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  • 調査 – 遺伝子治療 – LONZAの動向 – ID3803 [2020/05/07]

    調査 – 遺伝子治療 – LONZAの動向 – ID3803 [2020/05/07]

    AAV

    AAVは、病原性が無いとされるウイルスである。正式名はAdeno Associated Viris (AAV、アデノ随伴ウイルス)である。Adeno Virusが存在しないと複製できないため、Adeno Virusに感染している場合に感染していることが多い。

    背景

    最近のモダリティの拡大が意識されるようになってから、遺伝子治療の分野は、最もホットな分野の一つである。医薬品メーカーは、研究開発に余念がなく、既に先取りした研究開発の成果である特許出願がされており、その特許成立の波がやって来ている。製造を請け負うCDMOにしても、抗体医薬に続く大きな受容を期待しており、次の成長分野である。

    世界規模でいえば、自動車産業を既に抜いているのがバイオ医薬品産業である。日本もこの分野へのテコ入れが進んでいる。

    LONZAの動向

    世界のCDMO (Contract Development Manufacturing Organizer)の優である、LONZAは2016年頃よりAAV Ancestralの使用を進めてており、また、世界の大手CDMOは、AAVベクターの委託製造サービスに本腰を入れてきている。

    Evaluation of AAV production in insect cells using chemically defined media, 2020, Jerome Jacques, Amber Jones, Daniel Xing, Kenneth Low, Alexis Bossie Lonza Walkersville, Inc., Walkersville, MD, USA

    https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/CH/en/download/content/asset/36112

    Lonza、Akouos、およびMassachusetts Eye and Ear (MEE)は、聴覚障害および平衡障害に関する戦略的遺伝子治療ライセンス契約を発表しました(2017/11/30).

    LonzaとMEEは、すべての聴覚障害と平衡障害のために、プロプライエタリな先祖AAV(Anc-AAV)ベクトルの独占ライセンスをAkouosに付与した。

    Anc80は、約40,000種類の新規キャプシドのポートフォリオにおける主要なAnc-AAVであり、内耳での優れた遺伝子発現が可能な強力な遺伝子治療ベクターです。
    Akouosは、5AM Ventures、New Enterprise Associates、およびPartners Innovation Fundから750万ドル(8億円)のエクイティファイナンスを調達しています。

    Akouos

    2016年に設立され、感音性難聴の遺伝子治療薬の開発を進めており、MEEとLonzaとパートナーシップをムスクでいる。

    Individual by Investing.com (株価情報,会社概要)

    参考 – Lonza AAV関連のGoogle調査結果

    Google search “aav ancestral lonza”

    https://www.google.com/search?q=aav+ancestral+lonza&rlz=1C9BKJA_enJP861JP861&oq=aav+ancestral+lonza&aqs=chrome..69i57.606j0j4&hl=ja&sourceid=chrome-mobile&ie=UTF-8

    Lonza, Akouos and MEE Announce Strategic Gene Therapy License Agreements on Hearing and Balance Disorders

    Lonza to Offer Novel Anc-AAV Gene Therapy Technology Through Exclusive Licensing Agreement with Massachusetts Eye and Ear (HARVARD MEDICAL SCHOOL)

    Lonza to Offer Novel Anc-AAV Gene Therapy Technology Through Exclusive Licensing Agreement with Massachusetts Eye and Ear® (LONZA)

    Anc80L65 AAV vectors now available through VVF

    Going Viral: The Next Generation of AAV Vectors

    Delivering the next transccformative class of gene therapies

    Lonza in Gene-Therapy Pact

    Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction

    Akouos to Build Premier Gene Therapy Company Focused on Hearing and Balance Disorders with Backing from Leading Life Science Investors and Strategic Licenses from Massachusetts Eye and Ear and Lonza

    AKOUOS ANNOUNCES NEW DATA AT THE AMERICAN SOCIETY OF GENE & CELL THERAPY 2019 ANNUAL MEETING

    Applying old Know How to New Challenges: The Manufacturing of Emerging Therapeutic Modalities

    2019/12/09 はりきり(Mr)
    2020/05/07 追記 (rAAV製造における培養培地)

  • [Bio-rAAV] rAAV vector製造でplasmidを細胞に導入するトランスフェクション試薬 – ID3336 [2020/07/21]

    [Bio-rAAV] rAAV vector製造でplasmidを細胞に導入するトランスフェクション試薬 – ID3336 [2020/07/21]

    PEI

    Polyethylenimine (PEI)は、カルシウムよりも安定的に遺伝子を細胞に導入できます。そのトランスフェクション効率についても、研究が進められており、一般的なPEIより、10倍以上の効率が高められた製品も市販されています。

