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気になる企業 – Oxgene (Oxford Genetics LTD) – LentivirusのPCL/rAAV高生産できるHEK293細胞株/PCLの構築手順 – ID12556 [2020/11/22]

気になる企業 – Oxgene (Oxford Genetics LTD) – LentivirusのPCL/rAAV高生産できるHEK293細胞株/PCLの構築手順 – ID12556 [2020/11/22]
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Oxgene

  • Headquarter : San Francisco (HQ), Ca United States source linke
  • Oxgeneは、Lentivirusに注力するOxford Genetics社の技術ブランドです。その中心的技術は、
  • FaceBookの投稿から、以下の5領域が強みのようです。
    • / Our new packaging and producer cell lines for #scalable #lentiviral manufacture of new #celltherapies.
      (細胞治療としてLentiviralのスケーラブルなのPCL)
    • / An innovative new technology for scalable #AAV production that we hope will completely change the way #genetherapies are manufactured.
      (革新的なAAVのスケーラプルな製造技術)
    • / A mammalian display #antibodydiscovery platform that self-labels when antibodies bind to the target membrane protein
      (哺乳動物細胞による膜タンパク質に結合する抗体があれば自己標識する探索プラットフォーム)
    • / How we’ve adapted our #CRISPR engineering workflow to reliably edit #iPSCs
      (多機能幹細胞を編集する最適化されたCRISPRエンジニアリング・ワークフロー)
    • / How our proprietary in house laboratory information management system is keeping us on track, and keeping our partners informed, in real time.
      (社内の実験情報マネジメント・システムは、情報をリアルタイムに提供する)
  • その他、AAV5を高産生するHEK293細胞株を、GMPでセルバンク化しています。この細胞株は、他の血清型のAAVやレンチウイルスでも高生産性が得られる。
  • OXGENE has developed a novel CHO-based mammalian display antibody technology targeting membrane proteins. 

Oxgene by Oxford Genetics LTD

https://www.oxgene.com/

ショートヒストリー

A Short History of Gene Therapies – News MEDICAL LIFE SCIENCES –

https://www.news-medical.net/whitepaper/20200601/A-Short-History-of-Gene-Therapies.aspx

生産細胞株

Lentivirus

Lentivirus生産株として、GOI plasmidを除くCell Line (Packaging Cell Line)を持っている (Lenti packaging cell line) source

  • 浮遊系細胞であるHEK293
  • 目的遺伝子を導入したProducer Cell Lineの作成にも使用可能
  • Develop and characterisation of cGMP-compliant stable packaging cell line for inducible lentiviral vector production PDF source link
  • source link

Developing lentiviral packaging and producer cell lines

合計3のブラスミドを導入する。2つをトランスフェクションの時点でPackaging cell line, 最後のGOIを導入した時点でProducer cell lineという。

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  • Step 1 (Design and optimize)
    • VSV-G, Gag/Polのデザインと最適化
    • Plasmid取得
    • HEK293細胞へのトランスフェクション
  • Step 2 (single cell sort)
    • 安定プール細胞をソーティング(50~60/96 well plates
    • 拡大培養とクローンのモニタリング (自動化装置)
  • Step 3 (10クローン選択)
    • クローン選択
      • growth kinetics
      • VSV-G and Gag/Pol 導入
      • 誘導なしの拡大培養
      • 500~600クローンから40~50選択(トランスジーンを含む)
      • 10クローン選択 (lentiviral生産)
  • Step 4 (Top clone選択)
    • 拡大培養
    • 培養のCharacterize and Optimize
    • lentiviral生産の条件
    • growth profile
    • VSV-G and Gag/Pol コピー数
    • 適する培地、トランスフェクションにおける細胞濃度、トランスフェクション試薬、添加剤
  • Step 5 (final pre-packaging cell line取得)
    • 試験
      • stability
    • further rounds of cell line development
    • Cell banking
  • Step 6 (GOIデザインと最適化とpackaging cell lineへのトランスフェクション)
    • Rev (packaging cell lines), Gene of interest (GOI)のデザイン
    • Transfect to pre-packaging cell line)
    • 安定プール株の選択
  • Step 7 (Single cell sort)
    • 20-30 clones to 96 well plates
    • expand
    • monitor clone growth
  • Step 8 (スクリーニング to 300~400 clones)
    • growth kinetics
    • Rev and or GOI integration
    • lentiviral production
  • Step 9 (Top 10 selection)
    • further expand
    • characterize
    • optimize growth
    • transfection/induction condition
    • growth profile
    • VSV-G
    • Gag/Pol
    • Rev and/or GOI copy number
    • Supplementation
    • if neccessary, goto step 6 as a allternative route to develop producer cell lines from lentiviral packaging cell lines
  • Step 10
    • Select final packaging and producer cell line(s)
  • Step 11 (process development)
    • optimize growth
      • packaging cell line
      • producer cell line
    • transfection conditions
      • packaging cell line
      • improve final titer
    • transfection-free
      • producer cell line

