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  • [Bio-Edu] Plasmid – バイオロジクスには欠かせない遺伝子組換え技術、そして rAAVを作るまで! – AAV Vector配列の例 [2020/08/05]

    [Bio-Edu] Plasmid – バイオロジクスには欠かせない遺伝子組換え技術、そして rAAVを作るまで! – AAV Vector配列の例 [2020/08/05]

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    はじめに

    rAAV: recombinant Adeno Associated Virus による遺伝子治療薬の開発には、遺伝子組換え技術が使われている為、この知識がなくてはならい。

    rAAVを作るには、これまでのタンパク質を作ることとは、何倍も複雑かつ多数の手間が掛かっている。

    遺伝子組換え技術からrAAVを作るまでの基礎知識を解説する。

    編集履歴
2020/04/07 はりきり(Mr) まずは、遺伝子組換え技術
2020/06/21 追記(rAAV作成に必要なベクター製品)
2020/08/04 追記(必要なPlasmidとその機能)

    まずは、遺伝子組換え技術

    1)　遺伝子工学の技術

    遺伝子工学の技術 – 福岡大学 –

    http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/genetech.htm

    以下の用語は、同義である。

    • 遺伝子工学 (gene technology, genetic engineering)
    • 遺伝子操作 (gene manipulation)
    • 遺伝子組換え技術 (recombinant DNA technique)

    これら技術は、1970年代に発見された以下の要素で構成されている

    • 制限酵素 (遺伝子の特定部位を切断する酵素)
    • 逆転写酵素 (DNAからmRNAが作られるが、逆に、mRNAからDNA(cDNA)を作る(転写する)酵素
    • リガーゼ (別々のDNA断片にそれぞれ、認識特異配列を認識してDNAを繋ぐ酵素)

    ベクター

    有用と考えた遺伝子配列を細胞に組込む場合、先ず、ベクターという器にその遺伝子配列を載せなければならない。ベクターには、以下のものがある。

    • ファージ
    • ウイルス
    • プラスミド (Plasmid) : 多くのバクテリアの核外の遺伝子で、組換技術用にデザイン・改変された鋳型となるPlasmidが市販されている)
    • コスミド
    • 酵母人工染色体

    大腸菌とPlasmid

    • 大腸菌(E.coli)は、2μmのソーセージの形をしていて、至適な環境では25分で2倍に分裂増殖する。4μmに成長すると中央がくびれて2個になる。菌の中央に位置する染色体DNAは、4000個の遺伝子をコードしており2本鎖で環状である
    • 多くの大腸菌株には、染色体DNA以外に小さい環状の2本鎖DNAを持ち、これをPlasmidといいい、染色体DNAと同様に分裂増殖する際に複製される
    • Plasmidの種類として大きく分けてR (resistant)-Plasmid, F (fertility)-Plasmid (雄株が持つ)がある。
      • Rプラスミド: 薬剤耐性の遺伝子を含む
      • Fプラスミド: 雌株に接合してFプラスミドを伝達する機能
    • 雄の大腸菌は、雌の大腸菌の細胞内に自分のPlasmidを挿入する過程で自分の染色体DNAを伝達することがあり、遺伝子の交雑が起こる
    • 以上の現象などから、遺伝子組換え技術が考案され、大腸菌間の遺伝子組換えを人為的に行える技術が確立されできた。
      • 自然界にPlasmidが存在する
      • そのPlasmidの機能を利用するのが、遺伝子組換え技術

    制限酵素

    遺伝子組換え技術における「ハサミ」である。ThermoFisherには概説。制限酵素の一覧は、TaKaRaを参照

    • それぞれ種々の配列を認識して切断する多数の制限酵素が知られている
    • EcoRI (図1参照)は、GAATTCと相補的(CTTAAG)に結合しているDNAを選択的に、「のり代」のある形に切断する
      • G-AATTC (CTTAA-G) : ‘-‘で切断
    2)　大腸菌と組み換えDNA技術

    大腸菌と組み換えDNA技術

    京都 WEB マガジン 現代アートとサイエンス No.11

    https://plasmid.med.harvard.edu/PlasmidRepository/file/map/pAAV-MCS.pdf

    DNAリガーゼ (ligase)

    遺伝子組換え技術における「のり;糊」であるsource

    • Plasmid (環状DNA)の一部の領域に制限酵素により「のりしろ」付き状態にしたところに、目的遺伝子(同様に「のりしろ」状態)を結合させて、環状DNA(Plasmind)にする酵素
    • DNAの末端同士をリン酸ジエステル結合させる

    大腸菌にタンパク質を作らせる

    • 最も初期の遺伝子組換え技術の応用例として、糖尿病治療薬のインスリン、ウイルス抑制因子のインターフェロンの大腸菌による生産がある
    • 天然のPlasmidを鋳型として、適切な位置にインスリンやインターフェロンをコードした遺伝子配列を挿入し、デザインしたPlasmidを作る
      • まず、

    Competent Cell

    Competent Cellとは、Plasmidを細胞内に導入しやすいようにダメージ処理が施され安定保存された細胞のことsource、wikipedia

    • カルシウムイオン存在下で冷却処理(膜透過性の増大)
    • 凍結保存(-80℃以下)

    製品

    XL-Blue Competent Cells(Agilent)