    医薬品の製造には、更に品質試験と品質管理された製品が必要です。

    • トランスフェクション効率
    • 品質
    • GMP適用品

    Polyplus Transfection社

    Polyplus社のサイト

    N/P ratio

    AAV2 production with optimized N/P ratio and PEI-mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3775943/

    FectoVIR®-AAV: a giant step for AAV large scale 

    https://insights.bio/cell-and-gene-therapy-insights/journal/articles/fectovir-aav-a-giant-step-for-aav-large-scale-manufacturing/

    Scalable Production of AAV Vectors in Orbitally Shaken HEK293 Cells

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6305802/

    Pharmaceutical Development of AAV-Based Gene Therapy Products for the Eye

    https://link.springer.com/article/10.1007/s11095-018-2554-7
  • [rAAV] rAAVのUSP/DSP – 製造方法 – emptyとfullの比重, 2015 – SM[2019/10/05]

    [rAAV] rAAVのUSP/DSP – 製造方法 – emptyとfullの比重, 2015 – SM[2019/10/05]

    rAAVの製造

    2015年時点のrAAV製造(Upstream, Downstream)に関するReview文献をもとに解説します.

    基本情報

    目的の遺伝子をAAVに包含させて作ったAAVベクターが、遺伝子治療薬になります。ここで、目的の遺伝子がAAVの殻に含まれていれば良いのですが、何も含まれない空の粒子も確率的には作られてしまいます。空の粒子をEmptyと言います。一途方の粒子をFullと言います。

    ウイルスを精製するには、従来から遠心、特に超遠心を使われてきました。精製目的のウイルスでも、中に何も入っていない殻と目的遺伝を含む粒子を分別精製するためにも、超遠心が使われます。手技も固まっており簡単なので、よく使われます。

    粒子の比重

    参考文献から、AAVの比重 (密度) の情報を抽出しました。

    • Full : 1.40 g/cm3
    • Empty ; 1.32 g/cm3
    • 可溶性タンパク質 : 1.3 g/cm3
    • 核酸 : 1.7 ~ 2.0 g/cm3 (24, 48)

    参考文献

    1. Overview of current scalable methods for purification of viral vectors – PubMed (nih.gov)
    2. Qu G., Bahr-Davidson J., Prado J., Tai., Cataniag F., McDonnell J., Zhou J., Hauck B., Luna J., Sommer J.M., Smith P., Zhou S., Colosi P., High K.A., Perce G.F., Wright J.F.
      Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography – PubMed (nih.gov). J. Viol. Methods. 2007; 140(1-2): 183-192. [PubMed]

    パーツの分子量

    rAAVの殻の部分は3種類のタンパク質でVP1, VP2およびVP3でできていますが、これらの総分子量は、600kDaです。そして、その空の中に収められるベクター遺伝子は、4.7kbpの長さで、その分子量は、170kDaです。前述の比重の差は、この分子量の差になります。

    • rAAV capsid protein (VP1~VP3): over 600kDa
    • rAAV vector (4.7kbp): over 170kDa

    超遠心以外の精製方法

    AAVは、負に荷電しています。したがって、陰イオン交換体 (AEX)に吸着性を示します。AEX resinとして、以下のものが使えそうです。ただし、最近の遺伝子治療薬としてAAVの精製方法に関する文献や特許を見ていると、その精製条件は、一般的な方法では、精製度をあげることは難しく、少し特異な条件を使用していることに目が惹かれます。例えば,pH10を超えるような条件で吸着させます。

    • Poros HQレジンによるクロマト精製
    • Poros PIレジンによるクロマト精製
    • Source 15Q レジンによるクロマト精製
    • Q-Sepharose レジンによるクロマト精製
    • HiTrap Q レジンによるrAAV1,2,4,5,6 and 8の精製

    文献

    1. Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties (2015)
    2. WO2010148143A1 – Improved methods for purification of recombinant aav vectors – Google Patents
    3. PEG-modulated column chromatography for purification of recombinant adeno-associated virus serotype 9 – PubMed (nih.gov)

    超遠心分析

    AAVサンプルを超遠心分析により、Emptyを含めた不純物を除くFullの純度分析が可能となります。

    • 1波長、干渉
      • サンプル量 : 260nmで0.2以上、1~2E12 vg/mL, 0.5mL以上

    [ignore]

    • 4サンプル ¥90万円

    [/ignore]

    • 2波長、干渉
      • サンプル量 : 同要件で1mL

    [ignore]

