カテゴリー
BIOLOGICS education Lab purification

[Bio-Lab] マニュアル式のラボスケール・カラムクロマトで蛋白質精製の条件を検討する – ID3106 [工事中]

[Bio-Lab] マニュアル式のラボスケール・カラムクロマトで蛋白質精製の条件を検討する – ID3106 [工事中]
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID:11143(2)
  • by Google Ads ID:11145
  • by Google Ads ID24747
スポンサーリンク
by Google Ads ID8603

はじめに

タンパク質精製の戦略

高価な装置が無くても始められる蛋白質の精製について解説する。

予算が少ない大学の研究室や高価な装置を整備できないベンチャーでの蛋白質精製について、タンパク質精製に関して初期教育、原理を理解しながらの目的蛋白質の精製サンプルの取得が可能である。

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417

取り敢えず、1mLカラムでのスモールスケールによるサンプル調製から、400mLカラム程度のスケールアップも可能です。

初期のサンプル調製においては、クロマト装置は重厚長大です。使用前と後のシステムの洗浄など、結構面倒です。こんな初期に使うものではありません。

AKTAの出番は、その先に待っています。そもそもタンパク質精製は、集中して条件設定を実施し短期間で片付けるのです。

編集履歴
2019/11/10 はりきり(Mr)
2020/06/19 追加 (未完)

準備

スポンサーリンク
by Rakuten ID:15895

情報収集

精製しようとしているタンパク質はなんですか? 精製タグは付いていますか? Refoldingは必要ないですか? 分子量を把握していますか? 等電点は? 疎水性?

タンパク質の情報

まずは、敵を知ることからです。情報を収集しましょう

  • アミノ酸配列 : 以下の情報を知るために必要です
    • 分子量
    • 等電点
    • 疎水性
  • 精製タグ : 精製タグは、最大でもHis-tag程度にしておきましょう。その他精製タグは、物性を変化させたり、活性にも影響します
    • His
    • GST
    • etc

出発材料

生産

  • 微生物培養 → Inclusion Body(この解説では、これを前提)
  • 動物細胞培養 → 培養上清

検討準備

目的蛋白質の測定法を考える (SDS-PAGE, ELISA, RPHA, 逆相HPLC、アフィニティカラム)

目的蛋白質についてRefoldingが必要か検討する。ここでは、Refoldingについては記載していない。

プレパックカラムは使わず、エンプティカラムにバルクのレジンを自己充填したカラムを使用する

クロマト装置は、基本的に必要ではなく、ピペット操作かペリスタリックポンプを使う

カラムサイズは、0.5mLから100mLを想定する。取得する蛋白質は、数mgから1g程度。

小さいカラムサイズでは、自然落下でクロマトを行う。

大きいカラムサイズではペリスタリックポンプを使用する

装置

SDS-PAGE装置
[Lab-Equip] SDS-PAGE電気泳動システム – ID9509 [2020/02/16]

Post Views: 51 SDS-PAGEシステム 硫酸ドデシルナトリウムを添加したポリアクリルアミド・ゲル・電気泳動は、タンパク質の純度を分析する最も一般的な方法です。40年前では、自作のゲルを1日かがりで作り、翌 […]

UVメーター(A280, A260なとを測定)
[Bio-Lab] NanoDrop – タンパク質濃度の測定 – ID9517 [2020/02/16]

Post Views: 46 少量でOD測定 4μLでUV スペクトルおよび固定波長も測定できます。タンパク質の条件等には、欠かせないアイテムです。 測定上の注意点 : 載せるサンプルの量が4μLと少ないため、乾燥した部 […]

ピペット、チップ
[Bio-Lab] Pipette – ID9523 [2020/02/16]

Post Views: 57 ピペット ThermoFisherの実験用のマイクロ・ピペットには、抗菌加工を施したタイプもあります。少し高価です。 ThermoFisher ピペットおよびピペットチップ

ペリスタリックポンプ
  • シリコンチュープ
  • シリコングリス
[Bio-Lab] MasterFlex Pump – ID9538 [2020/02/16]

Post Views: 56 MasterFlex Pump マスターフレックス・ポンプは、ラボにおけるタンパク質の精製には欠かせない機材です。バッファー組成を置換する場合にUF/DFシステムの構成に必要です。オープンカ […]

pHメータ
[Bio-Lab] HORIBA pH Meter – ID9527 [2020/02/16]