    • XL2-Blue UltraCompetent Cells
    • XL1-Blue SuperCompetent Cells
    • XL1-Blue Electroporation-Competent Cells
    • XL1-Blue Competent Cells
    • XL-2-Blue Subcloning Grade Competent Cells

    特徴

    • プラスミドベクター/ラムダファージベクターの両ベクターの増幅に両できる菌株
    • 表現系: EndA(-)
    • Plasmid DNAの増幅/回収に適したCompetent Cell
    • Blue/White スクリーニング、ファージミドDNAのsingle-strandレスキューが可能
    • F7エピソームは、抗生物質耐性
    • XL1-Blue : エレクトロポレーション・コンピテント・セル(>=1e9)
      • 遺伝子型: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’proAB lacIqZ△M15 Tn10 (Tetr)]
    • XL2-Blue : ウルトラコンピテント・セル(>=5e9)
      • 遺伝子型: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’proAB lacIqZ△M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]a
    • カルタヘナ対応が必要

    rAAVを作る

    必要なPlasmidとその機能

    ベクタープラスミドとヘルパープラスミドには、共通する塩基配列があると、相同性組換えによって野生型のウイルスの出現の可能性が高まるため、共通配列が存在しないようにデザインする。

    • ベクタープラスミド (Vector Plasmid)
      • 目的は、目的遺伝子の挿入
      • 両端のITRのみを残し、目的遺伝子を挿入
    • Rep/Cap プラスミド (Rep/Cap Plasmid)
      • 目的は、DNA複製タンパク質とカプシドタンパク質をコードする遺伝子の挿入
    • ヘルパープラスミド (Helper Plasmid)
      • 目的は、AAVの増殖に必要なadenovirus由来遺伝子の挿入　(宿主のHEK293には、更に必要となるE1A, E1Bを持っているため、これらは必要ない)
      • E2A, VA, E4 or f6
    3) AAVを利用した遺伝子治療

    4. AAVを利用した遺伝子治療 – ウイルス　第57巻　第1号 pp.47-56, 2007 –

    http://jsv.umin.jp/journal/v57-1pdf/virus57-1_047-056.pdf

    Vector製品

    Vectorは、Plasmid構造になっています。「運び屋」の別名を特に付けている訳です。

    Agilent社のベクター製品

    recombinant AAVを生産させるための材料として、どのようなものが必要なのか理解することができる。

    (1)目的遺伝子ベクター、(2)rep/capベクター、および(3)Helperベクター、の3つのベクターを、感染性AAV粒子を作るために必要な補間遺伝子をコードするHEK293細胞に同時感染させ、感染性recombinant AAV (rAAV)を作成するための製品群。

    • pCMV-MCSベクター
      • 4.5kb
      • クローニング・ベクター
      • マルチクローニングサイトに目的遺伝子をクローニング → 「pAAV-CMV-MCSベクター」作成
        • 同時トランスフェクション
      • pAAV-MCS、pAAV-LacZへサブクローニグ可能
    • pAAV-LacZベクター
      • 7.3kb
      • クローニング・ベクター/コトロール・ベクター
      • LacZはレポーター
      • pAAV-MCSを作るため自立複製能を持たないAAVベクター
      • Not IでLacZカセットの切り出し、pCMV-MCSベクターから取り出した目的遺伝子カセットクローニングできる →「pAAV-MCSベクター」作成
        • 同時トランスフェクション
    • pAAV-RCベクター
      • 感染性があるrAAV2粒子を作るのに必要
      • rep/cap遺伝子 (DNA複製タンパク質/カブシドタンパク質)
      • 同時トランスフェクション
    • pHelperベクター
      • rAAV2発現用
      • AAV-293細胞との組み合わせで機能する
      • Adenovirus由来遺伝子(E2A, E4, VA RNAs)
      • AAVのlytic phaseの誘発
      • 同時トランスフェクション
    • AAV-293細胞
      • Adenovirus由来の遺伝子をコード(E1A, E1B)
      • トランスフェクション用細胞
    • AAV-HT1080細胞
      • ウイルスのタイター測定用細胞
    4) AAV Helper-Free System

    AAV Helper-Free System

    Agilent (ストラタジーン)

    https://www.chem-agilent.com/contents.php?id=300079

    AAV Vector

    Example

    図1. pAAV-MCS ベクター
    TypeNameDescriptionStart PositionEnd Position
    viral LTRITRAAV inverted terminal repeat00
    promoterCMVpCMV promoter for mammalian expression00
    gene fragmentbgexIIbeta-globin exon II fragment00
    gene fragmentbhIVSIIbgIVSII fragment00
    MCSMCSMCS (EcoRI, NotI, BamHI, SalI, XhoI, BlgII)00
    gene fragmentbgexIIIbgexIII fragment00
    viral LTRITRAAV inverted terminal repeat00
    ssDNA originF1 oriF1 origin for ssDNA production00
    selectable markerampRampicillin resistance gene00
    bacterial originColE1ColE1-type bacterial origin00
    https://plasmid.med.harvard.edu/PLASMID/GetVectorDetail.do?vectorid=221
    5) AAV – wikipedia

    AAV – wikipedia

    https://ja.wikipedia.org/wiki/アデノ随伴ウイルス
  • [用語] CPP ; Critical Process Parameter ; 重要工程パラメータ

    [用語] CPP ; Critical Process Parameter ; 重要工程パラメータ

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    CPP ; Critical Process Parameter; 重要工程パラメータ, 製造関連用語

