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気になる企業 – SIRION BIOTECH – ID12564 [2020/07/06]
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ID12564
SIRION BIOTECH GmbH
Office
- Planegg, Germany (HQ), 2005年設立，1-12月(financial year)
- Cambridge, MA, US
- Clichy, France
Finance
- 主たる収益 : サービスとライセンス
- 2019 : サービスとライセンス収入は，$11.2 m(約11.2億円/1~12月)
Viral Vector Service
- 包括的ウイルスベクターサービス
  - Lentivirus
  - Adenovirus
  - AAV
- Vector Materials (cGMP)
  - 1e15 vg of AAV
  - 1e10 infection units of Lentivirus
知的財産
- 10の臨床試験にSirionの技術が採用されている．そのうちの1つは2019年に市場承認を得ている
- LentiBOOST(TM)
Plasmid製造サービス
3つのOptimize
1. 転写
目的組織での効果的な発現に、Promoter, Enhamcerのデザイン
- Promoter
- Enhancer
2. 形質導入
Capsideのミューテーションなどの改変
- Capside
3. 抗原性
抗原性の低減化
- Immunogenecity
SIRION BIOTECH
Any gene to any cell
in vivo AAV, stable Lentivirus, transient Adenovirus
https://www.sirion-biotech.com
adenovirusベースのガンワクチン
SIRION社が持っているadenovirusをvectorに使ったがん治療薬の原理です。同社のライセスを使って開発しているがん治療薬の論文から。
- adenovirusベース
- 2種類のgeneをパック
  1. VLV (virus like vaccine): ERV (endogenous retrovirus)。ERVはヒトの内在性ウイルスでゲノムの8%を占めています。通常細胞では不活性状態ですが、いくつかのガンで検出されます。
  2. 目的タンパク質
- 免疫の賦活化対象をERVと目的タンパク質の両方に向ける戦略
Congratulations to partner InProTher on their published article discussing the potential of #adenovirus to target endogenous retroviruses (ERVs) and help fight diseases including #cancer. Our licensing agreement with InProTher includes coverage of SIRION’s adenovirus technologies to cancer #vaccines encoding ERV-derived antigens for active #immunotherapy. https://bit.ly/2Zn4d72 #viralvectors
```
Figure 2
Illustration of the immune responses elicited by adenovirus based virus-like-vaccine (VLV) vaccination encoding endogenous retroviral (ERV) genes. 
(1)
 Vaccination with the adenoviral vector (Ad) encoding GAG and ENV genes, ideally harbouring mutations in the immunosuppressive domain (ISD) of ENV, is injected.
(2)
 At the site of injection Ad directly infects professional antigen presenting cells (APCs) and releases the transgene into the recipient cell nucleus. (3)
 In the nucleus, the viral DNA codes for both viral and transgene proteins. Following their production, the fate of these proteins can be: 
(4)
 release of virus-like-particles (VLP)s to stimulate B-cells in an antigen structure dependent way; 
(5)
 uptake by APCs for endosomal degradation, presentation on major histocompatibility complex class II molecules (MHC-II), or 
(6)
 degradation in the proteasome (directly or after uptake) for presentation on major histocompatibility complex class I molecules (MHC-I) 
(7)
 stimulation of CD4⁺ T-cells and subsequent B-cell stimulation, and stimulation of CD8⁺ T-cells.
```
2920/03/25
2020年3月25日
気になる企業 – Oxgene™️ (Oxford Genetics LTD) – LentivirusのPCL/rAAV高生産できるHEK293細胞株/PCLの構築手順 – ID12556 [2020/11/22]
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Oxgene™️
- Headquarter : San Francisco (HQ), Ca United States source linke
- Oxgene™️は、Lentivirusに注力するOxford Genetics社の技術ブランドです。その中心的技術は、
- FaceBookの投稿から、以下の5領域が強みのようです。
  - / Our new packaging and producer cell lines for #scalable #lentiviral manufacture of new #celltherapies.
    (細胞治療としてLentiviralのスケーラブルなのPCL)
  - / An innovative new technology for scalable #AAV production that we hope will completely change the way #genetherapies are manufactured.
