カテゴリー
AAV BIOLOGICS education gene-therapy

[Bio-Edu] Plasmid – バイオロジクスには欠かせない遺伝子組換え技術、そして rAAVを作るまで! – AAV Vector配列の例 – △ID12915 [2020/08/05]

rAAVによる遺伝子治療薬の開発には、遺伝子組換え技術が使われている為、この知識がなくてはならい。
rAAVを作るには、これまでのタンパク質を作ることとは、何倍も複雑かつ多数の手間が掛かっている。
遺伝子組換え技術からrAAVを作るまでの基礎知識を解説する。

[Bio-Edu] Plasmid – バイオロジクスには欠かせない遺伝子組換え技術、そして rAAVを作るまで! – AAV Vector配列の例 – △ID12915 [2020/08/05]
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID24747
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID:11143(2)
  • by Google Ads ID:11145
スポンサーリンク
by Google Ads ID8603

はじめに

rAAV: recombinant Adeno Associated Virus による遺伝子治療薬の開発には、遺伝子組換え技術が使われている為、この知識がなくてはならい。

rAAVを作るには、これまでのタンパク質を作ることとは、何倍も複雑かつ多数の手間が掛かっている。

遺伝子組換え技術からrAAVを作るまでの基礎知識を解説する。

編集履歴
2020/04/07 はりきり(Mr) まずは、遺伝子組換え技術
2020/06/21 追記(rAAV作成に必要なベクター製品)
2020/08/04 追記(必要なPlasmidとその機能)

まずは、遺伝子組換え技術

スポンサーリンク
by Rakuten ID:15895

1) 遺伝子工学の技術

遺伝子工学の技術 – 福岡大学 –

http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/genetech.htm

以下の用語は、同義である。

  • 遺伝子工学 (gene technology, genetic engineering)
  • 遺伝子操作 (gene manipulation)
  • 遺伝子組換え技術 (recombinant DNA technique)

これら技術は、1970年代に発見された以下の要素で構成されている

  • 制限酵素 (遺伝子の特定部位を切断する酵素)
  • 逆転写酵素 (DNAからmRNAが作られるが、逆に、mRNAからDNA(cDNA)を作る(転写する)酵素
  • リガーゼ (別々のDNA断片にそれぞれ、認識特異配列を認識してDNAを繋ぐ酵素)

ベクター

有用と考えた遺伝子配列を細胞に組込む場合、先ず、ベクターという器にその遺伝子配列を載せなければならない。ベクターには、以下のものがある。

  • ファージ
  • ウイルス
  • プラスミド (Plasmid) : 多くのバクテリアの核外の遺伝子で、組換技術用にデザイン・改変された鋳型となるPlasmidが市販されている)
  • コスミド
  • 酵母人工染色体

大腸菌とPlasmid

  • 大腸菌(E.coli)は、2μmのソーセージの形をしていて、至適な環境では25分で2倍に分裂増殖する。4μmに成長すると中央がくびれて2個になる。菌の中央に位置する染色体DNAは、4000個の遺伝子をコードしており2本鎖で環状である
  • 多くの大腸菌株には、染色体DNA以外に小さい環状の2本鎖DNAを持ち、これをPlasmidといいい、染色体DNAと同様に分裂増殖する際に複製される
  • Plasmidの種類として大きく分けてR (resistant)-Plasmid, F (fertility)-Plasmid (雄株が持つ)がある。
    • Rプラスミド: 薬剤耐性の遺伝子を含む
    • Fプラスミド: 雌株に接合してFプラスミドを伝達する機能
  • 雄の大腸菌は、雌の大腸菌の細胞内に自分のPlasmidを挿入する過程で自分の染色体DNAを伝達することがあり、遺伝子の交雑が起こる
  • 以上の現象などから、遺伝子組換え技術が考案され、大腸菌間の遺伝子組換えを人為的に行える技術が確立されできた。
    • 自然界にPlasmidが存在する
    • そのPlasmidの機能を利用するのが、遺伝子組換え技術