  • [用語] QbD ; quality by design

    [用語] QbD ; quality by design

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    QbD ; Quality by Design ; クオリティ・バイ・デザイン

    • 医薬品開発に使われる手法の1つである
    • ICH Q8には，製品品質を設計段階から達成しようとする考え方としてQbDが定義されている．
    • QbDを達成する手法の1つとしてDesinge Space (DSp)がある．
    • DSpは品質確報が立証されている入力変数と工程パラメータの多次元な組み合わせ，として表される．
    • 具体的には，DSpは入力変数であるPPとその結果得られる結果として製品のCQAの関係性から求められる．
    • 製品、工程の理解、および工程管理に重点を置いた、実験によって立証された科学及び品質リスクマネジメント基づく体系的な開発手法
    • 設計した機能を有する最終製品が、純度と有効性の両方の面から計画値を確実に満たす製造方法及び分析方法を開発する
    • ある製造条件で製造され、その結果は分析手法により品質を評価される。ようにするためのものです。 このためには明確な目的と正しいリスク管理が必要です。この条件と結果の因果関係の十分な理解が必要です。
    • この手法の開発によって、消費者、及びメーカーにとって、それぞれ製品に一貫した安全性と有効性の実現、及び品質とコストが十分に管理されるため、両方にメリットをもたらす。 

    QbD : Quality by Design

    DSp : Design Space

    PP: Process Parameter (処理温度，pH, conductivity,など)

    CQA : Critical Quality Attributes (製品力価，歩留まり，不純物含有量など)

    PMDA

    https://www.pmda.go.jp/files/000222953.pdf

    医薬品研究開発におけるQuality by Design（QbD）とは？ – Mettler Toledo

    https://www.mt.com/jp/ja/home/applications/L1_AutoChem_Applications/L2_PAT/quality-by-design.html

    編集履歴

    2022/01/09, Mr.HARIKIRI

  • [Bio-Edu] CHO細胞培養プロセス – スケールアップ – 温度シフトの検討は欠かせない [2020/10/30]

    [Bio-Edu] CHO細胞培養プロセス – スケールアップ – 温度シフトの検討は欠かせない [2020/10/30]

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    はじめに

    培養規模をスケールアップする目的は、コンスト低減化、需要対応などが上げられます。スケールアップした結果、生産性や品質を維持できない場合があります。それは技術移管が失敗したか、そもそもロバストネスな培養条件ではなかった可能性があります。

    この記事では、スケールアップする場合の技術移管の考慮点を解説し、パラメータとして生産性や品質にどのように関わっているかも一部示したいと思います。

    培養のスケールアップ

    バイオロジクスの製造では、商用化に備えてコマーシャル製造に対応した製造所での製造を行うことになります。そうすると、開発サイトからコマーシャルサイトへの技術移管のプロスセか発生します。

    大半の場合、その技術移管には、コマーシャルでの需要が増えることを見越してスケールアップが伴うことがほとんどです。

    今回、Sartoriusの発表を解説します。プロス開発(15mL培養スケール)から生産規模(2000Lスケール)までの培養スケーラビリティの確保は、Sartoriusが開発したscale-convert toollを使うコトで容易であるとのことです。

    基本的な制御パラメータは、以下の投稿をご参照ください。

    [Bio-Culture] CHO細胞の培養における制御パラメータ、添加物及び装置・設備の事例 – ID6721[2020/09/08] ID6721

    目的

    スケールアップの目的は、実製造スケールまでのスケーラビリティを確認する事です。その後、コマーシャルでのスケールアップもあるかも知れませんが、スケールアウトの手法を取ることもあります。スケールアウトとは、例えば、2,000Lでのスケールアップが確認できているとして、その2,000Lでの実製造をマルチに実施する手法です。

    スケールアップの結果、以下のことは、最低限必要な事項です。

    • 設計品質 (QbD)の維持
      • 品質が変わらないこと
    • Key Performance Indicator (KPI)とCritical Process parameter (CPP)に悪影響を与えない

    考慮事項

    インプット因子

    • 製造所の違い (Location) : 培養における外部環境的な影響
    • スケールの違い (Scale up) : スケーラビリティに影響
    • Bioreactorのデザイン (geometry and design) : スケーラビリティに影響
    • 攪拌方法(agitation, impeller type) : 細胞の生育
    • ガス供給方法(gassing and sparging) : 細胞の生育
    • 温度/pH : グリカン・プロファイル(CQA)に影響
      • プロダンション培養において、途中37℃の培養温度をそれより低い温度(37℃/pH7.0→31℃/pH7.0)にシフトさせることで、mAbの生産性を高めることができる。その場合、pH6.8では生産性の改善効果はあまり見られず、pH7.0で著名な改善が見られたref 2)
    • 重要品質特性(Critical Quality Attribute; CQA)

    温度シフト

    組換え大腸菌において、温度シフトして低温にすることは、目的産物の増量が可能であることが知られており、一般的に採用されている。

    動物細胞においても、培養の途中で低温にすることで目的産物の増量が見られる。その原理については、多数の文献からある程度の理解が進んでいる3)