Post Views: 51 ハンディーpHメーター 100μLのサンプル液量があればpH測定可能。精度は型番により0.1, 0.01のタイプがある。 タンパク質の精製条件の検討には、同シリーズの電導率計とともに欠かせな […]

試験管
  • マルエムチューブSS14
  • 50mM遠心管

手順

1. 手順 – 装置、カラムの充填及びカラムの取り回し(マニュアル)

GE HealthcareのEmpty Columnにレジンを充填(0.5mL or 1mL)

カラムクロマトは、自然落下による(線速は大きくなるが、レジンの最大キャパシティより1/3程度低いアプライ量で行うため、クロマト自体に問題は少ないが、常に考慮する必要がある点である)。

フラクション回収は、6カラムボリューム(CV)

6CV分のバッファを調整しておき、順次カラムにアプライしてカラムからでる液をチューブで回収する

2. 手順 – 吸着条件の決定

各種バッファの準備

水洗いしたバルクのレジンを使って0.5mLカラムの準備 30%から50%程度のスラリでカラム充填する

カラムの洗浄と平衡化

血漿や培養液の前処理してアプライサンプルを準備する : 水と酸及びアルカリにより電気伝導度とpHの調整

アプライサンプルのロードとパスした未吸着画分の回収及び目的蛋白質の測定 : 身吸着画分の量が多い場合は、未吸着画分に更に水と酸及びアルカリを添加して吸着しやすく調整し、その未吸着画分をそのまま再アプライする。満足する未吸着画分量から、水と酸及びアルカリでの調整量を最終決定する。

3. 手順 – 洗浄及び溶出条件の決定(1)

アプライpHと同じpHで、塩濃度を確認する : ベースバッファを作成し、3M NaClで段階的になるよう塩濃度の異なるバッファを作成し、順次カラムにアプライしフラクションを回収する。蛋白質量を測定し、目的の蛋白質が洗浄画分に溶出されない条件を洗浄画分に決定、溶出が完了する条件を溶出条件に決定する。

4. 手順 – 強固に結合した目的物と不純物の存在について心証をえるための操作

6M 塩酸グアニジン(GuHCl)を0.5CVアプライ、水を5.5CVアプライし全てを回収する。この画分は、アプライサンプル、洗浄画分、溶出画分と一緒にSDS-PAGE分析を行う。目的蛋白質の染色バンドと同位置に対して、6M GuHCl画分にどれくらいの割合が含まれているか、不純物はどれくらいの割合が含まれているか確認する。

6M GuHCl画分中に容認できない量の目的蛋白質が含まれていた場合、上述の手順で6M GuHClの手前までの手順を再度実施する。その後、以下の手順に従い最適な溶出pHを決定する。

5. 手順 – 溶出条件の決定(2)

pHを上げるか下げるか方針を決定する。カラム内の塩濃度を下げるために水6CV添加する。溶出条件の決定(1)で実施したようにバッファを作成するが、今度は、異なるpHでNaCl濃度を決定していく。最後に6M GuHCl画分を回収し、前回と同様にSDS-PAGEを行い溶出効果の違いを確認する。洗浄する場合のpH及び溶出する場合のpHを、この検討から決定することができる。もしかすると洗浄のpHは溶出のpHと異なることもある。

今後、各手順の詳細や根拠は随時アップデートする予定、2019/11/10 by はりきり(Mr)

高価な装置が無くても始められる蛋白質の精製

マニュアル操作によるカラムクロマト条件の決定

蛋白質の精製を行おうと思う時は、その必要性に迫られてのことだと思うので、原材料は準備されているとの前提で、以下話を進めます。装置の洗浄やその他準備が必要ないため小回りが効き短時間で条件設定し精製品を取得できる

大学や高価な装置を整備できないベンチャーでの蛋白質精製についての初期教育はもとより目的蛋白質の精製品の取得に役立つ。例えば、ツール蛋白質の取得には有効である。

準備

目的蛋白質の測定法を考える (SDS-PAGE, ELISA, RPHA, 逆相HPLC、アフィニティカラム)

