カテゴリー
BIOLOGICS education purification

[Bio-Edu] タンパク質の沈殿化法の原理 – ID2669 [2019/11/02]

[Bio-Edu] タンパク質の沈殿化法の原理 – ID2669 [2019/11/02]
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID:11145
  • by Google Ads ID24747
  • by Google Ads ID23293
スポンサーリンク
by Google Ads ID8603

はじめに

無機塩の高濃度添加は、タンパク質を沈殿させる基本です。塩を添加することでタンパク質の疎水性という物理的性質の強度を溶液中で強めることが目的です。疎水性が高まると疎水性を示すタンパク質の領域が、親水を避けて互いにより集まり結合します。タンパク質のアミノ酸の含有比率に応じて、タンパク質毎に沈殿化する塩の種類、濃度、溶液pH、及び当該タンパク質のタンパク質濃度に応じて重合化し、やがて沈殿化します。

  • タンパク質濃度
    • 沈殿とは分子同士が互いに寄り添い凝集することです。その基本原理からすると、沈殿させたいタンパク質の濃度が高いほど、沈澱しやすくなることは容易に理解できます。
  • タンパク質の分子量
    • 分子量が大きいほど、疎水性のアミノ酸の総数は一般論として多くなることは理解できます。すなわち、疎水性アミノ酸が増えるので沈殿になりやすいのです。
  • タンパク質のアミノ酸組成の比率
    • これは、上述のタンパク質の分子量から推定するよりは、直接的に評価できる指標です。ただし、分子の立体構造上で表面に出ている疎水性のアミノ酸として多いほどという条件も付きます。
  • タンパク質のフォールディング(立体構造)の状況
    • タンパク質のフォールディングの状態とはなんでしょうか。タンパク質は、基本的に1本のペプチドの鎖が、巻き、折畳まることで、その天然の立体構造としての状態になります。この状態が、最も血液に溶けやすくなっているのです。すなわち、疎水性のアミノ酸は内側に、親水性親水性のアミノ酸は外側に配置されることになります。ミスフォールディングすると、その状態が不整合しているため疎水性アミノ酸が外側に多く出ている状態が起こり得て、そのため分子間での疎水性同士の結合インタラクショにより沈殿形成しやすくなります。
  • 溶液のpH
    • これは、私の経験則ですが、理由をよく考えると理解ができるものと思っています。ただ、今までよく考えて小なったので、経験則だけで説明します。バッファ組成を酸性にすると疎水性が高まり、逆にアルカリ性にすると疎水性が低下します。
    • この原理を利用して、クロマトグラフィのカラムのレジンの洗浄・再生処理には、強アルカリ性のバッファが使われます。
  • 溶液の温度
    • 反応論や溶解度の話になります。温度が高いと分子のブラウン運動が大きくなり、溶解度は一般的に高くなります。逆に、温度が低くなるとブラウン運動は低下し、溶解度は低くなります。すなわち、温度が低いほど沈澱になりやすいと推察されます。しかし、反応論的には、反応しずらくなるため、疏水性を利用する疏水クロマトにおいては、タンパク質のレジンに対する反応としての吸着性は低下するため、低い温度での疎水クロマトはワークしなくなります。
  • 溶液の初期の塩濃度
    • 塩析させる場合、塩濃度を高めるので、単純に初期の濃度を問題にしているだけです。
  • 無機塩の種類と濃度
    • 塩析させやすい塩が知られています。硫酸アンモニウムがそれです。でも、疏水クロマトにはあまり相性が良くありません。そこで、もっとマイルドなNaClや、クエン酸(Na)などが使われます。

塩を添加する方法による沈殿化の手法は、タンパクの精製に適するレジン(樹脂)がなかった昔に多用された技術です。この技術にはデメリットもあります。沈殿化したタンパク質は、沈澱を作る過程から状態を維持する過程で、タンパク質変性のリスクが高まります。理由は、沈殿化により、必要以上に強固に寄り集まったタンパク質が、水溶液に戻すときに再溶解しない場合がある事です。再溶解時に溶解しやすいようにする添加剤としての補助的に働くものがあります。グリシンなどのアミノ酸などは、その一種と考えられます。

タンパク質の沈殿化法による精製手法の代替法が存在します。以下の課題について解決し得る方法です。それは、疏水クロマトグラフィー(HIC)です。ここでは、HICについては論じていません(はりきり)。