    • 哺乳類細胞における生理学的温度以下でのmRNA翻訳とタンパク質合成が増加する
    • 生理学的温度でない場合、細胞全体的におけるタンパク質合成速度が低下するように考えられるが、コールドショック時に、グローバルなmRNAの翻訳と代謝が減少し、代謝負荷の減少と、mRNAの安定性の増加/分解の減少が相まって、組換えタンパク質のmRNA量が増加する
    • まとめると、タンパク質合成自体は減少しますが、翻訳およびタンパク質の折り畳み/分泌機構に関して、組換えmRNAと内因性mRNAとの競合が少なくなる。したがって組換えタンパク質の収量が向上します。
    • ただし、哺乳類細胞からの組換えタンパク質収量の潜在的な増加を支えるメカニズムは、以下で説明するように、これよりもはるかに複雑です。
    • 開始因子eIF2αのリン酸化を介したmRNA翻訳とタンパク質合成の全体的な減少に加えて、哺乳類細胞のコールドショックはストレス顆粒（SG）と呼ばれる細胞質構造の形成につながると報告されている。
    • 最近のデータでは、AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）の活性化によってタンパク質合成も並行して弱められ、ミトコンドリア機能障害の結果としてmTORシグナル伝達が阻害されることを示唆している。
    • さらに、マイクロRNA（miR）の発現は、生理学的温度に移行するとCHO細胞でも調節されるが、これらの小さな非コードRNAは、主にターゲットmRNAの3′-UTRに結合することにより、特定のmRNAターゲットの翻訳の負の調節因子として機能する。 このようなmiRの人工的な操作は、CHO細胞に機能的な効果をもたらす。
    • 特に、内因性miR-7の発現は、37°C​​で維持された細胞と比較して、培養で経時的に低温にシフトしたCHO細胞で大幅に減少することが示されていますが、miR-7が37°Cで一時的に過剰発現した場合 これにより、細胞増殖が効果的にブロックされたが、miR-7量の阻害は細胞増殖に影響を与えなかった。 しかし、37°C​​でのmiR-7の過剰発現は、細胞特異的な生産性の増加をもたらす。
    • miR-7を過剰発現するCHO細胞のプロテオームに関するその後の研究では、miR-7の過剰発現により93個のタンパク質の発現が減少し、74個のタンパク質の発現が増加することが示された。 翻訳制御、RNAおよびDNAプロセシングに関与するタンパク質は、発現が減少したタンパク質に富んでおり、タンパク質の折り畳みおよび分泌に関与するタンパク質は、上方制御されたカテゴリーに富んでいた。
    • グローバルな内因性タンパク質合成は哺乳類細胞の生理学的温度以下で減少するが、特定のタンパク質の合成はアップレギュレートされると報告されている。おそらくこれらはコールドショックに対する細胞応答と生存に必要または不可欠なタンパク質です。
    • 伝えられるところによると、2つの哺乳類の低温誘導CSP、Rbm3（RNA結合モチーフタンパク質3）とCIRBP（低温誘導性RNA結合タンパク質）があり、これらは細菌のCSPと配列相同性がありません。生理学的温度以下で哺乳類細胞で発現が変化する20以上の追加の遺伝子とタンパク質を説明する報告がある。
    • 低温ショックによって誘発されるタンパク質のアップレギュレーションを定義する際には注意が必要です。タンパク質分解は生理学的温度以下でも低下するため、タンパク質発現の増加ではなく、代謝回転の低下によりタンパク質量が明らかに増加する可能性もあります。
    • これら2つの効果（タンパク質合成の増加と存在量の増加）の寄与は、新生ポリペプチド鎖の代謝放射性標識によって研究があり、それによると、新たに合成された材料と総タンパク質溶解物の標準タンパク質分析を決定できることを利用して、37°C​​と32°Cで合成されるタンパク質の範囲はほぼ同じであることがわかったが、32°Cでは37°Cと比較して全体的なタンパク質合成が減少するが、発現するポリペプチドは、いくつかある場合を除きます。 増加しているものもある。

    温度を低くすることで、以下の具体的な影響が考えられる 3)。

    • CHO cell phenotype : Response upon subphysiological temperature culturing
    • Cell proliferation : ↓
    • Biomass accumulation : ↓
    • Cell viability : 延びる
    • Apoptosis : ↓
    • Culture duration : 延びる
    • Metabolism : ↓(lactateなど)
    • Tolerance to shear stress : ↑
    • Cell-specific and volumetric productivity : ↑ or →
    • Protein folding : おそらく改善
    • Product quality : 増量可能

    アウトプット因子

    • 主要プロセス指標(KPI)
      • 生細胞濃度(VCC) : mAb生産性
      • 細胞生存率 : 不純物含量
      • 細胞直径 : (?)
      • 製品力価
      • グリカン : 品質

    手段

    スケールダウンモデル(Scale-down Model; SDM)では、以下に示すパラメータが、スケールアップや、その他、Bioreactorの違いなどに応じて変更が生じる可能性がある。

    scale-convert toolは、Sartoriusのバイオリアクター製品に応じて、それぞのパラメータを提案する。

    • 体積ガス流量(VVM)
    • 単位体積あたりの電力(P/V)
    • 物質移動係数(KLA)
    • ガス転送速度
    • 攪拌速度

    Bioreactorのスケールアップ

    Sartoriusのバイオリアクター製品は、スケールアップを容易にするためにH/D比を合わせている。

    • Bioreactorの高さ vs 直径 (H/D)の類似性は、パラメータを類似させる
    • 攪拌における電力入力 (W/m3)

    ambrを使用したスケールアップ・パラメータの設定

    ambr15は、sartoriusのミニチュア・バイオリアクターです。スケールアップでの実験計画法 (Design of Experiments; DoE)による検討によく使われています。