目的蛋白質についてRefoldingが必要か検討する。ここでは、Refoldingについては記載していない。

プレパックカラムは使わず、エンプティカラムにバルクのレジンを自己充填したカラムを使用する

クロマト装置は、基本的に必要ではなく、ピペット操作かペリスタリックポンプを使う

カラムサイズとして0.5mLから100mLは対応可能(数mgから1g程度まで取得可能。小さいカラムサイズでは、自然落下でクロマトを行う。大きいカラムサイズではペリスタリックポンプを使用する

手順

1. 手順 – 装置、カラムの充填及びカラムの取り回し(マニュアル)

SDS-PAGE装置

UVメーター(A280, A260なとを測定)

ピペット、チップ

ペリスタリックポンプ、シリコンチュープ、シリコングリス

HORIBA ハンディpHメータ及び伝道度メータ

マルエムチューブSS14, 50mM遠心管

GE HealthcareのEmpty Columnにレジンを充填(0.5mL or 1mL)

カラムクロマトは、自然落下による(線速は大きくなるが、レジンの最大キャパシティより1/3程度低いアプライ量で行うため、クロマト自体に問題は少ないが、常に考慮する必要がある点である)。

フラクション回収は、6カラムボリューム(CV)

6CV分のバッファを調整しておき、順次カラムにアプライしてカラムからでる液をチューブで回収する

2. 手順 – 吸着条件の決定

各種バッファの準備

水洗いしたバルクのレジンを使って0.5mLカラムの準備 30%から50%程度のスラリでカラム充填する

カラムの洗浄と平衡化

血漿や培養液の前処理してアプライサンプルを準備する : 水と酸及びアルカリにより電気伝導度とpHの調整

アプライサンプルのロードとパスした未吸着画分の回収及び目的蛋白質の測定 : 身吸着画分の量が多い場合は、未吸着画分に更に水と酸及びアルカリを添加して吸着しやすく調整し、その未吸着画分をそのまま再アプライする。満足する未吸着画分量から、水と酸及びアルカリでの調整量を最終決定する。

3. 手順 – 洗浄及び溶出条件の決定(1)

アプライpHと同じpHで、塩濃度を確認する : ベースバッファを作成し、3M NaClで段階的になるよう塩濃度の異なるバッファを作成し、順次カラムにアプライしフラクションを回収する。蛋白質量を測定し、目的の蛋白質が洗浄画分に溶出されない条件を洗浄画分に決定、溶出が完了する条件を溶出条件に決定する。

4. 手順 – 強固に結合した目的物と不純物の存在について心証をえるための操作

6M 塩酸グアニジン(GuHCl)を0.5CVアプライ、水を5.5CVアプライし全てを回収する。この画分は、アプライサンプル、洗浄画分、溶出画分と一緒にSDS-PAGE分析を行う。目的蛋白質の染色バンドと同位置に対して、6M GuHCl画分にどれくらいの割合が含まれているか、不純物はどれくらいの割合が含まれているか確認する。

6M GuHCl画分中に容認できない量の目的蛋白質が含まれていた場合、上述の手順で6M GuHClの手前までの手順を再度実施する。その後、以下の手順に従い最適な溶出pHを決定する。

5. 手順 – 溶出条件の決定(2)

pHを上げるか下げるか方針を決定する。カラム内の塩濃度を下げるために水6CV添加する。溶出条件の決定(1)で実施したようにバッファを作成するが、今度は、異なるpHでNaCl濃度を決定していく。最後に6M GuHCl画分を回収し、前回と同様にSDS-PAGEを行い溶出効果の違いを確認する。洗浄する場合のpH及び溶出する場合のpHを、この検討から決定することができる。もしかすると洗浄のpHは溶出のpHと異なることもある。

今後、各手順の詳細や根拠は随時アップデートする予定、2019/11/10 by はりきり(Mr)

スポンサーリンク
  • by Amazon ID13211
  • by Amaozn ID13196

用語の解説、関連タグ付き投稿の抽出

protein-purification

[Bio-Lab] 実験の自動化 – 小型PLCでUF/DF工程を低コストで自動化する – ID 16252 [2020/05/25]
[Bio-Edu] 沈殿化法によるタンパク質の回収・分離 – 検討方法 – △ ID4376 [2020/12/11]
[Bio-Edu] 細菌・ウイルスをフィルターろ過で除去する – △ID11548 [2020/05/25]
[Bio-Lab] マニュアル式のラボスケール・カラムクロマトで蛋白質精製の条件を検討する – ID3106 [工事中]
[Bio-Edu] タンパク質の沈殿化法の原理 – ID2669 [2019/11/02]
[Bio-Edu] タンパク質(蛋白質)の精製 – 基礎編 – 不純物の定義、RefoldingからUF膜精製、タンパク質精製の定石まで – そしてタンパク質を知る – ID686 [2021/06/03]