制限酵素

遺伝子組換え技術における「ハサミ」である。ThermoFisherには概説。制限酵素の一覧は、TaKaRaを参照

  • それぞれ種々の配列を認識して切断する多数の制限酵素が知られている
  • EcoRI (図1参照)は、GAATTCと相補的(CTTAAG)に結合しているDNAを選択的に、「のり代」のある形に切断する
    • G-AATTC (CTTAA-G) : ‘-‘で切断
2) 大腸菌と組み換えDNA技術

大腸菌と組み換えDNA技術

京都 WEB マガジン 現代アートとサイエンス No.11

https://plasmid.med.harvard.edu/PlasmidRepository/file/map/pAAV-MCS.pdf

DNAリガーゼ (ligase)

遺伝子組換え技術における「のり;糊」であるsource

  • Plasmid (環状DNA)の一部の領域に制限酵素により「のりしろ」付き状態にしたところに、目的遺伝子(同様に「のりしろ」状態)を結合させて、環状DNA(Plasmind)にする酵素
  • DNAの末端同士をリン酸ジエステル結合させる

大腸菌にタンパク質を作らせる

  • 最も初期の遺伝子組換え技術の応用例として、糖尿病治療薬のインスリン、ウイルス抑制因子のインターフェロンの大腸菌による生産がある
  • 天然のPlasmidを鋳型として、適切な位置にインスリンやインターフェロンをコードした遺伝子配列を挿入し、デザインしたPlasmidを作る
    • まず、

Competent Cell

Competent Cellとは、Plasmidを細胞内に導入しやすいようにダメージ処理が施され安定保存された細胞のことsource、wikipedia

  • カルシウムイオン存在下で冷却処理(膜透過性の増大)
  • 凍結保存(-80℃以下)

製品

XL-Blue Competent Cells(Agilent)

  • XL2-Blue UltraCompetent Cells
  • XL1-Blue SuperCompetent Cells
  • XL1-Blue Electroporation-Competent Cells
  • XL1-Blue Competent Cells
  • XL-2-Blue Subcloning Grade Competent Cells

特徴

  • プラスミドベクター/ラムダファージベクターの両ベクターの増幅に両できる菌株
  • 表現系: EndA(-)
  • Plasmid DNAの増幅/回収に適したCompetent Cell
  • Blue/White スクリーニング、ファージミドDNAのsingle-strandレスキューが可能
  • F7エピソームは、抗生物質耐性
  • XL1-Blue : エレクトロポレーション・コンピテント・セル(>=1e9)
    • 遺伝子型: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’proAB lacIqZ△M15 Tn10 (Tetr)]
  • XL2-Blue : ウルトラコンピテント・セル(>=5e9)
    • 遺伝子型: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’proAB lacIqZ△M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]a
  • カルタヘナ対応が必要

rAAVを作る

必要なPlasmidとその機能

ベクタープラスミドとヘルパープラスミドには、共通する塩基配列があると、相同性組換えによって野生型のウイルスの出現の可能性が高まるため、共通配列が存在しないようにデザインする。

  • ベクタープラスミド (Vector Plasmid)
    • 目的は、目的遺伝子の挿入
    • 両端のITRのみを残し、目的遺伝子を挿入
  • Rep/Cap プラスミド (Rep/Cap Plasmid)
    • 目的は、DNA複製タンパク質とカプシドタンパク質をコードする遺伝子の挿入
  • ヘルパープラスミド (Helper Plasmid)
    • 目的は、AAVの増殖に必要なadenovirus由来遺伝子の挿入 (宿主のHEK293には、更に必要となるE1A, E1Bを持っているため、これらは必要ない)
    • E2A, VA, E4 or f6
3) AAVを利用した遺伝子治療