    • 15mLのミニチュアバイオリアクターであるため、複数の検討を同時に実施することが可能であり、DoEの実施に向いている
    • DO、pHの測定、その他のKPIの測定(サードパーティ製の統合化可能モジュールで自動測定)も自動で測定可能
    • ambrソフトウェア
      • データの自動集積
      • SIMC多変量解析(MVDA)
      • 重要プロセスパラメータ(CPP)の特定
      • 最適化範囲とロバストネスな範囲の特定

    検討内容

    15mLから2,000Lのバイオリアクターにおいて、Sartoriusが開発したscale-convert toolが、培養スケールの違いがあっても、同等な培養が可能で同等な品質のmAbを得られるかの検証内容。

    • 細胞株
      • ヒトIgG1 mAb (Cellca CHO DG44 (Sartorius)
      • 工業的に使用(イギリス、アメリカ)されているホストセル
    • ambr15と250mLから2,000L SUBへのスケーリング
    • KPIとCQAへの影響を確認
    • 攪拌の最適化
      • スケール変換ツール(by Sartorius)使用により15mLから2000LのSUBでの双方向なスケーラビリティを確保するアルゴリズム
      • 剪断力の最小化
      • 均一な細胞の混合
      • 電力入力(P/V)
      • 攪拌翼の速度
      • レイノルズ数(Re) : 攪拌速度を必要とする
    • スケーラブルなガス処理戦略
      • kLa : DECHEMAガイドライン1)に従い、ambr/UniVesselおよびBiostat STR Bioreactorにおいて決定されている
      • 特定のDO設定でのガス調整で81 L/hのスケーラブルなkLaの算定
    • スモールスケール・バイオリアクター
      • ambr15 (15mL) : 2L~7Lのベンチトップ・スケールを模倣
      • ambr250 (250mL) : スケールアップ開発に適する(H/D比)
        • 1000Lを模倣可能な結果が得られた
    • ベンチトップ・バイオリアクター
      • UniVessel (5L)ガラス・バイオリアクター(Sartorius)
    • 商業規模バイオリアタクー
      • BIOSTAT STR SUB (50L, 200Lおよび2,000L)
      • H/D比は同一 : 2/1
      • インペラーとbag直径の比は同一 : 0.38
      • bag : FlexSafe STR bag
        • Sartocheck 4 Plus : バッグのリークテスト
    • スケーラビリティ研究デザイン
      • ambr15, ambr250, BIOSTAT STR 50L, 200L, 2,000L
      • 履歴データソース : Sartoriusの米国データ、インドのデータ、米国のデータ
      • 検討項目 : スケール全体で比較
        • パフォーマンス
        • KPI
        • mAb力価
        • CQA
      • 条件抽出
        • 播種前の条件
          • 生産用培地の温度平衡(~36.8℃/4時間)と供給時間(1日)
        • プロダクション段階
          • 播種直前
            • BioPAT ViaMassセンターのゼロ調整
          • 攪拌とガス処理関連パラメータkLa = 81/hを満たすパラメータ設定
    • 続き(スケーラビリティ研究デザイン)
      • 続き(条件抽出)
        • 温度: 36.8℃
        • pH7.1
        • DO 60%
        • Re (>3,000)
        • Impeller 先端速度 : 0.6~1.25 m/s
        • 30~200 W/m3
      • 注(上記の表の説明)
        • 先端速度(Tip Speed)とReynolds Numberは、ambrの場合 < BIOSTAT STRの場合となります。そり理由は以下の通り
          • ambrのImpeller数は1枚
          • BIOSTAT STRのImpeller数は2枚はと比較して、低くなる
      • 培養は、Feedを使用した流加培養
      • 播種濃度 : 0.2e6 cells/mL (Seed stage), 0.3e6 cells/mL (Production Stage)
      • 種培養期間 : 3~4日間 (2.5e6 cells/mL)
      • プロダクション培養(9日間、流加培養)
        • Feed A
        • Feed B
        • 400 g/L Glucose to keep 3g/L for production
        • ambr15のFeedの方法 : workstation’s automated liquid-handling system
        • ambr25のFeedの方法 : syringe pumps built into the ambr workstation
        • 5Lベンチトップ/BIOSTAT STRのFeedの方法 : peristaltic pump
      • サンプリングと分析
        • 自動採取
        • ambr15/FlexSafe STRバッグ
          • 付属の光学シングルユースDO/pHセンサー
          • グルコース/乳酸 : BioProfile FLEX2自動細胞培養分析システム(Nova Biomedical)
          • 浸透圧 : Osmomat 030(Gonotec) or Cedex HiResアナライザー
        • ambr250
          • 光学式シングルユースDOセンサー、電気化学pHプローブ
          • グルコース/乳酸/浸透圧 : BioProfile FLEX2自動細胞培養分析システム(Nova Biomedical)
        • BIOSTAT/UniVesselバイオリアクタ
          • UniVesselバイオリアクターの電気化学センサー
          • グルコース/乳酸 : Radiometer ABL800基本システム(Radiometer,ドイツ)
          • VCC/細胞生存率/浸透圧 : BioPAT ViaMass or Cedex HiResアナライザー(Roche Diagnostics、ドイツ)
      • mAb生産性
        • 培養上清でmAb測定
        • N型グリカン・プロファイル分析(スコットランドのザルトリウすにある分析センター)
        • 最終的mAb力価は、12日目のサンプル(スコットランドのザルトリウすにある分析センター)
        • 補足分析 : LabChip GXII Touchタンパク質特性評価システム(Peerkin Elmer, Seer Green, UK)
    • Reference standard
      • 30のデータセット(Commercial IgG achieved)
        • ambr250のデータセット
        • UniVessel
        • BIOSTAT STR
        • VCCs : >20e6 cells/mL, 80 cell viability at the day of harvest