    • 4サンプル ブラス40万円

    [/ignore]

    • 別途
      • 宿主ウイルス
      • AAV Vector Plasmid
      • その他、情報
    編集履歴
    2019/10/15 Mr.Harikiri
    2020/10/01 追記 (文言整備)
    2020/11/10 超遠心分析
    2024/08/12 文言整備,引用文献の整備
  • [rAAV-Edu] rAAV9の精製方法 – 特許, 2017 – ID2566 [2023/10/23]

    [rAAV-Edu] rAAV9の精製方法 – 特許, 2017 – ID2566 [2023/10/23]

    概要

    リコンビナントAAV(rAAV)の大規模精製方法に関する方法特許(Method Patent)です.

    精製のためのスタート原材料は,rAAVを発現した細胞培養上清です.

    精製ステップは,2段のクロマトグラフィーになっています.1段目には,高い塩濃度で吸着が可能な疎水クロマト,2段目には,低塩濃度で吸着が可能な陰イオンクロマトです.

    以上のステップにより,目的遺伝子を包含していな不要なウイルス粒子を効率的に除去可能であるとしています.

    rAAV9の精製条件

    当該特許は、現時点では「国際調査報告公開」です。

    特徴的なのは、pH10.2を採用していることです。タンパク質にとってpH8以上のアルカリ性は、タンパク質に良い条件ではありません。それと、システイン残基のSS結合が緩むのが、pH8から上のpHです。それをpH10.2を使っているのは、それでしか精製できないからでしょう。ある程度のタンパク質の劣化を許容しているということですが,劣化も精製度もコントロールできるのであれば,品質上問題ではありません.ただし,その結果が効力や副作用などに影響する場合は,投与の仕方を工夫する必要性が生じるでしょうか,それも臨床試験で確認していけばいよのです(Mr.Harikir, 2020/10/01)

    • Buffer A: 20mM Bis-Tris propane (BTP), pH10.2
    • washing: 10mM NaCl, 20mM BTP, pH10.2
    • gradient: 10mM to 190mM NaCl
    • correct rAAV9 by A260/A280 ratio monitoring

    クレーム

    1. AAV9の分離方法.pH10.2条件下の陰イオン交換クロマトグラフィーに吸着し、塩濃度勾配で溶出させA260とA280でモニタリングし、A280/A280の比率でAAV9 full capsideを回収
    2. A260/A280比が1未満から1以上になる
    3. 溶出ピークにおける伝導度が20mMから190mN NaCl相当となる
    4. AAV9中間体は50nM(50mMばはないのか、typo? 各所み見られる) NaCl相当で溶出する
    5. 不純物が10%未満
    6. 純度は少なくとも95%
    7. many more

    国際特許の権利発生までのフローは、このリンクを参照のこと。

    国際特許検索は、このリンクを参照のこと。使用方法は、このリンクを参照.

    特許庁 実務者向け説明資料は、このリンクを参照のこと.

    文献

    特許

    WO 2017/160360 A9, SCALABLE PURIFICATION METHOD FOR AAV9

    https://patents.google.com/patent/WO2017160360A9/en

    編集履歴

    2019/10/15 Mr.HARIKIRI
    2020/10/01 追記(pH10.2について)
    2023/10/23 追記(pH10でウイルスの品質に影響はあるだろうが,開発段階では問題にせずに,先に進むのが良い)
    2023/10/24 追記(概要)
  • [rAAV-Edu] rAAV9の精製方法 (ウイルスの一般的な精製方法を理解できる) – 特許,2018 – ID2559 [2023/10/23]

    [rAAV-Edu] rAAV9の精製方法 (ウイルスの一般的な精製方法を理解できる) – 特許,2018 – ID2559 [2023/10/23]

    rAAV9 vectorの精製方法

    培養液のバッファ組成をTFF処理で調整、硫安(AmSo4)沈殿処理と第4級アンモニウム陰イオン交換クロマトグラフィー(HiPrep Q XL)によるFlow through mode、最後にSECによる精製でrAAV9を得る