カラム操作

[Bio-Lab] マニュアル式のラボスケール・カラムクロマトで蛋白質精製の条件を検討する – ID3106 [工事中]

条件検討

[Bio-Lab] マニュアル式のラボスケール・カラムクロマトで蛋白質精製の条件を検討する – ID3106 [工事中]
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID24747
  • by Google Ads ID:11143(2)
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID:11145

Update ID21920

english
今日の英語 – おそらく聞いたことがあるでしょう; you have probably heard of – [2021/11/16]

Post Views: 1 ID31791 目次1 You’ve probably heard of A/B testing for website optimization.1.1 参照した文章2 編集履歴 […]

plugin, WordPress
[WP-Plugin] WP-OptimizeからW3 Total Cacheに変更 ID19320 [2021/10/25]

Post Views: 1 キャッシュ プラグイン サイト読み込みの高速化にはキャッシュを使用することが1つの方法です。約1年前にW3 Total Cache (W3TC)をテストしたことがあります。当時は、Cache […]

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
HEALTH
[健康] お湯でも「しみる歯」のケア – 劇的に効果があったGUM PROCARE (7日間集中ケア) – ID31741 [2021/10/10]

Post Views: 5 目次1 はじめに2 お湯やお茶でしみるようになるまで3 集中ケア4 歯磨きの方法5 まとめ6 編集履歴 はじめに 歯がしみることを知覚過敏と言われたりしますが、厳密には過敏ではなく、歯の神経が […]

更新された投稿の最新順

スポンサーリンク
  • by Amazon ID13339
  • by Amazon ID19245
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID24747
  • by Google Ads ID:11145
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID:11143(2)

最新記事(Biologics, ID:14673)

BIOLOGICS, manufacturing, safety
[用語] ADC : – Antibody Drug Conjugates – ID27100 [2021/01/19]

Post Views: 2 目次1 ADC2 編集履歴 ADC Antibody-Drug-Conjugatesの略号。 抗がん剤などのDrugをある組織に特異的に届けたい場合に、その組織に特異的なモノクローナル抗体(A […]

AAV, BIOLOGICS
[rAAV-Edu] rAAVベクターのFull/Empty ratioの改善のヒント

Post Views: 2 ID32218 目次1 Full & Empty ratio2 考察3 編集履歴 Full & Empty ratio rAAV Vectorの実製造にあたって、ウイルス粒子に […]

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
BIOLOGICS, manufacturing, safety
[用語] CMC; Chemistry, Manufacturing and Contorl – ID27100 [2021/01/19]

Post Views: 4 目次1 CMC2 編集履歴 CMC CMCとは、Chemistry, Manufacturing and Controlの略です。治験薬製造と製造承認申請、商用製造に関わる仕事全判を示します。 […]

BIOLOGICS, company, J&J, vaccine
[Vc] 各社が開発したCOVID-19ワクチン情報リンク – [2021/10/08]

BioNTech社とPfizerが共同開発するmRNAをベースの新型コロナウイルス感染症に対するワクチンです。開発ワクチンは、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン(receptor binding domain; RBD)をコードするヌクレオチド修飾メッセンジャーRNAをベースにしている(BNT162b2)

BIOLOGICS, CMO, kaneka
気になる企業 – Kaneka Eurogentech S.A. – バイオCDMO – ID30924 [2021/08/05]

Post Views: 17 Kaneka Eurogentech ベルギー, 1985年設立 2010年にKanekaに買収された 2017年にKaneka Eurogentechに社名変更 バイオCDMO GMP D […]

BIOLOGICS, company, J&J, vaccine
[Vc] J&J/Janssen – 新型コロナウイルスに対するワクチン – ID29399 [2021/08/02]

BioNTech社とPfizerが共同開発するmRNAをベースの新型コロナウイルス感染症に対するワクチンです。開発ワクチンは、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン(receptor binding domain; RBD)をコードするヌクレオチド修飾メッセンジャーRNAをベースにしている(BNT162b2)