4. AAVを利用した遺伝子治療 – ウイルス 第57巻 第1号 pp.47-56, 2007 –

http://jsv.umin.jp/journal/v57-1pdf/virus57-1_047-056.pdf

Vector製品

Vectorは、Plasmid構造になっています。「運び屋」の別名を特に付けている訳です。

Agilent社のベクター製品

recombinant AAVを生産させるための材料として、どのようなものが必要なのか理解することができる。

(1)目的遺伝子ベクター、(2)rep/capベクター、および(3)Helperベクター、の3つのベクターを、感染性AAV粒子を作るために必要な補間遺伝子をコードするHEK293細胞に同時感染させ、感染性recombinant AAV (rAAV)を作成するための製品群。

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
  • pCMV-MCSベクター
    • 4.5kb
    • クローニング・ベクター
    • マルチクローニングサイトに目的遺伝子をクローニング → 「pAAV-CMV-MCSベクター」作成
      • 同時トランスフェクション
    • pAAV-MCS、pAAV-LacZへサブクローニグ可能
  • pAAV-LacZベクター
    • 7.3kb
    • クローニング・ベクター/コトロール・ベクター
    • LacZはレポーター
    • pAAV-MCSを作るため自立複製能を持たないAAVベクター
    • Not IでLacZカセットの切り出し、pCMV-MCSベクターから取り出した目的遺伝子カセットクローニングできる →「pAAV-MCSベクター」作成
      • 同時トランスフェクション
  • pAAV-RCベクター
    • 感染性があるrAAV2粒子を作るのに必要
    • rep/cap遺伝子 (DNA複製タンパク質/カブシドタンパク質)
    • 同時トランスフェクション
  • pHelperベクター
    • rAAV2発現用
    • AAV-293細胞との組み合わせで機能する
    • Adenovirus由来遺伝子(E2A, E4, VA RNAs)
    • AAVのlytic phaseの誘発
    • 同時トランスフェクション
  • AAV-293細胞
    • Adenovirus由来の遺伝子をコード(E1A, E1B)
    • トランスフェクション用細胞
  • AAV-HT1080細胞
    • ウイルスのタイター測定用細胞
4) AAV Helper-Free System

AAV Helper-Free System

Agilent (ストラタジーン)

https://www.chem-agilent.com/contents.php?id=300079

AAV Vector

Example

図1. pAAV-MCS ベクター
TypeNameDescriptionStart PositionEnd Position
viral LTRITRAAV inverted terminal repeat00
promoterCMVpCMV promoter for mammalian expression00
gene fragmentbgexIIbeta-globin exon II fragment00
gene fragmentbhIVSIIbgIVSII fragment00
MCSMCSMCS (EcoRI, NotI, BamHI, SalI, XhoI, BlgII)00
gene fragmentbgexIIIbgexIII fragment00
viral LTRITRAAV inverted terminal repeat00
ssDNA originF1 oriF1 origin for ssDNA production00
selectable markerampRampicillin resistance gene00
bacterial originColE1ColE1-type bacterial origin00
https://plasmid.med.harvard.edu/PLASMID/GetVectorDetail.do?vectorid=221
5) AAV – wikipedia

AAV – wikipedia

https://ja.wikipedia.org/wiki/アデノ随伴ウイルス
スポンサーリンク
  • by Amazon ID13339
  • by Amazon ID19245

用語の解説、関連タグ付き投稿の抽出

E.coli

[Bio-Culture] 大腸菌; E.coliの増殖率は細胞長の増大に関わる – ID28121 [2021/02/27]
[Bio Edu] Quality by Design – [2021/05/11]
[Bio-Edu] 組換え大腸菌で造らせたタンパク質のリフォールディングおよび、その後の精製手順 – ID18567 [2020/08/19]
[Bio-Edu] Plasmid – バイオロジクスには欠かせない遺伝子組換え技術、そして rAAVを作るまで! – AAV Vector配列の例 – △ID12915 [2020/08/05]
[Kw] 細菌にも性がある – 核外遺伝子: プラスミドを持っているものが雄 – ID3716 [2020/05/08]
[Bio-Edu] インスリン: Insulinの製法 – ID9405

rAAV

[Bio-Edu] Plasmid – バイオロジクスには欠かせない遺伝子組換え技術、そして rAAVを作るまで! – AAV Vector配列の例 – △ID12915 [2020/08/05]