    (革新的なAAVのスケーラプルな製造技術)
  - / A mammalian display #antibodydiscovery platform that self-labels when antibodies bind to the target membrane protein
    (哺乳動物細胞による膜タンパク質に結合する抗体があれば自己標識する探索プラットフォーム)
  - / How we’ve adapted our #CRISPR engineering workflow to reliably edit #iPSCs
    (多機能幹細胞を編集する最適化されたCRISPRエンジニアリング・ワークフロー)
  - / How our proprietary in house laboratory information management system is keeping us on track, and keeping our partners informed, in real time.
    (社内の実験情報マネジメント・システムは、情報をリアルタイムに提供する)
- その他、AAV5を高産生するHEK293細胞株を、GMPでセルバンク化しています。この細胞株は、他の血清型のAAVやレンチウイルスでも高生産性が得られる。
- OXGENE has developed a novel CHO-based mammalian display antibody technology targeting membrane proteins.
Oxgene™️ by Oxford Genetics LTD
https://www.oxgene.com/
ショートヒストリー
A Short History of Gene Therapies – News MEDICAL LIFE SCIENCES –
https://www.news-medical.net/whitepaper/20200601/A-Short-History-of-Gene-Therapies.aspx
生産細胞株
Lentivirus
Lentivirus生産株として、GOI plasmidを除くCell Line (Packaging Cell Line)を持っている (Lenti packaging cell line) source
- 浮遊系細胞であるHEK293
- 目的遺伝子を導入したProducer Cell Lineの作成にも使用可能
- Develop and characterisation of cGMP-compliant stable packaging cell line for inducible lentiviral vector production PDF source link
- source link
Developing lentiviral packaging and producer cell lines
合計3のブラスミドを導入する。2つをトランスフェクションの時点でPackaging cell line,　最後のGOIを導入した時点でProducer cell lineという。
- Step 1 (Design and optimize)
  - VSV-G, Gag/Polのデザインと最適化
  - Plasmid取得
  - HEK293細胞へのトランスフェクション
- Step 2 (single cell sort)
  - 安定プール細胞をソーティング(50~60/96 well plates
  - 拡大培養とクローンのモニタリング (自動化装置)
- Step 3 (10クローン選択)
  - クローン選択
    growth kinetics
    VSV-G and Gag/Pol 導入
    誘導なしの拡大培養
    500~600クローンから40~50選択(トランスジーンを含む)
    10クローン選択 (lentiviral生産)
- Step 4 (Top clone選択)
  - 拡大培養
  - 培養のCharacterize and Optimize
  - lentiviral生産の条件
  - growth profile
  - VSV-G and Gag/Pol コピー数
  - 適する培地、トランスフェクションにおける細胞濃度、トランスフェクション試薬、添加剤
- Step 5 (final pre-packaging cell line取得)
  - 試験
    stability
  - further rounds of cell line development
  - Cell banking
- Step 6 (GOIデザインと最適化とpackaging cell lineへのトランスフェクション)
  - Rev (packaging cell lines), Gene of interest (GOI)のデザイン
  - Transfect to pre-packaging cell line)
  - 安定プール株の選択
- Step 7 (Single cell sort)
  - 20-30 clones to 96 well plates
  - expand
  - monitor clone growth
- Step 8 (スクリーニング to 300~400 clones)
  - growth kinetics
  - Rev and or GOI integration
  - lentiviral production
- Step 9 (Top 10 selection)
  - further expand
  - characterize
  - optimize growth
  - transfection/induction condition
  - growth profile
  - VSV-G
  - Gag/Pol
  - Rev and/or GOI copy number
  - Supplementation
  - if neccessary, goto step 6 as a allternative route to develop producer cell lines from lentiviral packaging cell lines
- Step 10
  - Select final packaging and producer cell line(s)
- Step 11 (process development)