沈殿化法の課題

  • 沈殿化したタンパク質には再溶解の困難性というリスクがあること
  • 工業的に遠心機を使用しにくいこと
  • 取扱いとして液状での操作が悪いこと

ホフマイスター系列

スポンサーリンク
by Rakuten ID:15895

1888年からのHofmeisterらの色々な塩を使った塩析実験から得られた塩析の強さは、ホフマイスター系列と呼ばれます。塩析効果の高い塩は利尿作用があり、逆溶解させる塩は下痢作用があると記述があります。

タンパク質の凝集剤としての塩・有機溶媒・高分子 (2015), 生物工学, 第93巻

https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9305/9305_tokushu_1.pdf

デバイ – ヒュッケル理論

静電相互素作用が主たる原理であるとするとデバイーヒュッケル理論で説明できる。しかし、実際には、タンパク質の塩析曲線はベルシェイプを示し、塩の種類によって異なる曲線を示すとの報告(1932年のGreenら)がある。すなわち、静電相互作用だけでは説明がつかず、別の相互作用や水の構造変化が影響していとる予想されていた。

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417

イオンは水の水素結合結合ネットワーク

しかし、イオンは水の水素結合結合ネットワークに影響を与えないという論文が報告(2003)され、溶液中の水の構造を変えるのではなく、タンパク質の表面にある水和水に影響して、タンパク質の性質に影響しているのであろうと考えられた。

その理屈は、コスモトロープが水和水の秩序化→表面張力の増加→溶液は表面を減らす→タンパク質が凝集する。この理論は、リゾチームの凝集速度と溶液の表面張力の間に、正の相関があるとの結果と矛盾しない。

塩の種類により水和水の量に変化を生じさせていることについては、選択的相互作用の量として定義すると、

選択的相互作用の量 =塩(溶質)がタンパク質に結合している量 − 水和水により脱離してしまつた溶質の量、と定義する。値が正であれば、結合している溶質の量の方が多い、負であれば、結合している水和水の量の方が多い。

硫化物イオンの選択的相互相互作用の量は、塩化物イオンより小さい値を示すし、硫化物イオンは、塩化物イオンと並べて、タンパク質表面から選択的に排除されていることになる。

ホフマイスター系列

塩析する能力を示す。

塩析しやすい (コスモトロープ) > CO3 > SO4 > H2PO4 > F > Cl > I > SCN > NH4 > K > Na > Li > Ca > Mg > 溶解 (カオトロープ)

ホフマイスター系列は、周期表との規則性が見られる。

ハロゲン属では、 周期表順に同じく、

塩析しやすい > F > Cl > Br > I > 溶解

である。

アルカリ金属のカチオンでは、前述の逆となっている。したがって、沈殿材傾向は、イオンの半径や電子密度、質量で説明できることを示唆している。ただし、硫酸イオンやグアニジウムイオンなど複雑なイオンとは別の説明が必要と考えられる。

タンパク質の溶解度

一般的に、タンパク質の溶解度は、イオン濃度を増加させると増加し、それは極大値があり、ベルシェイプを示す。

デバイーヒュッケルの理論

デバイーヒュッケル理論で説明すると、塩を添加していくと、溶解から凝集まで一直線に状態変化する。低濃度では、静電遮蔽によってタンパク質の分子間の反発力が静電遮蔽により弱まる→分子の容積が減る→溶解度が増す、と説明できる。更に塩を加えていくと、タンパク質間のファンデンワールス力や疎水性相互作用などの引力が強まる→凝集する、と説明できる。しかし、実際には、溶解→凝集→溶解なるため矛盾がある。

コスモトロープ

水の水素結合ネットワークを秩序化(コスモス)する。

タンパク質表面の水和水について考えてみると、溶解状態のタンパク質液が、凝集するまでのイベントは、以下の様になる。

「秩序化」→「気液界面の表面張力を増加させる」→「広くなった界面は不安定になる」→「溶液は安定化させようとする」→「表面を枯らそうとする→タンパク質はより集まる」→「凝集する」

カオトロープ

水の水素結合ネットワークを無秩序化(カオス)する。溶解する理論すは、上述の逆の理屈である。

表面張力

水和を理解するための指標の一つ。surface tension, 表面をできるだけ小さくしようする性質。

有機溶剤

古くからDNA/RNAの沈殿材として用いられてきた。タンパク質への応用はアルコールによる血漿タンパク質の沈殿法から始まっている。

原理は、水溶液の伝導率を低下させ、タンパク質間の静電反発力を強める結果、溶解度が減少するといわれるが、それだけではなく、有機分子とタンパク質の相互作用についても考慮する必要がある。

エタノールとジオキサンの検討では、アミノ酸やペプチドの有機溶剤に対する溶解度を調べた論文では、疎水性側鎖を安定化させ、親水性の側鎖やペプチド結合を不安定化させることがわかっている。