Vector

[Bio-Process] 配列からベクターDNAを作るまでの概要 – ID16682
[Bio-Vector] 人工染色体 – 目的細胞に導入して安定発現細胞株を作る – AAVベクターの生産株として適用できるのか? – chromocenter/TaKaRa – ID26979 [2021/01/15]
[Gene Therapy] AAV Vectorの特徴、および他のベクターとの比較 / その他、参考文献 / ID444 [2021/01/04]
気になる企業 ベクタービルダー /デザイン/受託/開発/GMP製造 [2020/11/21] ID24901
[用語] Lentivirus; レンチウイルス – ウイルスベクター [2020/11/14] ID24806
[Vc] Pfizerの新型コロナウイルスに対するmRNAワクチン – Pfizer-BioNTech COVID-19 Vaccine の組成 – ID19433 [2021/06/10]
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID:11145
  • by Google Ads ID:11143(2)
  • by Google Ads ID24747

Update ID21920

BIOLOGICS, Lab
[Bio-Lab] QPix400 Imager 全自動微生物コロニーピッキングシステム – ID18403 [2020/06/03]

Post Views: 49 QPix400 複数枚の培養プレートに対応し多検体処理が可能。 サイトの説明から。モレキュラーデバイスの全自動微生物コロニーピッキングシステムでは、マーカーを事前にスクリーニングし、希望する […]

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
BIOLOGICS, Lab
[Bio-Lab] グラスファイバーフィルター 接着剤使用, AP20, 55 mm – ID16692 [2020/06/03]

Post Views: 45 ラボ製品-グラスフィルター グラスフィルターは、タンパク質の非特異吸着が多いため、用途には気を付ける。具体的な用途としては、大腸菌で産生させたInclusion body状のタンパク質のRe […]

BIOLOGICS, Lab
[Bio-Lab] Alexa Fluor® 488 色素 – ID16697 [2020/06/03]

Post Views: 50 ラボ製品-標識試薬 Alexa Fluorはタンパク質に傾向標識する試薬キットである。 精製したタンパク質を使って、細胞を用いた評価系で評価をしたい場合、タンパク質の標識に使用する サイトの […]

更新された投稿の最新順

スポンサーリンク
  • by Amazon ID13211
  • by Amaozn ID13196
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID24747
  • by Google Ads ID:11143(2)
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID:11145

最新記事(rAAV)

AAV, BIOLOGICS, cell
[Bio-Vector] 人工染色体 – 目的細胞に導入して安定発現細胞株を作る – AAVベクターの生産株として適用できるのか? – chromocenter/TaKaRa – ID26979 [2021/01/15]

Post Views: 63 目次1 はじめに2 ウイルスベクターの新たな作り方3 人工染色体の特徴4 人工染色体の構造5 遺伝子搭載サイズ6 従来ベタクーとの比較7 chromocenter社の方法7.1 ドナー細胞の […]

AAV, BIOLOGICS, gene-therapy
[Bio-Edu] 遺伝子治療医薬品の開発における、研究グレードとGMP – ID26219 [2020/12/22]

Post Views: 56 目次1 はじめに2 マテリアルの選択2.1 候補(導入遺伝子)がない2.2 候補がある2.3 前臨床が完了していない2.4 前臨床か完了している3 開発プロセス はじめに Vigene社がサ […]

AAV, BIOLOGICS, CMO, gene-therapy
気になる企業 – Molecular Medicine ;MolMed – ID12516 [2020/11/09]

Post Views: 49 目次1 MolMed1.1 サービス2 AGCが買収 MolMed イタリア ウイルス・ベクターを用いた遺伝子治療薬製造のCDMO サービス MolMed独自のテクノロジーを持っている。 M […]

AAV, BIOLOGICS, education
[Bio-Edu] ウイルスの等電点(pI) – 組換えAAVでは,empty/fullの違いでpIは異なる – 分離精製は工業化の課題である △- ID24561 [2021/02/23]