    rAAV9 vectorの調製方法

    1. Transfection by 3 plasmid (with PEI, FBS-free)
      • 遺伝子治療用としてウイルス・ベクターを使用するはに,目的遺伝子,ウイルスの殻,それてHelper因子,など必要なコンポーネントとしてそれぞれの遺伝子をウイルス増殖用の細胞内に挿入させる.
    2. Post culture
      • 遺伝子を挿入した生産用細胞を培養する.
    3. Harvest supernatant
      • 培養上清からウイルスを取得する場合は,遠心上清を回収する.細胞内に存在するウイルスを取得する場合は,遠心の沈殿画分を回収する.
    4. TFF process
      • バッファ組成を整えたり,ウイルス濃度を高めたり,更に,ろ過液に不純物を透過させて不純物除去したりする.
    5. 1/3 sut. concentration AmSO4 precipitation
      • 疎水性を高くして不純物の沈殿化させる工程(塩析)
    6. centrifuge
      • 33%飽和濃度の硫酸アンモニウム処理して遠心により沈殿化した不純物を沈殿へ分離し上清を回収する.
    7. 1/2 sut. concentration AmSO4 precipitation
      • 更に,硫酸アンモニウムを添加して50%飽和濃度にすることで,更に分割沈殿化させる.
      • 急な塩濃度の上昇は,共沈するのでそれを避けるために分割操作を行う.
    8. centrifuge
      • 遠心して上清を回収する.
    9. Dilution to 7.3 mS/cm
      • カラムクロマトで処理できる条件に整えるために,上清を水(でよい)で希釈して伝導度を下げる
    10. AEX
      • HiPress Q XL 16/10 column chromatograph with flow through mode
    11. TFF process
      • 30kDa : ウイルスの濃縮
    12. SEC column chromatography
      • HiLoad 16/60 Superdex 200, MNH pH6.5, 300mM NaCl, 0.01% F-68

    Highly Efficient Ultracentrifugation-free
    Chromatographic Purification of Recombinant
    AAV Serotype 9

    https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/pdfExtended/S2329-0501(18)30111-6

    Improved methods for purification of recombinant aav vectors, EP2443233A1, 2009

    https://patents.google.com/patent/EP2443233A1/en

    編集履歴

    2019/10/15, Mr. Harikiri
    2023/10/23, 追記(永木の精製ステップについて日本語でコメント追加)

  • [rAAV] rAAVの精製方法 – 澄明ろ過及び膜による  – ID2532 [2019/11/05]

    [rAAV] rAAVの精製方法 – 澄明ろ過及び膜による – ID2532 [2019/11/05]

    rAAVの精製方法

    2016年の文献よりAAVの精製について解説する。また、Pall製品による精製についても解説する。

    文献によれば、最終的には超遠心によりAAVベクターを濃縮精製するが、その超遠心では、CsCl濃度勾配を使用しない方法を提供する。遠心操作を多用したAAVベクター精製は、遠心機があれば簡単に行える。

    • Transfection of HEK293, and post culture
      • 20 Flasks of T-150, Three (3) Plasmid PEI
      • (説明: フラスコでHEK293細胞を培養した後,ポリエイレンイミンでプラスミドを細胞内にトランスフェクションスル)
    • Centrifugation
      • 3,000 xg 10 min
      • (説明: 遠心で細胞画分を回収する)
    • (A) Lysis by Freeze-thaw, and (B) Nuclease, (C) sodium deoxycholate
      • (A) 50mM Tris-HCl, 0.15M NaCl, 2mM MgCl2, pH8, Dry ice – ethanol ←→ 37℃ 交互に細胞破砕
      • (B) Benzonase: 50 u/mL, RNase: 10U/mL, 37℃、30min
      • (C) 0.5% sodium deoxycholate, 37℃, 30min
      • (説明: 回収した細胞を凍結融解して破砕,Nucleaseで核酸を切断,Sodium deoxycholate処理する)
    • Centrifugation
      • 2,500 g x 10min/sup
      • Pooling with cell culture supernatant
      • (説明: 遠心して上清を回収する)
    • PEG 8000, NaCl Treatment / ppt
      • 8% PEG 8000, 0.5M NaCl by 40% PEG 8000, 2.5M NaCl
      • Incubation 1h , RT
      • (説明: 最終8% PEG, 0.5M NaClに調整し1時間室温で静置して沈殿化)
    • Centrifugation 2,000 g x 30min
      • Re-suspend with HEPES buffer
      • (説明: 遠心して沈殿を回収しHEPES バッファで沈殿を懸濁および融解する)
    • Chloroform Extraction / cfg-sup / Evaporate
      • Add equal volume of chroroform
      • Vortex going , 2min, RT
      • cfg (370 g x 5min)/supernatnat
      • Evaporate 30min, RT
      • (説明: HEPESバッファで懸濁・融解した液に対して,クロロホルム添加により,(おそらく)水相にAAVを抽出する)
    • PEG 8000, AmSO4 Treatment / AAV in sup
      • 10% PEG 8000, 13.2% AmSO4 pH8.0 adjusted by stocked solution
      • Incubation at RT
      • (Impurity salt out ppt), HEPES buffer pH has to be kept at pH8.0, AAV stable is Alkaline that acid
      • (説明: PEG8000と硫酸アンモニウムで不純物を沈殿化し,AAVを上清に回収する)
    • Dialysis using 50kDa
      • diluent: PBS or MEMEM media with 0.001% puluronic F68 for preventing the aggregation
      • (説明: 分画分子量50kDaのUF膜を用いてPBSまたはMEMEMにバッファ置換する.プルロニックF68は凝集抑制に効果がある)