  - optimize growth
    packaging cell line
    producer cell line
  - transfection conditions
    packaging cell line
    improve final titer
  - transfection-free
    producer cell line
Developing lentiviral packaging and producer cell lines, 2020/11
https://www.regmednet.com/infographics/developing-lentiviral-packaging-and-producer-cell-lines/?utm_campaign=RegMedNet&utm_content=146236346&utm_medium=social&utm_source=linkedin&hss_channel=lcp-11529313
CRISPER技術
CRISPR関連の技術を有する1)
- Cell line engineering
- CRISPR screening
- Cas9 engineering
AAVシステム
- 優れたAAVシステムを持っている
- HEK293細胞
  - AAV産生に最適なクローンの設定を完了している
- CHO細胞を用いている
- FUJIFILM Diosynth Biotechにライセンスを提供している
CRISPRとは、
- CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR associated proteins）
- DNA二本鎖の任意の位置を切断（Double Strand Breaks=DSBs）し、新たに遺伝子を挿入したり、遺伝子を置換・削除できる遺伝子改変技術。
- 2013年に報告されたCRISPR-Cas技術は、ZFN、TALENに続く第3世代のゲノム編集ツールである
- 標的遺伝子の変更、複数遺伝子のターゲットが容易
- 現在、哺乳類細胞ばかりではなく、細菌、寄生生物、ゼブラフィッシュ、など細胞や生物種において、そのゲノム編集利用されている。
- CRISPR-Cas9システムは、細菌や古細菌においてウイルスやプラスミドといった遺伝的要素の侵入物を標的し、排除するよう進化した適応免疫の一つ
1)
CRISPR – Libraries and screening
2)
CRISPR-Cas9の情報
DNA二本鎖を切断してゲノム配列の任意の場所を削除、置換、挿入することができる新しい遺伝子改変技術特集：CRISPR-Cas9 とは – コスモバイオ – より
https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/crispr-cas.asp?entry_id=14354
3)
FUJIFILM Diothynth Biotechnologies社との提携
Fujifilm Diothynth Biotechnologies (FDB)社はOxford Genetics社のOxgene独自のAAVシステム(遺伝子治療関連)のライセンスを受けており、FDBの製造サイトでは顧客に対してサービスを提供している
遺伝子治療の分野で、FUJIFILM Diothynth Biotechnologies社との戦略的パートナー契約を結んだ (2020/04) – OXGENEサイト – より
https://www.oxgene.com/News-and-Events/News/2020/04/FDB-partners-with-OXGENE
4) Celebrating 40 Years
Live and let live: the remarkable story of HEK293 cells in April’s Human Gene Therapy – Oxgene より
HEK細胞(E1遺伝子がインテグレートされている)でのみ増殖できるアデノウイルス(E1遺伝子を欠く)のグラハム(Graham, 1973~)の研究 – E1遺伝子は、E1遺伝子がHEK293細胞とE1遺伝子を欠いたアデノウイルスとに、完全に切り分けできていないため、重複する領域が存在する。そのことで、相同組換えが起こり、そのアデノウイルスは、E1を獲得して野生型となっていまう問題があるることがわかりました。1999年の臨床試験では10代の肝臓関連の患者が死亡しました。2016年には、アデノウイルスは、腫瘍溶解による癌治療として使用されています。遺伝子補充療法分野では、AAVとレンチウイルスベクターが使用されるようになりました。
現在の遺伝子補充療法分野での課題は、スケーラプルな製造方法です。現状では、遺伝子治療にはね200万ドル以上かかると試算されます。OXGENEでは、HEK293細胞を技術の中心にして、AAV5などを効率的的に生産できるように研究をしています。(1)メディア、(2)AAV作成が高いHEK293細胞のクローニング、(3)その他のAAVやレンチウイルスでも高い生産性を示しました。この細胞株をGMPによるセルバンクとすることができました。
https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/hum.2020.29116.oxg
5)
Achieving High-Yield Production of Functional AAV5 Gene Delivery Vectors via Fedbatch in an Insect Cell-One Baculovirus Sytstem (2019) – Methods & Clinical Development – より
https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/pdf/S2329-0501(19)30020-8.pdf
6)
Scalable Production of AAV Vectors in Orbitally Shaken HEK293 Cells (2018) – Methods & Clinical Development -より
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6305802/#!po=26.7045
7)