還元Albの検討では、エタノールは、タンパク質の疎水性部分と相互作用し変性させながら溶解度を上げるが、荷電残基の影響によりタンパク質の溶解度は低下した。

ハロゲン系アルコールの検討では、50%トリプルオロエタノール中では、主鎖の間にできる水素結合が弱められる結果、αベリックス構造に富んだ構造に変性するが、溶解度は高くなり、最終的には、透明なゲルになる。

エタノール中でのタンパク質の凝集の制御は、わずかなpHシフトにより可能である。凝集を防ぐにはpHをpIから外すことである。

①構造変化を伴う疎水性の変化

②溶液の伝導率の低下

③相互の非極性領域の相互作用

④相互の荷電残基の相互反発

高分子

高分子の中でもPEGは無毒であり、よく使用され、無荷電である。PEGは、タンパク質の選択的水和を促す。

芳香属アミノ酸では、その溶解度は増加する。高分子が存在すると、タンパク質が存在できる空間が狭くなる。これを排除体積効果という。

PEGは、以下の2つの作用を有する。

① 排除体積効果によるタンパク質の安定化と凝集

②弱い変性作用(疎水性アミノ酸に結合)によるタンパク質の不安定化と溶解促進

また、高分子は、タンパク質のFoldingにも影響し、高濃度のPEGや多糖では、変性状態を不安定化させるので、ネイティブ構造が安定化し、Folding速度が増加する。

編集履歴

2020/11/02 追記 : はじめに
2021/05/21 文言整備
2021/06/01,追記(「はじめに」の説明を更に補充)

関連記事

BIOLOGICS, education, purification
[Bio-Edu] 沈殿化法によるタンパク質の回収・分離 – 検討方法 – ID4376 [2020/12/11]

Post Views: 55 目次1 はじめに1.1 Ribonuclease Aの沈殿精製2 トラディショナルな沈殿法2.1 参考3 検討方法3.1 マイクロサイズ法3.2 操作法3.3 分析4 まとめ はじめに Ri […]

BIOLOGICS, education, purification
[Bio-Edu] タンパク質の沈殿化法の原理 – ID2669 [2019/11/02]

Post Views: 52 目次1 はじめに2 ホフマイスター系列2.1 デバイ – ヒュッケル理論2.2 イオンは水の水素結合結合ネットワーク2.3 ホフマイスター系列2.4 タンパク質の溶解度2.5 デ […]

AAV, BIOLOGICS, purification
[Data Link] rAAV vectorの沈殿法を使った精製方法に関する文献のリンク – ID745

Post Views: 48 文献情報のみ A simplified purification method for AAV variant by polyethylene glycol aqueous two-phas […]

タンパク精製

[Bio-Edu] IgGの精製はProtein Aに対する親和性を利用する – 溶出バッファは何を使う? – ID7074 [2021/02/04] はコメントを受け付けていません
[rAAV-Edu] rAAV9の精製方法 – 特許, 2017 – ID2566 [2019/10/05] はコメントを受け付けていません
[rAAV] PEG沈殿法によるrAAVの精製手順, 2012 – ID2429 [2019/09/26] はコメントを受け付けていません
[Bio-Lab] 実験の自動化 – 小型PLCでUF/DF工程を低コストで自動化する – ID 16252 [2020/05/25] はコメントを受け付けていません
[Bio-Edu] 沈殿化法によるタンパク質の回収・分離 – 検討方法 – ID4376 [2020/12/11] はコメントを受け付けていません
[Bio-Edu] 細菌・ウイルスをフィルターろ過で除去する – ID11548 [2020/05/25] はコメントを受け付けていません
[Bio-Lab] マニュアル式のラボスケール・カラムクロマトで蛋白質精製の条件を検討する – ID3106 [工事中] はコメントを受け付けていません
スポンサーリンク
  • by Amazon ID13339
  • by Amazon ID19245

用語の解説、関連タグ付き投稿の抽出

precipitation

[Bio-Edu] 沈殿化法によるタンパク質の回収・分離 – 検討方法 – ID4376 [2020/12/11]
[Bio-Edu] タンパク質の沈殿化法の原理 – ID2669 [2019/11/02]
[Data Link] rAAV vectorの沈殿法を使った精製方法に関する文献のリンク – ID745

protein-purification

[Bio-Lab] 実験の自動化 – 小型PLCでUF/DF工程を低コストで自動化する – ID 16252 [2020/05/25]
[Bio-Edu] 沈殿化法によるタンパク質の回収・分離 – 検討方法 – ID4376 [2020/12/11]
[Bio-Edu] 細菌・ウイルスをフィルターろ過で除去する – ID11548 [2020/05/25]
[Bio-Lab] マニュアル式のラボスケール・カラムクロマトで蛋白質精製の条件を検討する – ID3106 [工事中]
[Bio-Edu] タンパク質の沈殿化法の原理 – ID2669 [2019/11/02]
[Bio-Edu] タンパク質(蛋白質)の精製 – 基礎編 – 不純物の定義、RefoldingからUF膜精製、タンパク質精製の定石まで – そしてタンパク質を知る – ID686 [2021/06/03]