    清澄ろ過

    Pall製品による清朝濾過。

    • PHD11 : cellulose based capsule
    • PDP8 + Bio 10 : Bio 10のみではろ過量が少ないが、PDP8の組み合わせで良好にろ過が可能

    AEX Membrane

    Pall 製品とこれらを用いたPallとのCo-Developingがサービスとして可能です。

    • Mustang Q membrane chromatography for enriched full capsids
      • Labの超遠心の代替
      • Mustang Membrane: 8000A pores vs polymer matrix:Packed 40-90μm beads 300-1000A pores
    • AAV5 gradient Elution by Mustang Q XT Membrane in Acrodisc Capsule
      • Step elution : Empty in 1st elution, full in 2nd elution
      • Peak 1 : 10 mS/cm, 13E11
      • Peak 2 : 14 mS/cm, 7E11
    • TFF
      • 100kDa for AAV, 300kDa for LV
      • TMP : 0.5 ~ 0.8 bar
      • Shear rate : <4,000 second-1 for hollow fibers; <4 L/min/m2 for cassettes.
      • J=K*ln(Cbulk/Cconc)

    文献

    Inexpensive, serotype-independent protocol for native and bioengineered recombinant adeno-associated virus purification

    http://www.jbmethods.org/jbm/article/download/102/90

    編集履歴

    2019/10/04 Mr.Harikiri
    2020/10/01 文言整備
    2020/11/05 追記 (Pall膜製品による精製 Pall Webinarより)
    2023/10/24 追記 (説明を追加)
  • [rAAV] Parvovirusに属するアデノ随伴ウイルス(AAV)をベクター(rAAV)にして遺伝子治療を行う — rAAVの特徴と臨床 (2003) – ID2516 [2019/10/02]

    [rAAV] Parvovirusに属するアデノ随伴ウイルス(AAV)をベクター(rAAV)にして遺伝子治療を行う — rAAVの特徴と臨床 (2003) – ID2516 [2019/10/02]

    AAVベクター

    Adeno associated virus (AAV) ベクター(rAAV : recombinant AAV)作成に関する現在の技術 (2019現在でも)では、Rep/Cap遺伝子と目的の治療用遺伝子(GOI)とは、別々のPlasmidで作り、それを混合体として細胞にトランスフェクションする方法が一般的である.即ち、野生型のAAVの感染状況とは異なる人為的な方法でウイルスが作られる.

    野生型(Wild type)のAAVの感染の場合、高い確率でターゲットとなっている染色体のある特定の位置に、そのAAVの遺伝子が組み込まれる。その位置は同定されている。

    しかし、rAAVによるGOIの染色体DNAへの組み込みは、Wild Type AAVの場合とは異なり、染色体に組み込まれたとしても稀で、しかもランダムの位置に導入される考えられている。

    AAVの血清型

    今回紹介する文献(2003年)では、当時で1から8型が知られていたようだ。血清型2, 3および5はヒトより分離されたもので、2型が最もよく研究されている。

    現在(2020)では、血清型9と10も知られており、血清型9では、脊髄性筋萎縮症(SMA)の遺伝子治療薬であるZolgensmaに使われている(2020/07/17追記)。

    ベクター種ごとの特徴

    • adeno associated virus( AAV )ベクターは、非分裂細胞への効率的な遺伝子導入と長期の遺伝子発現。他のウイルスベクターと比較してAAVの方が安全性に優れている。ただし、未分化な幹細胞への導入効率は低い。
    • レンチウイルスベクター(HIVベクターが代表的)は、AAVベクター同様に非分裂細胞への効率的な遺伝子導入と長期の遺伝子発現。静止期にある幹細胞に適しており、ES細胞に効率よく遺伝子導入できる
    • レトロウイルスベクター: 分裂細胞にしか遺伝子導入ができないため、造血系細胞への導入に絞られる
    • アデノウイルスベクター: 非分裂細胞への効率的な遺伝子導入が可能であるが、遺伝子発現は長期持続しない
    ウイルス種ターゲット発現持続性安全性
    AAVAAV1~10非分裂細胞長い高い
    LentivirusHIV非分裂細胞
    (ES細胞)
    長い
    Retrovirus分裂細胞
    (造血系)
    Adenovirus非分裂細胞短い