Manufacturing of viral vetors for gene therapy: part I. Upstream processing (2014) – Pharm. Bioprocess -より
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6305802/#!po=26.7045
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BIOLOGICS
気になる企業 – Oxgene™️ (Oxford Genetics LTD) – LentivirusのPCL/rAAV高生産できるHEK293細胞株/PCLの構築手順 – ID12556 [2020/11/22]
2020年3月25日
Post Views: 406 Oxgene™️ Oxgene™️ by Oxford Genetics LTD https://www.oxgene.com/ ショートヒストリー A Short History of …

BIOLOGICS
[ゲノム編集] デュアルAAVデリバリーシステムによるマウスのデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療研究 (CRISPR-Cas9を補助する) – ID9877 [2020/08/22]
2020年2月20日
ジュジェンヌ型筋ジストロフィーの治療薬の研究として、AAVを活用したゲノム編集型遺伝子治療研究の文献を概説し、既に市販されているアンチセンス核酸医薬品の作用機序などを示して、筋ジストロフィーという希少疾患を知る。

BIOLOGICS
[Bio-Edu] ゲノム編集/CRISPR-Cas9 [2023/10/20]
2019年10月6日
Post Views: 243 CRISPR CRISPRは，clustered regularly interspaced short palindromic repeatの略号です．京都大学より CRISPRとはC…
```
2020/03/25 はりきり(Mr)
2020/05/24 追記 (ウイルスを高生産するHEK293細胞株)
2020/09/16 追記 (5つの主たる強み)
2020/11/22 追記 (lentivirusのPLCの作り方)
```
2020年3月25日
気になる企業 – Brammer Bio社 – 開発段階から初期商用製造まで対応可能な豊富な経験を持つ遺伝子治療用の原薬 CDMO – ID11884 [2021/02/24]
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ThermoFisherグループ
ThermoFisherは、rAAVによる遺伝子治療に関するCDMOサービスを提供するために、Brammer Bioを買収しました。
遺伝子治療のためのAAVやその他のウイルス・ベクターについてUSPおよびDSPのプロセス開発を行えるCDMOです。CDMOとは、このような開発ノウハウを持ち、スケールアップ開発も可能で、臨床用のGMP製造も可能な委託製造会社です。Brammerは、数多くのプロジェクト実績を持っています。
現在の治療対象は、症例数が少ないオーファンが多いので、200L程度のバイオリアクターで製造されるのがほとんどでした。しかし、今後の開発競争においては、症例数が多く且つ、全身投与などの投与量が多い症例へとシフトしてくるものと予想されます。製造装置としても更に大きなスケールアップが可能性なCDMOが求められることになってくると考えられます。具体的には、スケールアップの製造ノウハウや実際に持っている大きなバイオリアクターが競争優位性の重要なファクターになるものと思われます。
2019/3にThermoFisherによるBrammer Bioの買収を17億ドルで合意
https://www.genengnews.com/news/thermo-fisher-to-acquire-brammer-bio-for-1-7b-expanding-gene-therapy-presence/
ThermoFisherが買収することで、AAVベクターを用いた遺伝子治療用医薬品の製造が、世界的に本格化していることが垣間見えます。抗体医薬品のCDMOであるLONZA BIOLOGICSもAAVベクターのCDMOとして自社の設備の整備を完了しており、世界のバイオロジクスは、抗体医薬から遺伝子治療医薬へ舵を切ったといえます。
- 前臨床プロセス開発
- プロセス最適化
- スケールアップ
- 分析
- 製剤化
- 保管サービス
- 規制サポート
- 施設は、FDA Code of Federal Regulations (Part 21)及びEuropean Advanced Therapy Medicinal Products’ regulationsに適合するウイルスベクター製造が可能
Brammer Bio
Brammer Bio
https://www.brammerbio.com
経験
- first-in-human trials : 100以上のプロジェクト
- Clinical lots AAV, ADV, RV, HSV, LV and T-cells : >150
- Team members : >350 ( over 20 years of experience)
拠点
- フロリダ州アラチュア　(本拠地)
- マルチプラットフォーム : 哺乳類/昆虫細胞の生産
- 50L ~ 2000L Bioreactor
- 安定性試験
- 製剤化、保管、流通 (商業供給)
編集履歴
```
2020/03/12 はりきり(‘Mr), ThermoFisherに買収されてからの調査
2021/02/24 追記 (Brammerの説明、遺伝子治療CDMOの説明)
```
2020年3月12日
気になる企業 – AVIGEN – Genezymeに買収 – △ID11266 [2020/03/03]
Post Views: 346
現在は、Avigen社は存在しない。
「気になる企業」シリーズ。バイオ医薬品に関わる企業の情報を取りまとめています。遺伝子治療薬の開発ベンチーであった「Avigen」社は、Genezymeに買収されており、現在は、存在していない。
Genzymeは、Sanofiと合併している
Sanofi Genezyme
https://www.sanofi.co.jp/ja/about-us/product/genzyme
Division of MediciNova Inc.