Post Views: 58 目次1 はじめに2 ウイルスの等電点(pI or IEP)3 ウイルスの等電点の検証結果の詳細4 AAV1~AAV10のpI計算5 AAV8, AAV9のpI6 AAV tree7 編集履歴 […]

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
AAV, BIOLOGICS, drug
[遺伝子治療薬] ZOLGENSMA – AveXis-Novartis社が開発した筋萎縮性側索硬化症 (SMA)治療薬 – SM-ID23165 [2020/07/27]

Post Views: 142 目次1 筋萎縮性側索硬化症2 ZOLGENESMA2.1 薬価収載3 詳細 筋萎縮性側索硬化症 筋萎縮性側索硬化症(Spinal Muscular Atrophy (SMA))は、10万人 […]

AAV, BIOLOGICS, PALL, purification
[Bio-Material] Mustang® Q Membrane Units (2004) を使ったアプリケーション (Pall) – ID23160

Post Views: 49 目次1 AAVの精製2 pDNAの精製3 編集履歴 AAVの精製 Pall社の陰イオン交換体: Mustang Q membraneを使用したアデノウイルスの精製方法 吸着/溶出モードによる […]

Page: 1 2 14
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID:11143(2)
  • by Google Ads ID:11145
  • by Google Ads ID24747

最新記事(Biologics, ID:14673)

BIOLOGICS, manufacturing, safety
[用語] ADC : – Antibody Drug Conjugates – ID27100 [2021/01/19]

Post Views: 1 目次1 ADC2 編集履歴 ADC Antibody-Drug-Conjugatesの略号。 抗がん剤などのDrugをある組織に特異的に届けたい場合に、その組織に特異的なモノクローナル抗体(A […]

BIOLOGICS, manufacturing, safety
[用語] CMC; Chemistry, Manufacturing and Contorl – ID27100 [2021/01/19]

Post Views: 1 目次1 CMC2 編集履歴 CMC CMCとは、Chemistry, Manufacturing and Controlの略です。治験薬製造と製造承認申請、商用製造に関わる仕事全判を示します。 […]

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
BIOLOGICS, company, J&J, vaccine
[Vc] 各社が開発したCOVID-19ワクチン情報リンク – [2021/10/08]

BioNTech社とPfizerが共同開発するmRNAをベースの新型コロナウイルス感染症に対するワクチンです。開発ワクチンは、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン(receptor binding domain; RBD)をコードするヌクレオチド修飾メッセンジャーRNAをベースにしている(BNT162b2)

BIOLOGICS, CMO, kaneka
気になる企業 – Kaneka Eurogentech S.A. – バイオCDMO – ID30924 [2021/08/05]

Post Views: 15 Kaneka Eurogentech ベルギー, 1985年設立 2010年にKanekaに買収された 2017年にKaneka Eurogentechに社名変更 バイオCDMO GMP D […]

BIOLOGICS, company, J&J, vaccine
[Vc] J&J/Janssen – 新型コロナウイルスに対するワクチン – ID29399 [2021/08/02]

BioNTech社とPfizerが共同開発するmRNAをベースの新型コロナウイルス感染症に対するワクチンです。開発ワクチンは、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン(receptor binding domain; RBD)をコードするヌクレオチド修飾メッセンジャーRNAをベースにしている(BNT162b2)

BIOLOGICS, culture, equipment-harvest, repligen
[Bio-Equip] TFDF – TFFの構造にdepth filterを採用して、高細胞濃度でも濾過能力を高める技術 – REPLIGEN – – ID30880 [2021/07/26]

Post Views: 13 目次1 TFDF2 編集履歴 TFDF 旧来からのTangential Flow Filtration (TFF)技術による濾過機材製品は、低濃度の細胞密度である培養液の濾過には十分に能力を […]

Page: 1 2 70
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID:11143(2)
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID24747
  • by Google Ads ID:11145

最新記事(Education)

BIOLOGICS, culture, education
[Bio-Culture] 大腸菌; E.coliの増殖率は細胞長の増大に関わる – ID28121 [2021/02/27]