    検討結果

    結論

    ザルトリウスが開発したスケール変換ツール(scale-conversion tool)を使えば、ambr15から2,000L BIOSTAT STRバイオリアクターまでのスケールアップについて、単一の戦略を適応可能である。

    結果

    攪拌速度における最適なRe値、チップ速度、P/Vの変化 – 縦軸が1の場合が最適解

    まとめ

    Sartoriusのバイオリアクター製品で統一することで、2,000Lまでのスケールアップは、scale-convert toolにより容易に実現可能であることがわかった。

    編集履歴
2020/06/20 はりきり(Mr)
2020/09/26 追記 (目的の内容を補充)
    0)

    A Rapid, Low-Risk Approach Process Transfer of Biologics from Development to Manufacturing Scale

    BioPreocess Internatioanl, 2020/03/24

    https://bioprocessintl.com/sponsored-content/biostat-str-bioreactors-a-rapid-low-risk-approach-process-transfer-of-biologics-from-development-to-manufacturing-scale/
    1)

    DECHEMA Guidline

    https://dechema.de/dechema_media/Downloads/Positionspapiere/SingleUse_ProcessEngineeringCaracterisation_2016.pdf
    2)

    プロダクション培養の温度を途中37℃から低い温度でシフトすることで、mAbの生産性が高まる。

    pH Condition in temperature shift cultivation enhances cell longevity and specific hMab productivity in CHO culture (2006)

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3449411/
    3)

    CHO細胞の培養条件として、温度のインパクトなどの文献レビュー。27~35℃は、mild subphysiological temperatureと表現されている。

    [Review] The impact of process temperature on mammalian cell lines and the implications for the production of recombinant proteins in CHO Cells (2014)

    https://www.openaccessjournals.com/articles/the-impact-of-process-temperature-on-mammalian-cell-lines.pdf
    4)

    CHO細胞における、pCO2、pHの培養バラメータは経験的に生産性を高めることが知られているとし、CHO細胞の代謝とエネルギーの代謝に関わっていると言っています。

    The Less the Better: How Suppressed Base Addition Boosts Production of Monoclonal Antibodies With Chinese Hamster Ovary Cells (2019)

    https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2019.00076/full
  • 気になる企業 – Roche グループ – 全世界で約9万人 – Genentech, 中外製薬, Spark – がグループを支える [2020/06/24]

    気になる企業 – Roche グループ – 全世界で約9万人 – Genentech, 中外製薬, Spark – がグループを支える [2020/06/24]

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    Roche グループ

    売上規模

    • 2019年のPharmaceuticalsの売り上げは、48.5 CHF billion (約4.9兆円)でした。

    Annual Report 2019
    Roche – サイトより

    https://www.roche.com/investors/annualreport19.htm#financials

    歴史

    • 1896年設立したF. Hoffmann-La Rocheに端を発する
    • Roche Holding AGが統括、更に各国の現地法人への出資は、Roche Pharmholding B.V.が担当source
    • 1997年、試薬大手であった独のベーリンガー・マイハイムをM&A
    • 診断薬部門(ロッシュ・ダイアグノスティックス)
      • 世界3位
      • プロフェッショナル・ダイアグノスティックス
      • モレキュラー・ダイアグノスティックス
      • ティッシュー・ダイアグノスティックス
      • ダアベディスケア
      • シークエンシング・ユニット
    • 医薬品部門
      • 中外製薬、を2002年にM&A
      • Genentech, Inc. を2019/03/12に完全子会社化(USD468億, 約4兆5700億円)薬事日報
      • Spark、遺伝治療

    シグマアルドリッチジャパンは、Roche社のバイオケミカル試薬の販売について独占契約を締結している(2015/6/8)

    Biosimilar Strategy

    2015年現在での、バイオ医薬品メーカーでBiosimilarを推進しているメーカーは、

    • pfizer/Hospira
    • SANDOZ
    • Boehringer Ingelheim
    • AMGEN
    • SAMSUNG BIOEPICS
    • CELLTRION

    を掲載している。

    RocheのBiosimilar戦略は、(1) HER2, (2) CD20、そして(3) Avastinを拡大して行くとのこと。

    Recent developments and global trends in the biosimilar market: What would oncology look like?