www.avigen.com : 今はもう無い
Avigen, Inc.’s Gene Therapy Technology Acquired By Genzyme Corporation
https://www.biospace.com/article/releases/avigen-inc-s-gene-therapy-technology-acquired-by-genzyme-corporation-/
```
編集履歴
2020/03/03 Mr.HARIKIRI
```
2020年3月3日
[ゲノム編集] デュアルAAVデリバリーシステムによるマウスのデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療研究 (CRISPR-Cas9を補助する) – ID9877 [2020/08/22]
Post Views: 332
はじめに
ゲノム編集には、ウイルスベクターが必要です。小型の動物実験には、Labレベルのウイルスベクターの製造能力でも対応が可能ですが、ヒトへの臨床応用には、一般の実験室規模では対応が難しくなります。
新しいモダリティであるウイルスベクターにも参入障壁となっています。研究者たちは、色々と試行錯誤して少ないウイルスベクターでも効率的なゲノム編集が可能な方法を模索しています。
概要
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、ジストロフィン遺伝子（DMD）に変異を持つ。これまでは、CRISPR-Cas9を介した「シングルカット」ゲノム編集を行い、DMD動物モデルの多様な遺伝子変異を修正してきた。
効率的にin vivoゲノム編集を行うには高用量のアデノ随伴ウイルス（AAV）が必要であるため、臨床に応用するには課題となっています。
この研究では、従来のAAV vectorに、補完するAAV vectorを用意してデュアルAAVシステムとしてデザインされています。
DMDマウスモデルでの検討
- Cas9ヌクレアーゼを一本鎖AAV（ssAAV）にパッケージ
- CRISPRシングルガイドRNAを自己相補的AAV（scAAV）にパッケージ
効率的なゲノム編集に必要なscAAVの用量は、ssAAVの場合よりも少なくとも20倍低かった。治療を受けたマウスは、ジストロフィン発現の回復と筋肉収縮性の改善を示した。これらの調査結果は、scAAVシステムを使用することで、CRISPR-Cas9を介したゲノム編集の効率を大幅に改善できることを示した。
Enhanced CRISPR-Cas9 correction of Duchenne muscular dystrophy in mice by a self-complementary AAV delivery system, 2020 – Science Advances –
https://advances.sciencemag.org/content/6/8/eaay6812.full
参考
デュジェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）の病態とビルテプソ®︎の作用機序 – 日本新薬 –
(1)5歳ごろに運動能力のピークを迎え、10最ごろに歩行困難となる。
(2)嚥下障害、排痰困難、消化管障害、呼吸筋や心筋障害と進み、呼吸不全、心不全で死に至る
(3)ジストロフィン遺伝子は、79個のエクソンを有する。スプライシングにより、mRNAは14kbと小さくなる。
(4)翻訳されたジストロフィン蛋白質のアミノ酸数は、3,685個、分子量は、427kDaと巨大分子である
(5)ジストロフィンは、細胞室内のアクチンと結合し、細胞膜の糖タンパク質(αジストログリカン; αDG)とジストロフィン-ジストロフィン関連糖タンパク質複合体を形成し、ラミニンα2を通じて細胞外マトリックスの基底膜と連結している。すなわち、ジストロフィンは、基底膜と筋細胞の細胞骨格を固定し、筋細胞同士を固く構造を維持するしている
(6)ジストロフィン-ジストロフィン関連糖タンパク質複合体の両端の構造は筋細胞の構造維持には必須である
(7)発症機序 : ジストロフィンの欠損により筋細胞構造が脆弱であるため、筋細胞構造の破壊と再生が繰り返す結果、患部は瘢痕化(脂肪化、線維化)する事で、筋細胞の再生がされにくくなっていく
(8)ジストロフィン遺伝子内にエクソンの欠失があり、その結果、塩基数が3の倍数でなくなる時、mRNAがアミノ酸へ翻訳できなくなるアウト・オブ・フレームが生じ、翻訳されるジストロフィンタンパク質は、縮小されるか欠損する