    AAVのウイルス学的特徴

    • AAVは、動物ウイルスの中で最も小型の線状1本鎖DNAウイルスであるパルボウイルス科(Parvoviridae)に属し、20-26nmの大きさで、ヒト成人での感染率は85%である。物理学的に極めて安定。
    • AAV2のReceptorはヘパラン硫酸が想定され、FGF receptorやαVβ5インテグリンなどもreceptorとして示唆されている。
    • AAV5のReceptorは、PDGF receptorであることが分かっている。

    Parvoviridaeは3属

    ここでは,AAVがどのウイルスに属しているのか,どんな特徴があるのか,について理解するために,その他のウイルスと比較する.

    1. Autonomous Parvovirus
      • バルボウイルス属
      • 複製にヘルパーウイルスを必要としない
    2. Dependovirus
      • ディペンドウイルス属
      • AAVのこと。複製にヘルパーウイルスを必要とする
      • 病原性は認められていおらず、血清型は1から8が知られている
    3. Erythrovirus
      • エリスロウイルス属
      • 人に感染するB19と猿パルボウイルスは、赤血球への特異性と特徴的な転写機構から区別されている

    AAVベクターとしての特徴

    ウイルスゲノムは約5kbの線状1本鎖DNA.ブラス鎖とマイナス鎖は半々。ゲノムの両端に145b長のITR (inverted terminal repeat)がT型ヘアピン構造で存在し、プライマーの役割となり複製時に機能すると共に、ウイルス粒子へのPackagingと宿主細胞染色体DNAへの組込みにも機能する。

    • AAVウイルスゲノム : 5kb,1本鎖DNA
    • ゲノムの両端に145bのinverted terminal repeat (ITR)を有する.
    • ITRは,T型ヘアピン構造をとっている.
    • ITRは,複製時にプライマー機能,ウイルス内へのPackaging,宿主染色体DNAへの組込機能を有する.具体的には,以下の通り.
    • p5プロモータからRep78, Rep68 (large Rep)のmRNAが転写: endonuclease, helical, ATPase は、プロモータ活性調節、ゲノム複製、宿主 第19版染色体長腕AAVS1領域(共通配列GAGCにRep78/Rep68が結合)へのゲノム組込み.
    • ただし、AAVベクターでは、ITRに続けてRepはコードさせず、GOIを配置するため、特定箇所への組込み機能は享受できないが、稀に組み込まれるとそれはランダムになる傾向があり、且つ、アクティブな遺伝子領域に起こりやすい.非分裂の場合、挿入変異を心配する必要はないと考えられる
    • p19プロモータからRep52, Rep40 (small Rep)のmRNAが転写: VP1, VP2, VP3のカプシド蛋白
    • 単独感染では、(A)潜伏感染のみで済むが、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスが重感染するとAAVが複製されることになり、(B)溶解感染となる
    • AAVベクターで導入された遺伝子は、ほとんどがエピソームとして存在していると考えられているため、増殖細胞の場合では、失われやすい.
    • ゲノムが1本鎖であることから遺伝子発現には2本鎖になるStepが必要であり、その効率が高くない場合は、大量のベクターを必要とする
    • 小型の粒子であることから、挿入できる遺伝子は小さくなる
    • 重複関連が可能なため、別々のベクターを使って足りないものを導入することが可能 (コンカタマー形成が可能であるため、別々に導入(スプリットベクター)しても細胞内で連結される性質を利用できる)

    臨床試験

    参考文献によれば、AAV2ベクターによる血友病Bの臨床試験: 筋肉では一部の患者で効果があった。現在、肝臓で試験中(ベクターゲノムが精液中に一過性に検出されたが、生殖細胞への遺伝子導入は確認されていない)

    以上

    参考文献

    1. ウイルス 第53巻 第2号 pp.163-170, 2003, http://jsv.umin.jp/journal/v53-2pdf/virus53-2_163-170.pdf
    2. Dependoparvovirus, ViralZone
    編集履歴 Mr.HARIKIRI
    2019/12/31 文言整備、少々追記
    2020/05/03 文言整備
    2020/07/17 追記(Zolgensma)
    2023/10/24 文言整備
  • [rAAV] AVB SepharoseによるrAAVの精製, 2009 – ID2461 [2019/09/28]

    [rAAV] AVB SepharoseによるrAAVの精製, 2009 – ID2461 [2019/09/28]