Post Views: 47 目次1 大腸菌の増殖率2 編集履歴 大腸菌の増殖率 一般的に、大腸菌の増殖率(growth rate)、1時間あたり1未満であり、それを超える増殖率になってくると、大腸菌の長さが増大するのだ […]

BIOLOGICS, culture, education
[Bio-Culture] Poloxamer 188 – バイオリアクターの撹拌翼による細胞のダメージを抑制 – ID28021 [2021/02/24]

Post Views: 44 目次1 Poloxamer 1882 毒性2.1 動物の静脈内注射 (Poloxamer)2.2 ヒトの静脈内注射 (Poloxamer 188)2.3 創傷治癒2.4 動物実験2.5 AM […]

BIOLOGICS, education, purification
[Bio-Edu] イオン交換クロマトグラフィの原理 – バイオロジクスの製造における基本 – ID27722 [2021/02/13]

Post Views: 50 目次1 イオン交換の原理を使ったクロマトグラフィ2 実務では3 原理4 なぜpHを上げていくと電荷がマイナスチャージになるのか4.1 pHの理解5 編集履歴 イオン交換の原理を使ったクロマト […]

AAV, BIOLOGICS, education
[Bio-Edu] ウイルスの等電点(pI) – 組換えAAVでは,empty/fullの違いでpIは異なる – 分離精製は工業化の課題である △- ID24561 [2021/02/23]

Post Views: 58 目次1 はじめに2 ウイルスの等電点(pI or IEP)3 ウイルスの等電点の検証結果の詳細4 AAV1~AAV10のpI計算5 AAV8, AAV9のpI6 AAV tree7 編集履歴 […]

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
BIOLOGICS, education
[Bio-Edu] DNAとRNAの違い – レジメ – ID24191 [2020/10/11]

Post Views: 55 目次1 DNARNAの違い1.1 3つの部品単位 DNARNAの違い DNAはRNAの設計図になります。RNAは、タンパク質の設計図になります。 DNAを設計図にして、RNAポリメラーゼ […]

BIOLOGICS, education
[Bio-Education] 医薬品の開発スケジュール – ID23493 [2021/04/08]

Post Views: 50 目次1 医薬品の開発スケジュールの概要2 バイオロジクスの開発における細胞株から製造方法3 Cell Bankの作成3.1 Fraunhofer ITEMのサービスから4 ICHQ5D5 編 […]

Page: 1 2 14
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID:11145
  • by Google Ads ID24747
  • by Google Ads ID:11143(2)

その他記事(ALL-RANDOM, ID:16786)

plugin, WordPress
[WordPress] 会員限定ページや会員のみが閲覧できるページやページ内のブロックを作る – 調査編 – ID3866 [2019/12/08]

Post Views: 49 目次1 はじめに2 はじめに3 必要な機能(要求仕様) はじめに 調査を結果、Ultimate Memberプラグインをインストールしています。 当サイトは、Ultimate Memberプ […]

BIOLOGICS, Lab, process, purification
[Bio-Process] Polishing Process of mAb purification – ID8312 [2020/02/01]

Post Views: 53 目次1 Bio-Process1.1 Polishing Bio-Process Polishing 目的 一般的な高度精製は、陰イオンと陽イオン交換クロマトグラフィで行われる。 考慮事項 […]

hotel, LIFE, lounge, TRIP
[Hotel] リーガロイヤルホテル – 広々としたメインラウンジで苺の和風デザート – ID15871 [2020/05]

Post Views: 51 目次1 リーガロイヤルホテル大阪2 駐車場3 ロビー4 メインラウンジ5 苺の和風デザート6 メインラウンジからの風景7 フラワーショップ8 グルメブティック メリッサ リーガロイヤルホテル […]

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
スポンサーリンク
by Google Ads ID:11143(2)

- 以下のツールに敬意を示します -
Support to AMP (Accelerated Mobile Pages) by official AMP plugin for WordPress, and compatible powered by
Post viewing : Flex Posts - Widget and Gutenberg Block