
AnimaliaVacciniaLister (egg)3·7EM‐LMHighDouglas et al. (1966)
AnimaliaVacciniaLister (rabit)3·0EM‐LMHighDouglas et al. (1966)
AnimaliaVacciniaRabbitpox (Utrecht)2·3EM‐LMHighDouglas et al. (1969)
AnimaliaVacciniaWR4·8EM‐LMLowTaylor and Bosmann (1981b)
AnimaliaWhite cowpoxBrighton2·8EM‐LMHighDouglas et al. (1969)
AnimaliaWhitepocks64.72.555·1IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaWhitepocks64.72.754·9IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaWhitepocksChimp 94·8IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaWhitepocksMK7.735·3IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaWhitepocksRZ.10.715·1IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
AnimaliaWhitepocksRZ.38.755·2IEF‐DALowMouillot and Netter (1977)
BacteriaAcholeplasma phage O1Acholeplasma phage O14·0??Pawlitschek et al. (1962)
BacteriaActinomycetes phage MSP8Actinomycetes phage MSP83·5IEF‐AHighKolstad and Bradley (1966)
BacteriaBacillus phage φ29Bacillus phage φ294·2Moving boundaryLowRubio et al. (1974)
BacteriaEnterobacteria phage BZ13Enterobacteria phage GA2·1, 2·3*EM‐LSHighLanglet et al. (2008b)
BacteriaEnterobacteria phage F1Enterobacteria phage SP2·1, 2·6*EM‐LSHighLanglet et al. (2008b)
BacteriaEnterobacteria phage MS2Enterobacteria phage f24·0IEF‐DALowButler et al. (1985)
BacteriaEnterobacteria phage MS2Enterobacteria phage MS23·9IEF‐A?Zerda and Gerba (1984)
BacteriaEnterobacteria phage MS2Enterobacteria phage MS23·5EM‐LSHighPenrod et al. (1995)
BacteriaEnterobacteria phage MS2Enterobacteria phage MS23·1, 3·9*EM‐LSHighLanglet et al. (2008b)
BacteriaEnterobacteria phage MS2Enterobacteria phage MS23·9Moving boundaryHighOverby et al. (1966)
BacteriaEnterobacteria phage MS2Enterobacteria phage MS23·9IEF‐DA?Nasser et al. (1992)
BacteriaEnterobacteria phage MS2Enterobacteria phage MS22·2, 3·3, 3·5*EM‐LSLowYuan et al. (2008)
BacteriaEnterobacteria phage PRD1Enterobacteria phage PR7223·8–4·2ChromatofocusingLowBrorson et al. (2008)
BacteriaEnterobacteria phage QβEnterobacteria phage Qβ2·7, 1·9*EM‐LSHighLanglet et al. (2008b)
BacteriaEnterobacteria phage QβEnterobacteria phage Qβ5·3Moving boundaryHighOverby et al. (1966)
BacteriaEnterobacteria phage T4Enterobacteria phage T24·2Aggregation?Sharp et al. (1946)
BacteriaEnterobacteria phage T4Enterobacteria phage T42·0EM‐LS?Aronino et al. (2009)
BacteriaEnterobacteria phage T4Enterobacteria phage T44·0–5·0IEF‐PALowChilds and Birnboim (1975)
BacteriaEnterobacteria phage λCI473·8EM‐LSHighPenrod et al. (1995)
BacteriaEnterobacteria phage μ2Enterobacteria phage μ24·0IEF‐PALowPiffaretti and Pitton (1976)
BacteriaEnterobacteria phage ϕX174Enterobacteria phage S137·0?HighAach (1963)
BacteriaEnterobacteria phage ϕX174Mutants7·4?HighAach (1963)
BacteriaEnterobacteria phage ϕX174Wild type6·6?HighAach (1963)
BacteriaEnterobacteria phage ϕX174Enterobacteria phage ϕX1746·0–7·0ChromatofocusingLowBrorson et al. (2008)
BacteriaEnterobacteria phage ϕX174Enterobacteria phage ϕX1742·6EM‐LS?Aronino et al. (2009)
BacteriaEnterobacteria phage ϕX174Enterobacteria phage ϕX1746·6CIEFLowHorkáet al. (2007)
BacteriaEnterobacteria phage ϕX174Enterobacteria phage ϕX1746·6AggregationHighSinsheimer (1959)
BacteriaPM 2PM 27·3IEF?Schaefer et al. (1974)
BacteriaPseudomonas phage PP7Pseudomonas phage PP74·3–4·9ChromatofocusingLowBrorson et al. (2008)
PlantaeBelladonna mottle virusBelladonna mottle virus6·3IEF‐ALowPetrzik (1993)
PlantaeCowpea chlorotic mottle virusCowpea chlorotic mottle virus3·8EM‐LSHighSuci et al. (2005)
PlantaeErysimum latent virusErysimum latent virus4·7IEF‐ALowPetrzik (1993)
PlantaeRed clover necrotic mosaic virusSerotype A5·0IEF‐ALowGallo and Musil (1984)
PlantaeRed clover necrotic mosaic virusSerotype B4·8IEF‐ALowGallo and Musil (1984)
PlantaeRed clover necrotic mosaic virusSerotype C4·6IEF‐ALowGallo and Musil (1984)
PlantaeScrophularia mottle virusAnagyris4·4IEF‐ALowHonetslegrova et al. (1994)
PlantaeScrophularia mottle virusCzech isolate3·9IEF‐ALowHonetslegrova et al. (1994)
PlantaeScrophularia mottle virusScrophularia mottle virus4·0IEF‐ALowPetrzik (1993)
PlantaeSouthern bean mosaic virusVariant 16·0IEF‐DAHighMagdoff‐Fairchild (1967)
PlantaeSouthern bean mosaic virusVariant 25·6IEF‐DAHighMagdoff‐Fairchild (1967)
PlantaeSouthern bean mosaic virusVariant 35·0IEF‐DAHighMagdoff‐Fairchild (1967)
PlantaeSouthern bean mosaic virusVariant 44·0IEF‐DAHighMagdoff‐Fairchild (1967)
PlantaeTobacco mosaic virusCucumber virus 44·9AggregationLowOster (1951)
PlantaeTobacco mosaic virusGreen aucuba4·5AggregationLowOster (1951)
PlantaeTobacco mosaic virusHolmes’ masked3·9AggregationLowOster (1951)
PlantaeTobacco mosaic virusHolmes’ rip‐gras4·5AggregationLowOster (1951)
PlantaeTobacco mosaic virusJ14D14·2AggregationLowOster (1951)
PlantaeTobacco mosaic virusOrdinary3·9AggregationLowOster (1951)
PlantaeTobacco mosaic virusYellow aucuba4·6AggregationLowOster (1951)
PlantaeTurnip yellow mosaic virusTurnip yellow mosaic virus3·6IEF‐ALowPetrzik (1993)