    はじめに

    rAAVを特異的に精製が可能なAffinity resingの紹介です.

    rAAV (recombinant AAV)は、天然に存在するAAV(ウイルス)を遺伝子改変したものです。一般的にウイルスの電荷は負であるため、精製純度を高めるには物性を利用して陰イオン交換体に吸着・溶出(AEX)させてる手順で可能です。しかし、負の電荷を持っている物質は、精製対象となるウイルスを含む培養液には,多種多様な不純物が含まれています.そのため、このAEXは特異的な精製方法ではありません。そこで、特異的にAAVに結合性を有する精製基材が求められています。

    特異的な精製基材

    AVB Sepharose (TM) によるsf9細胞由来のrAAVの精製

    以下は,サンプルとしてバキュロウイルスで発現させたAAVを使用し,AVB Sepharoseを用いた精製手順です.

    1. Sf9 cell (10e8)のバキュロウイルスによるTransfection 1hr処理
    2. その後3daysの培養後
    3. cellをharvestして、Detergent処理して抽出液を回収
    4. capside化しなかったDNAなどをBenzonase処理により分解処理
    5. Affinity Column精製 (10 mm x 100 mm, AVB Sepharose High Performance)
    6. Washing: PBS(pH7.4)
    7. Elution: low pH glycine-HCl (pH2.7)
    8. Elution peak tiger: 1.7 x 10e13 particles/mL
    9. Purity: >90% (4-12% SDS-PAGE)
    10. AAV-1のVP1(81.4kDa), VP2(66.2kDa), VP3(59.6kDa)

    Abbreviations: NRP, nuclease-resistant paticle; TU, transduction unit.

    評価

    nuclease resistance particles/cell: 3.7 x 10e4 ~ 9.6 x 10e4

    1. ウイルス粒子内にウイルスの遺伝子が完全にパッキングされていれば,necleaseによる抵抗性があるという意味.
    2. 今回の1 step精製方法による回収量は,1つの細胞当たりに3.7 x 10e4 ~ 9.6 x 10e4のnuclease抵抗性のウイルス粒子を回収できた.

    文献

    A Simplified Baculovirus-AAV Expression Vector System Coupled With One-step Affinity Purification Yields High-titer rAAV Stocks From Insect

    https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616308000

    編集履歴

    2019/09/28, Mr.Harikiri
    2022/01/12,追記(はじめに)
    2023/10/25,文言整備

  • [rAAV] 遺伝子治療薬としての遺伝子組換えAAV(rAAV)の沈殿法による精製のいろいろ – ID2452 [2019/09/27]

    [rAAV] 遺伝子治療薬としての遺伝子組換えAAV(rAAV)の沈殿法による精製のいろいろ – ID2452 [2019/09/27]

    はじめに

    遺伝子治療薬として、ヒトの細胞に感染させ目的の遺伝子をその細胞に導入するするために、目的遺伝子を封入したAAVベクターという器をきれいに精製する方法の紹介。

    PEG沈殿

    超遠心機を使用しないPEG 8000を使用した沈殿化精製条件でベクターとしてAAV2, AAV8を精製する。AAVベクターの精製をプラットフォーム化する 1)

    DNAはPEGの分子量が大きい程、沈殿化しやすい(PEG 6000, 30%)。また、沈殿化は、NaClやMgCl2で増強されるが、MgCl2の場合は、数mM濃度で沈殿化はトップとなりベルシェイプを呈する 2)

    クロロホルム沈殿法

    Chroloform沈殿法では、upper layerとbottom layerにそれぞれ水層とChroloform層の2層に遠心分離できる。Chroloform層には、lipidsが含まれ、それ以外の組成物は水層に含まれる 4)

    クロロホルム-メタノール沈殿法

    Chroloform-Methanol precipitationの方法論の基礎として、血漿1mLにChroloform-Methanol (2:1)を10mL電荷してタンパク質以外のトリグリセライドとコレステロールを水層に分離する方法 5).AAVベクターを上清に回収するには、おそらく66% Chroloformよりも低い濃度でないとlipidと共にChroloform層または沈殿として除去されると考えられる。当該1)文献では等量のChroloformを添加しているので50%濃度であるので、妥当な濃度であると考えられ。

    塩は、ダンパク質の凝集剤として使用される。ダンパク質間の静電相互作用を弱められ沈殿する

    有機溶剤は、溶液自体の導電率を低下させ、アミノ酸残機と相互作用 5)変性の状態へと状態が進む。軽い変性状態である場合、蛋白質の通常のFolding状態では内側に隠れている疎水性が表面に出でくるものとかんがえられ、それが相互に結合しやすいため、蛋白同士が凝集するものと考えられる。強い変性状態では、完全に変性すれば、ダンパク質は不溶性となる。高分子であるダンパク質の場合、排除体積効果による凝集と、アミノ酸残機との相互作用による溶解の両方の効果を考慮しなければならない 5)