(9)ビルテプソ®︎は、ジストロフィン遺伝子のエクソン53を標的とするアンチセンス核酸医薬品で、エクソン53に結合してスプライシング時にエクソン53をスキップさせるてアウト・オブ・フレームをさせなくする
https://www.nippon-shinyaku.co.jp/viltepso/pathological/
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Duchenne muscular dystrophy：DMD）- JMDA ; 日本筋ジストロフィー協会
(1)X連鎖(性染色体のジストロフィン遺伝子の変異)の劣性遺伝であるため患者は男児に多い
(2)健常人では、筋細胞の細胞膜の構成成分の1つであるβジストログリカン(β-DG)の細胞質側に細長い縄状のジストロフィン蛋白質が結合している。ジストロフインの先端はアクチンフィラメント結合している。DMDでは、ジストロフィン蛋白質を欠損している
(3)突然変異での発症もある(1/3)
(4)稀に鎖染色体と常染色体の相互転座、Turner症候群があると女児にも発症
(5)女性で遺伝子の異常を持っている場合、稀にクレアチンキナーゼ(creatine kinase; CK)が高く、軽い筋力の低下がある
(6)DMDの発症率は、3,300人あたり1人、10万人あたり3-5人
(7)3~5歳頃から、転びやすく走れないなどの運動能力の低下が見られる
(8)治療は、ステロイド治療、予防はリハビリが有効
(9)AAVを使ったシストロフィン遺伝子治療への期待
https://www.jmda.or.jp/mddictsm/mddictsm2/mddictsm2-1/mddictsm2-1-1/
```
編集履歴
2020/02/20 はりきり(Mr)
2020/08/22 追記(アンチセンス医薬品(日本新薬)、日本筋ジストロフィー協会)
2021/10/31,記載整備
```
2020年2月20日
[rAAV-Material] AAVpro® Helper Free System – ID9843 [2020/02/19]
Post Views: 354
- ヘルパーウイルスを使用せずに、安全に血清型1、2、5、6のアデノ随伴ウイルスベクター（AAV1、AAV2、AAV5、AAV6ベクター）を作製
- 独自のAAVベクター抽出法で効率的かつ簡便な操作
- AAVベクターの大量作製に便利な高容量パッケージングプラスミドもラインナップ
- AAV2ベクターはhsa-miR-342搭載ベクターの使用により、高力価ウイルスが作製可能
- コントロールベクター（LacZ、Cre recombinase）やshRNA発現用ベクターも用意
- アデノ随伴ウイルスをドナーDNAとして用いたゲノム編集（ノックイン）にも使用可能（データ公開中）
研究用試薬である。生じたいかなる損害に対して責任を負わない。ライセンス締結は、治験開始前、上市前に締結。
AAV
AAVpro^® Helper Free System – TAKARA BIO –
http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100007791
2020年2月19日
[Bio-rAAV] AAVカプシド蛋白質VP1のpH依存的な構造変化 – エンドソーム脱出につながっているのか – ID8476 [2020/02/02]
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VP1の機能
カプシド蛋白質VP1の領域のうち、pH酸性(4-6)により内部にある部分が表出する、とのこと。
要約 (Goolge翻訳より)
感染に不可欠なカプシドの領域を特定するために、構造解析（X線結晶構造解析と低温EM）と変異原性および生化学的解析を組み合わせました。これは、新しいベクター生産戦略の開発と標的ベクターの約束を可能にする重要な情報につながりました。 X線結晶構造解析を使用して、キャプシドが酸性pHにさらされたときに構造変化を受けるAAVカプシドの領域を特定し、円二色性（CD）を使用して、マイナーカプシドウイルスタンパク質VP1（VP1u）のユニークな領域を示しました。
ホスホリパーゼA2（PLA2）機能を含む、同様の条件下で展開されます。
これらのpH（pH 4〜6）は、生産的なAAV感染に不可欠であることが示されており、キャプシドが細胞侵入および輸送中にエンドソーム区画で遭遇するものに匹敵します。
私たちの研究は、2つの予想外の新しい発見をもたらしました。
1つ目は、カプシドが未知の酵素活性を持っていることです。つまり、カプシドと外部基質の自己分解的切断を触媒できるpH感受性プロテアーゼです。プロテアーゼ活性のメカニズムとその機能の両方は不明であり、他のウイルスがコードするプロテアーゼと比較してユニークであるように見えます。