Developing lentiviral packaging and producer cell lines, 2020/11

https://www.regmednet.com/infographics/developing-lentiviral-packaging-and-producer-cell-lines/?utm_campaign=RegMedNet&utm_content=146236346&utm_medium=social&utm_source=linkedin&hss_channel=lcp-11529313
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CRISPER技術

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CRISPR関連の技術を有する1)

  • Cell line engineering
  • CRISPR screening
  • Cas9 engineering

AAVシステム

  • 優れたAAVシステムを持っている
  • HEK293細胞
    • AAV産生 に最適なクローンの設定を完了している
  • CHO細胞を用いている
  • FUJIFILM Diosynth Biotechにライセンスを提供している
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CRISPRとは、

  • CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR associated proteins)
  • DNA二本鎖の任意の位置を切断(Double Strand Breaks=DSBs)し、新たに遺伝子を挿入したり、遺伝子を置換・削除できる遺伝子改変技術。
  • 2013年に報告されたCRISPR-Cas技術は、ZFN、TALENに続く第3世代のゲノム編集ツールである
  • 標的遺伝子の変更、複数遺伝子のターゲットが容易
  • 現在、哺乳類細胞ばかりではなく、細菌、寄生生物、ゼブラフィッシュ、など細胞や生物種において、そのゲノム編集利用されている。
  • CRISPR-Cas9システムは、細菌や古細菌においてウイルスやプラスミドといった遺伝的要素の侵入物を標的し、排除するよう進化した適応免疫の一つ
1)

CRISPR – Libraries and screening

2)

CRISPR-Cas9の情報

DNA二本鎖を切断してゲノム配列の任意の場所を削除、置換、挿入することができる新しい遺伝子改変技術特集:CRISPR-Cas9 とは – コスモバイオ – より

https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/crispr-cas.asp?entry_id=14354
3)

FUJIFILM Diothynth Biotechnologies社との提携

Fujifilm Diothynth Biotechnologies (FDB)社はOxford Genetics社のOxgene独自のAAVシステム(遺伝子治療関連)のライセンスを受けており、FDBの製造サイトでは顧客に対してサービスを提供している

遺伝子治療の分野で、FUJIFILM Diothynth Biotechnologies社との戦略的パートナー契約を結んだ (2020/04) – OXGENEサイト – より

https://www.oxgene.com/News-and-Events/News/2020/04/FDB-partners-with-OXGENE
4) Celebrating 40 Years

Live and let live: the remarkable story of HEK293 cells in April’s Human Gene Therapy – Oxgene より

HEK細胞(E1遺伝子がインテグレートされている)でのみ増殖できるアデノウイルス(E1遺伝子を欠く)のグラハム(Graham, 1973~)の研究 – E1遺伝子は、E1遺伝子がHEK293細胞とE1遺伝子を欠いたアデノウイルスとに、完全に切り分けできていないため、重複する領域が存在する。そのことで、相同組換えが起こり、そのアデノウイルスは、E1を獲得して野生型となっていまう問題があるることがわかりました。1999年の臨床試験では10代の肝臓関連の患者が死亡しました。2016年には、アデノウイルスは、腫瘍溶解による癌治療として使用されています。遺伝子補充療法分野では、AAVとレンチウイルスベクターが使用されるようになりました。
現在の遺伝子補充療法分野での課題は、スケーラプルな製造方法です。現状では、遺伝子治療にはね200万ドル以上かかると試算されます。OXGENEでは、HEK293細胞を技術の中心にして、AAV5などを効率的的に生産できるように研究をしています。(1)メディア、(2)AAV作成が高いHEK293細胞のクローニング、(3)その他のAAVやレンチウイルスでも高い生産性を示しました。この細胞株をGMPによるセルバンクとすることができました。

https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/hum.2020.29116.oxg
5)

Achieving High-Yield Production of Functional AAV5 Gene Delivery Vectors via Fedbatch in an Insect Cell-One Baculovirus Sytstem (2019) – Methods & Clinical Development – より

https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/pdf/S2329-0501(19)30020-8.pdf
6)

Scalable Production of AAV Vectors in Orbitally Shaken HEK293 Cells (2018) – Methods & Clinical Development -より

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6305802/#!po=26.7045
7)

Manufacturing of viral vetors for gene therapy: part I. Upstream processing (2014) – Pharm. Bioprocess -より

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6305802/#!po=26.7045

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編集履歴
2020/03/25 はりきり(Mr)
2020/05/24 追記 (ウイルスを高生産するHEK293細胞株)
2020/09/16 追記 (5つの主たる強み)
2020/11/22 追記 (lentivirusのPLCの作り方)
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