Isoelectric points of viruses – B. MichenT. GrauleFirst published: 09 July 2010 https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2010.04663.xCitations: 63 –

https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1365-2672.2010.04663.x

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AAV1~AAV10のpI計算

以下の文献には,表面構成タンパク質について個別にpIを算出されていますが,ウイルス粒子を構成する天然の状態でのpIは,表面に出ているアミノ酸の分布割合に依存します。そのため、正確なpIが算出されているとは考えにくと考えられます.やはり,実際にAEXなどのクロマト法などで検定されている結果の方が信頼できると思われます.

しかし,組換えAAVでは,以下の「AAV8, AAV9のpI」で示したようにEmpty/Fullの違いでpIが異なることが知られています.すなわち,GOIの配列によってもpIは異なると考えられます.単純計算ではいかないようですね.

Calculated pI values for AAV1 to AAV12.

https://www.researchgate.net/figure/Calculated-pI-values-for-AAV1-to-AAV12-The-histogram-of-the-pI-values-for-the-AAV_fig1_235682725

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AAV8, AAV9のpI

AAV8とAAV9のpIを分析カラムメーカーSCIEX社が報告しています.

  • AAV8 : 約pI9
  • AAV9 : pI7.1~7.6

Determination of Full, Partial and Empty Capsid Ratios

for Adeno-Associated Virus (AAV) Analysis

Tingting Li, Tie Gao, Hongxu Chen, Zuzana Demianova, Fang Wang, Mukesh Malik, Jane Luo,

Handy Yowanto, Sahana Mollah

SCIEX, Brea, CA

https://sciex.com/Documents/tech%20notes/2019/AAV-Full-Partial-Empty.pdf

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AAV tree

参考まで,AAV系統樹について示しておきます.pIの関連があるかも知れません.今後調査するかもです.

Expanded Repertoire of AAV Vector Serotypes Mediate Unique Patterns of Transduction in Mouse Brain

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616320755

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編集履歴

2020/11/04 Mr.Harikiri
2021/02/08 文言整備
2021/02/23 追記 (「はじめに」を追加し、工業化の課題について言及)

用語の解説、関連タグ付き投稿の抽出

iEP

pI

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