2つ目は、キャプシドのpH感受性領域の変異は、ウイルスDNAが核でコーティング解除された後でも遺伝子発現に大きな影響を与えることであり、核でのDNAコーティング解除後にキャプシドが遺伝子発現に役割を果たすことを示唆しています。
さらに、CDの研究は、通常キャプシド内部に埋もれているが、エンドソームの酸性コンパートメントを介して人身売買中に押し出されるVP1uの外部化のメカニズムを示唆しました。この提案では、（1）プロテアーゼの活性部位とその切断ターゲットを特定することにより、（2）核の脱コーティング後の遺伝子発現におけるpH感受性キャプシド領域の役割を決定することにより、これらの新しい発見を探索したいと考えています。（3）カプシド内の他の酵素活性であるVP1u関連PLA2に対するpHと陽イオンの影響を調べる。
エンドサイトーシスで細胞内に入ったAAVは、エンドソーム内で、中性pHからpH5へpHが低下して行くなか、VP1の構造変化が起きること、さらに酵素活性を持っていること。このことは、エンドソームからの脱出の可能性を示唆しています。
The role of pH and protease activity in AAV viral transduction
http://grantome.com/grant/NIH/R01-GM109524-01
エンドソーム脱出モデル
ドラッグでリバーリーとしてのナノキャリアが、エンドドームから脱出するモデルなどをまとめた論文
Carriers Break Barriers in Drug Delivery: Endocytosis and Endosomal Escape of Gene Delivery Vectors, 2019
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6639780/#!po=10.2941
2020年2月2日
[Bio-AAV] AAVカプシド蛋白質のpH依存的な分解性について-論文紹介 (2012) – ID8474 [2020/02/02]
Post Views: 363
要約 (Goolge翻訳より)
高度に精製されたアデノ随伴ウイルス（AAV）キャプシドのpH5.5でのインキュベーション試験では、いくつかのアミノ酸位置でのキャプシドタンパク質の有意な自己切断を誘導した。
pH 7.5では自己切断は見られなかった。他のAAV血清型の検査により、少なくとも2つの異なるpH誘導性切断パターンが示され、異なる血清型が代替プロテアーゼ切断部位を進化させたことを示唆している。
対照的に、AAV血清型と外部プロテアーゼ基質とのインキュベーションは、精製されたAAVキャプシド調製物が中性pHで強いプロテアーゼ活性を有するが、キャプシドタンパク質自己切断で見られるものとは反対にpH 5.5ではそうではないことを示した。
いくつかの証拠は、プロテアーゼ活性がAAVキャプシドに固有のものであり、タンパク質の混入によるものではないことを示唆しています。
対照ウイルス調製物は外部基質に対してプロテアーゼ活性を示さず、AAVウイルス調製物の濾液もキャプシドを汚染するプロテアーゼ活性を示さなかった。
さらに、N末端エドマンシーケンスは、AAV1とAAV9のユニークな自己切断部位を識別し、これらの部位に隣接するアミノ酸の突然変異誘発は切断を排除しました。
最後に、保存されたpH感受性構造領域にあるAAV2（E563A）のアミノ酸の変異は、外部基質上のプロテアーゼ活性を除去しましたが、自己切断には影響を与えなかったようだ。
まとめると、我々のデータは、AAVキャプシドがpH誘導に敏感な1つ以上のプロテアーゼ活性部位を持っていることを示唆した。
さらに、後期エンドソームに見られるpHに当たる酸性pHは、自己分解性プロテアーゼ活性を誘導するカプシドの構造変化を誘導すると思われる。 pH依存性プロテアーゼ活性は、ウイルス感染に役割を果たしている可能性がある。
Evidence for pH-Dependent Protease Activity in the Adeno-Associated Virus Capsid (2012)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3486322/
2020年2月2日
[rAAV] 製剤組成 – rAAV8の製剤組成 – 特許文献から – ID7881 [2020/01/23]
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- 優先権: US