    8th Annual Biolsimilar Conference /Bernstein; December 2015 – より

    https://www.roche.com/dam/jcr:16cc118a-26d3-4e19-ab91-fd38a62ca515/en/irp151203.pdf
    編集履歴
2020/06/19 Mr.HARIKIRI
2020/06/24 追加(RocheのBiosimilar戦略, 2015版、売上規模)
  • 気になる企業 – Genentech – 抗体のエフェクター機能を主力に抗体医薬を開発する戦略 [2020/06/19]

    気になる企業 – Genentech – 抗体のエフェクター機能を主力に抗体医薬を開発する戦略 [2020/06/19]

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    Genentech

    Genentechは、Rocheのグループ企業です。

    https://www.genentechoncology.com

    • 2019/03/12にRocheの完全子会社化(USD468億, 約4兆5700億円)薬事日報
    • 癌治療の抗体医薬を開発する戦略
    • バイオマーカー
      • 乳がん : HER2, PD-L1
      • 胃・腸癌 : 胃食道癌(Gastroesophageal Adenocarcinoma; GEA), HER2
      • 肺癌
        • PD-L1
        • KRAS
        • FGFR1
        • EGFR
        • ALK
        • PTEN
        • DDR2
        • HER2
        • BRAF
        • PIK3CA
        • ROS1
        • MET
        • NRAS
        • RET
        • AKT1
        • MEK1
      • 膵臓癌
        • NTRK
        • MSI
        • TMB/bTMB
      • enspryng; satralizumab-mwge (アクアポリン4(AQP4)に対する抗体陽性に対する適用),2020/08/17 FDAがBLAを承認
        • pH依存的結合性抗体
        • リサイクリング技術を適用
        • ターゲット : IL-6R
        • US患者数 4,000~8,000

    Fcを介したエフェクター機能

    3つのエフェクター機能

    • 抗体依存性細胞性細胞毒性 Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ADCC　
    • 抗体依存性細胞貪食 Antibody-dependent cellular phagocytosis ADCP
    • 保体依存性細胞貪食 Complement-dependent cytotoxicity CDC

    エフェクター機能の増強

    • 抗体のヒンジ領域にある糖鎖付加サイトのFucose付加が少なくなると、エフェクター活性が高まることが知られている。糖鎖科学を通じた糖分子を操作することでエフェクター活性の増強を研究している

    抗体ライブラリ

    • ファージディスプレイ(phage display)技術による抗原に対する抗体の結合ライブラリを用いて特異的抗体の配列をスクリーニングに持ちしている

    Bispecific

    抗体は、L鎖とH鎖 (L-H)が2つ結合した構造(L-H) – (H-L)である。Bispecific Antibodyは、抗原Aに対する抗体(L-H)a – (H-L)aと抗原Bに対する抗体(L-H)b – (H-L)bのうち、それぞれ片方の(L-H)同士を結合させた構造(L-H)a – (H-L)bとした構造である。

    癌細胞を攻撃するT細胞の表面抗原と癌細胞の表面抗原に、それぞれ親和性がある(L-H)t – (H-L)cを作れば、T細胞は癌細胞に接近することが可能となる。その結果、T細胞は、効果的に癌細胞を攻撃するすることが可能となる。

    ADC

    Antibody Drug Conjugate (ADC)は、細胞毒性物質を抗体に結合させたものである。細胞毒性物質を癌細胞に対して特異的に届けることが可能となる。

    Genentech, About Monoclonal Antibodies

    https://www.genentechoncology.com/development-platforms/monoclonal-antibodies.html
  • 気になる企業 – BioReliance/Carlsbad – CDMO of AAV gene therapy [2020/06/18]

    気になる企業 – BioReliance/Carlsbad – CDMO of AAV gene therapy [2020/06/18]

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    BioReliance

    Viral and gene therapy manufacturing site at Carlsbad

    • 20 years of experience
    • 500 batches of virus to support gene therapy
    • single use bioreactor and purification
    • phase III and commercial launch (PPQ batch)
    • Experience (batches) 2010-2017
      • Adeno-associated virus : 19%
      • Adenovirus : 20%
      • Lentivirus/Retrovirus : 40%
      • Reovirus : 5%
      • Others : 16%
    • in-house process development
      • USP : adherent or suspension culture
      • DSP
    • Technical Transfer
      • full tech transfer team for cGMP
      • >20 program
    • Cell and Viral Banking
      • master and working
      • cell and viral (access to additional storage in Rockville, Maryland, USA and Glasgow Scotland, UK)
      • viral seed stock characterization
    • Sterile Fill Finish
      • most critical processes in safegarding the sterility
      • delivering drug substances intended for use in patient
      • 2,000 vials/day in two dedicated Class 1000(ISO 6) fill suites, one of which is designed for commercial fills
    • Viral Vector Testing
    • Secure Biostorage
      • freezers of -80℃ and -20℃
      • liquid nitrogen dewars
    • Leader in Viral Vector Mnufacturing
      • SAFC Carlsbad
      • >20 years of track record in developing and manufacturing viral vectors and vaccines from 1990s
      • In 2017 expansion

    Bio Reliance (Carlsbad), サンディエゴ、US

  • [Gene Therapy] 過去に日本でも実施された遺伝子治療臨床研究( まとめ) [2020/06/15]

    [Gene Therapy] 過去に日本でも実施された遺伝子治療臨床研究( まとめ) [2020/06/15]