    文献

    1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3374034/

    2)Polyethylene glycol and divalent salt-induced DNA reentrant condensation revealed by single molecule measurements†: https://www.researchgate.net/profile/Puneeth_Kumar_R/post/Why_and_how_does_PEG_precipitate_DNA_Why_is_it_better_than_isopropanol_to_reduce_the_polysaccharide_contaminants/attachment/59d62c5879197b807798ab8d/AS%3A346620320337920%401459652132379/download/Polyethylene+glycol+and+divalent+salt-induced.pdf

    3)DNA Condensation by Multivalent Cations: https://www.researchgate.net/profile/Puneeth_Kumar_R/post/Why_and_how_does_PEG_precipitate_DNA_Why_is_it_better_than_isopropanol_to_reduce_the_polysaccharide_contaminants/attachment/59d62c5879197b807798ab8e/AS%3A346620324532225%401459652133439/download/DNA+Condensation+by+Multivalent+Cations.pdf

    4)Protein precipitate forms at the interphase of a top aqueous layer(MeOH+H2O) containing salts, detergents, reducing agents, nucleic acids etc., and a bottom layer of chloroform containing lipids.

    5) Comparison of six methods for the extraction of lipids from serum in terms of effectiveness and protein preservation: https://pdfs.semanticscholar.org/44ca/c0638d3eb4d2648e2383c7f29130962931c2.pdf

    6) ダンパク質の凝集剤としての塩・有機溶剤・高分子

    編集履歴

    2019/09/27, Mr.HARIKIR

  • [rAAV] rAAVの従来からの精製方法 (PEG沈殿、超遠心), 2010 – ID2417 [2019/09/26]

    [rAAV] rAAVの従来からの精製方法 (PEG沈殿、超遠心), 2010 – ID2417 [2019/09/26]

    rAAV vectorの精製方法

    沈澱化と遠心分離、および超遠心機を使用する従来からのAAV精製方法を以下に2種類を示しました。工業化するには、超遠心機の使用は不適切です。何か代替できる方法に切り替える検討が工業化には必要です。具体的には、クロマトグラフィへの切り替えです。適切な吸着担体と詳細な条件検討により工業化を進める必要があります。

    Standard purificationOptimized purification
    TransfectionTransfection
    ⬇︎⬇︎

    Centrifugation (Cell Pellet by 2,500g x 10min)

    Same as left
    ⬇︎⬇︎
    Freeze-thaw Lysis (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM MgCl2, pH8.0)Same as left
    ⬇︎⬇︎
    cfg (2,500g x 10min)Same sa left
    ⬇︎⬇︎
    cfg-supcfg-sup + culture supernatant
    ⬇︎⬇︎
    ⬇︎8% PEG, 0,5M NaCl by adding 40% PEG 8000, 2.5M NaCl, 2h on ice    
    ⬇︎⬇︎
    ⬇︎cfg (2,500g x 30min)
    ⬇︎⬇︎
    ⬇︎cfg-ppt
    ⬇︎⬇︎
    ⬇︎

    Resuspend

    (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM MgCl2, pH8.0)

    ⬇︎⬇︎
    DNase Treatment (100U/mL, 1h, 37’c)Same as left
    ⬇︎⬇︎
    Ultracentrifugation (104,000g x 24h, 20’c)Same as left
    ⬇︎⬇︎
    Dialysis vs PBS (overnight)Same as left
    ⬇︎⬇︎
    Ultracentrifugation (182,000g x 24h, 20’c)Same as left

    まとめ

    上記表には,文献の精製手順の比較により,その詳細を示した.その内のOptimized Methodについて概略フローを,以下に示した.従来法と異なる点は,PEG8000による沈殿化である.

    Culture -> Cell -> Lysate -> Clarification -> Polyethylene Glycol (PEG) 8000 -> Ultracentrifugation -> Dialysis ->Ultracentrifugation

    注) UltracentrifugationをGradientと業界では読んでいるようで,おそよく塩化セシウムの濃度勾配を使用することが,それをGradientと称しているものと推察される.

    High AAV vector purity results in serotype- and tissue-independent enhancement of transduction efficiency

    編集履歴

    2019/09/26, Mr.HARIKIRI
    2023/10/25, 修正(まとめ)