Page: 1 2 70
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID24747
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID:11145
  • by Google Ads ID:11143(2)

最新記事(Education)

BIOLOGICS, culture, education
[Bio-Culture] 大腸菌; E.coliの増殖率は細胞長の増大に関わる – ID28121 [2021/02/27]

Post Views: 48 目次1 大腸菌の増殖率2 編集履歴 大腸菌の増殖率 一般的に、大腸菌の増殖率(growth rate)、1時間あたり1未満であり、それを超える増殖率になってくると、大腸菌の長さが増大するのだ […]

BIOLOGICS, culture, education
[Bio-Culture] Poloxamer 188 – バイオリアクターの撹拌翼による細胞のダメージを抑制 – ID28021 [2021/02/24]

Post Views: 45 目次1 Poloxamer 1882 毒性2.1 動物の静脈内注射 (Poloxamer)2.2 ヒトの静脈内注射 (Poloxamer 188)2.3 創傷治癒2.4 動物実験2.5 AM […]

BIOLOGICS, education, purification
[Bio-Edu] イオン交換クロマトグラフィの原理 – バイオロジクスの製造における基本 – ID27722 [2021/02/13]

Post Views: 52 目次1 イオン交換の原理を使ったクロマトグラフィ2 実務では3 原理4 なぜpHを上げていくと電荷がマイナスチャージになるのか4.1 pHの理解5 編集履歴 イオン交換の原理を使ったクロマト […]

AAV, BIOLOGICS, education
[Bio-Edu] ウイルスの等電点(pI) – 組換えAAVでは,empty/fullの違いでpIは異なる – 分離精製は工業化の課題である △- ID24561 [2021/02/23]

Post Views: 60 目次1 はじめに2 ウイルスの等電点(pI or IEP)3 ウイルスの等電点の検証結果の詳細4 AAV1~AAV10のpI計算5 AAV8, AAV9のpI6 AAV tree7 編集履歴 […]

BIOLOGICS, education
[Bio-Edu] DNAとRNAの違い – レジメ – ID24191 [2020/10/11]

Post Views: 57 目次1 DNARNAの違い1.1 3つの部品単位 DNARNAの違い DNAはRNAの設計図になります。RNAは、タンパク質の設計図になります。 DNAを設計図にして、RNAポリメラーゼ […]

BIOLOGICS, education
[Bio-Education] 医薬品の開発スケジュール – ID23493 [2021/04/08]

Post Views: 51 目次1 医薬品の開発スケジュールの概要2 バイオロジクスの開発における細胞株から製造方法3 Cell Bankの作成3.1 Fraunhofer ITEMのサービスから4 ICHQ5D5 編 […]

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
Page: 1 2 14
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID24747
  • by Google Ads ID:11143(2)
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID:11145

その他記事(ALL-RANDOM, ID:16786)

BIOLOGICS, equipment-ufdf
[Bio-Equip] UF/DF System – ID16605 [2020/06/01]

Post Views: 57 TFF System: Allegro System TFF Systemは、PallのAllegro System (3/8インチ) Allegro, Pall https://biote […]

BIOLOGICS, education
[Bio-Edu] 細菌・ウイルスをフィルターろ過で除去する – △ID11548 [2020/05/25]

Post Views: 46 目次1 はじめに2 細菌のろ過による除去3 ウイルスのろ過による除去4 まとめ5 編集履歴 はじめに バイオ医薬品の製造において、製品段階では細菌が含まれないことを保証する必要があります。 […]

Synology, WordPress, YouTube
[Synology] NAS – Photo Stationに保管しているファイルをYouTubeにアップする機能を試してみた – 「ロンドンからスカボロ城へ行く(2016)」- ID3200

Post Views: 46 目次1 ‪PhotoStation1.1 YouTubeへのアップロード1.2 ブログからのリンク方法2 編集履歴 ‪PhotoStation 以前旅行した時の写真のスライドショーは、Syn […]

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
スポンサーリンク
by Google Ads ID:11143(2)

- 以下のツールに敬意を示します -
Support to AMP (Accelerated Mobile Pages) by official AMP plugin for WordPress, and compatible powered by
Post viewing : Flex Posts - Widget and Gutenberg Block