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    日本の遺伝子治療研究の歴史

    1995年から2006年までの間に、21の臨床研究が行われています。これらの研究があってこその現在の遺伝子治療の治験があると思います。

    編集履歴
2020/0615はりきり(Mr)
    実施承認年実施施設(病院・企業)対象疾患導入遺伝子ベクター実施症例数(予定症例数)治験
    1995北海道大学医学部附属病院アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症[免疫不全症]ADAレトロウイルスベクター/ex vivo (患者T細胞)1[終了]–
    1997ミドリ十字ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症HIV env/revレトロウイルスベクター/in vivo (筋注)0(4)
    [開発前中止]    		◯
    1998東京大学医科学研究所附属病院腎癌顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)レトロウイルスベクター/ex vivo (患者腎癌細胞)4(6) [終了]–
    1998岡山大学病院/RPRジェンセン非小細胞肺がん正常型p53アデノウイルスベクター/in vivo (ガン組織局所投与)9[終了](15)治験→臨床研究
    2000東京医科大学病院/RPRジェンセル同上同上同上3[終了]同上
    2000東北大学病院/RPRジェンセル同上同上同上2[終了]同上
    2000東京慈恵会医科大学附属病院同上同上同上1[終了]同上
    2000名古屋大学医学部附属病院悪性グリオーマインターフェロンβ静電がリポソーム/in vivo (ガン組織局所投与)5(25)–
    2000癌研究会附属病院/同癌化学療法センター乳がん(大量化学療法施行時の骨髄抑制防止)多剤耐性遺伝子MDRIレトロウイルスベクター/ex vivo (患者造血幹細胞)3(10)–
    2000千葉大学医学部附属病院/RPRジェンセル進行食道癌正常p53アデノウイルスベクター/in vivo (癌組織局所投与)10(10)
    [終了}    		◯
    2000岡山大学病院前立腺がんヘルペスウイルスチミジンンキナーゼ(HSV-tk)アデノウイルスベクター/in vivo (癌組織局所投与)9(9)[終了]–
    2001大阪大学医学部附属病院閉塞性動脈硬化症/バージャー病肝細胞増殖因子(HGF)プラスミドベクター/in vivo (大腿部筋肉内投与)22(22)[
    終了]    		–
    2002筑波大学附属病院際発生白血病[移植片対宿主病(GVHD)の重症化防止]HSV-tk/低親和性神経成長因子受容体膜貫通領域及び細胞外領域(deltaLNGFR)レトロウイルスベクター/in vivo (ドナー抹消血単核球)8(10)–
    2002東京大学医科学研究所富士区病院神経芽腫インターロイキン-2/リンフォタクチンアデノウイルスベクター/in vivo (患者造血幹細胞)0(6)–
    2002北海道大学附属医学部病院ADA欠損症ADAレトロウイルスベクター/in vivo (患者造血幹細胞)2(4)–
    2002東北大学病院X連鎖重症複合免疫不全症(X-SCID)サイトカイン共通受容体γc鎖レトロウイルスベクター/in vivo (患者造血幹細胞)自主的未実施(5)–
    2003神戸大学医学部附属病院前立腺癌HSV-tkアデノウイルスベクター/in vivo (癌組織局所投与)6(6)(終了)–
    2003信州大学医学部附属病院悪性黒色腫インターフェロンβ正電荷リポソーム/in vivo (癌組織局所投与)5(5)(終了)–
    2003アンジェスMG閉塞性動脈閉塞症/バージャー病HGFプラスミドベクター/in vivo (大腿部筋肉内投与)41(終了)/9(終了)◯/◯
    2006九州大学病院閉塞性動脈硬化症/バージャー病線維芽細胞増殖因子-2(FDF-2)仙台ウイルスベクター/in vivo (大腿-下腿部筋肉内投与)11(12)–
    2006自治医科大学附属病院進行性パーキンソン病ヒト芳香族L-アミノ酸脱水素酵素(hAADC)AAVベクター/in vivo (線条体内定位脳手術的注入)6(6)[終了]–
    バイオ医薬品ハンドブック 〜 Biologicsの製造から品質管理まで〜, 日本PDA製薬学会バイオウイルス委員会、2012, p.132
    編集履歴
2020/06/16 Mr.HARIKIRI
  • 気になる企業 – PlasmidFactory – PlasmidのGMP製造受託 [2020/06/16]

    気になる企業 – PlasmidFactory – PlasmidのGMP製造受託 [2020/06/16]

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    PlasmidFactory

    PlasmidFactory is the leading contract manufacturer and service provider for plasmid and minicircleDNA.

    PlasmidFactory site

    https://plasmidfactory.com

    Plasmid DNAをGMPで製造受託

    編集履歴
2020/06/16 Mr.HARIKIRI
  • [Kw] ヒドロキシクロロキン – FDAはCOVID-19感染予防の緊急使用を撤回 [2020/05/16]

    [Kw] ヒドロキシクロロキン – FDAはCOVID-19感染予防の緊急使用を撤回 [2020/05/16]

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    FDAは、抗マラリヤ薬で知られる「ヒドロキシクロロキン」のCOVID-19感染予防に対する緊急使用を許可していましたが、効果が無いこと、及び心臓への副作用も強いことから、緊急使用を撤回しました。ヒドロキシクロロキンについては、WHOが実施していたCOVID-19に対する臨床試験を中段していた。

    参考文献

    ヒドロキシクロロキン wikipedia – より

    https://ja.wikipedia.org/wiki/ヒドロキシクロロキン

    WHO　抗マラリア薬・ヒドロキシクロロキンの臨床試験を一時中断

    https://www.mixonline.jp/tabid55.html?artid=69336
    編集履歴
2020/06/16 Mr.HARIKIRI