- 公開特許公報(A) 2019-537578
- 公開日　2020/01/12
- 審査請求　未
- 予備審査請求　未
- 出願人 BAXALTA INCORPORATED
特許の流れ
- 液体及び凍結乾燥
- 5mM ~ 25mM L-Histidine, 0mM~150mM NaCl, 0.001%(w/v)~0.1%(w/v) Polysorvate 80, 1% ~ 10% (w/v) Sucrose and/or トレハロース　(Glycine or mannitol)
- AAVを含む医薬組成物
- 出血性疾患を治療する方法
- pH6.9~7.7 (7.0 ~ 7.5)
- PS80: Croda SuperRefined (商標)
- AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
- AAV8　(本名)
- 容器への吸着を防ぐ、分解凝集の抑制
- 凍結乾燥では、30mM~70mM Glycine (実施例のほとんどにGlycineが含まれる)
- Lypではね含水率0.2%以下(カールフィッシャー滴定法)
実施例
- 10mM L-Histidine, 20mM NaCl, 0.005% PS80, 5% トレハロース, 50mM Glycine → 凍結乾燥
- 10mM L-Histidine, 100mM NaCl, 0.005% PS80, 5% トレハロース, 50mM Glycine → 液体製剤
安定性が高い例(粒子サイズ別粒子数の変動が少ない)
- Buffer-1: Chatham buffer, 0.005% pS80(Osm 990)
- Buffer-2: 20mM Histidine, 70mM NaCl, 5% Sucrose, 0.005% PS80, pH7.5 (Osm 309)
- 5℃、-20℃, -60℃
- 製剤4の組成: 10mM L-Histidine, 100mM NaCl, 50mM Glycine, 5% Toreharose, 0.005% Croda super refined Tween80, pH7.0
分析
- SDS-PAGE
- WAX(弱陰イオン): 完全カプシド測定
- SEC
- in vitro生物活性
- in vivo生物活性
- FIX-qPCR (第9因子)
- rAAV8 ELISA
- 外観
- pH
- Polysorbate 80
AAV2は人のゲノムの染色体19q13.4中に組み込まれて潜伏するDNS Virus
rAAVの特徴:
- ウイルス複製に必要なRep遺伝子の除去
- 部位特異的組込みに必要な因子の除去
- 染色体外状態で存在する
- ゲノムDNAへの組み込み効率は非常に低い
先行文献
- Data and Berns, Clinical Microbiology Reviews, Pages 583-593 (2008)
2020年1月23日
[遺伝子治療] アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる遺伝子治療薬 – 学者の承認済み/間近/臨床試験中 – ID1124 [2020/07/17]
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AAVベクターによる遺伝子治療
2020/7現在、承認及び間近の品目
- Zolgensma (骨髄性筋萎縮症; Spinal Muscular Atrophy; SMA), Novartis-AveXis
- Valrox (血友病A; Hemophilia A), BioMarin
  - 昆虫細胞を使用
2020/6現在、臨床中
- SPK-8011 (血友病A; Hemophilia A), Roche-Spark
- SB-525 (血友病A; Hemophilia A), Pfizer-Sangamo Therapeutics連携 (2017/05~)^sourceしていたが、現在は、Pfizerに引き継がれている^source
  - 昆虫細胞を使用
- AMT-061, UniQure(血友病B; Hemophilia B)
  - 昆虫細胞を使用
2003年の文献。
http://jsv.umin.jp/journal/v53-2pdf/virus53-2_163-170.pdf
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編集履歴
2020/01/22 Mr.HARIKIRI
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2020年1月22日