タンパク質

[健康] 筋肉量を増やす – 体タンパク質を合成するめために利用されるタンパク質量は2g/kg/day – ボディビルに関わるタンパク質の摂取量とは – ID23968
[Bio-Edu] タンパク質の沈殿化法の原理 – ID2669 [2019/11/02]

たんぱく質

[Bio-Edu] タンパク質の沈殿化法の原理 – ID2669 [2019/11/02]

塩析

[Bio-Edu] タンパク質の沈殿化法の原理 – ID2669 [2019/11/02]

蛋白質

[Bio-Edu] タンパク質の沈殿化法の原理 – ID2669 [2019/11/02]
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID24747
  • by Google Ads ID:11145
  • by Google Ads ID23293

Update ID21920

plugin, Synology, WordPress
[WordPress] スパム・コメント対策にreCaptchaプラグイン – 更に、「Statify」/ 「SiteGuard WP」でログイン画面の守りを固める – セキュリティ対策

Post Views: 44 ID4929 [2021/09/17] 目次1 はじめに2 試したプラグイン3 プラグイン3.1 reCAPTCHA in WP comments form3.2 reCaptcha by […]

plugin, Synology, WordPress
[WordPress] 自宅サーバーのWordPress – プラグインで致命的なエラーにより管理画面(ダッシュボード)に入れなくなった場合の対処法 – ID4394

Post Views: 41 目次1 プラグインによる致命的なエラー2 エラーしたプラグイン3 復旧4 WordPressの裏口から5 分かったこと6 復旧手順が書かれた受信メール プラグインによる致命的なエラー どなん […]

更新された投稿の最新順

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
スポンサーリンク
  • by Amaozn ID13196
  • by Amazon ID13211
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID:11145
  • by Google Ads ID24747

最新記事(Biologics, ID:14673)

BIOLOGICS, CMO, kaneka
気になる企業 – Kaneka Eurogentech S.A. – バイオCDMO – ID30924 [2021/08/05]

Post Views: 9 Kaneka Eurogentech ベルギー, 1985年設立 2010年にKanekaに買収された 2017年にKaneka Eurogentechに社名変更 バイオCDMO GMP DN […]

BIOLOGICS, company, J&J, vaccine
[Vc] J&J/Janssen – 新型コロナウイルスに対するワクチン – ID29399 [2021/08/02]

BioNTech社とPfizerが共同開発するmRNAをベースの新型コロナウイルス感染症に対するワクチンです。開発ワクチンは、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン(receptor binding domain; RBD)をコードするヌクレオチド修飾メッセンジャーRNAをベースにしている(BNT162b2)

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
BIOLOGICS, culture, equipment-harvest, repligen
[Bio-Equip] TFDF – TFFの構造にdepth filterを採用して、高細胞濃度でも濾過能力を高める技術 – REPLIGEN – – ID30880 [2021/07/26]

Post Views: 8 目次1 TFDF2 編集履歴 TFDF 旧来からのTangential Flow Filtration (TFF)技術による濾過機材製品は、低濃度の細胞密度である培養液の濾過には十分に能力を発 […]

BIOLOGICS
[Bio-Process] 配列からベクターDNAを作るまでの概要 – ID16682

Post Views: 18 遺伝子配列からベクターDNAを作る plasmid vector 遺伝子配列 コドン最適化 遺伝子合成 合成遺伝子をベクターにカセットする 大腸菌にトランスフェクションして増やす ampic […]

BIOLOGICS, medicine, product
[抗体医薬] ADUHELM (アデュカヌマブ) – アルツハイマー病、初めての抗体医薬による治療薬 – アミロイドβを取り除く- ID30418 [2021/06/08]

Post Views: 16 目次1 アデュカヌマブ1.1 バックグラウンド2 臨床試験2.1 プロトコル2.2 結果2.3 副作用3 参考4 編集履歴 アデュカヌマブ 痴呆症の内の60%は、アミロイドβが蓄積して脳の神 […]

company, gene-therapy
気になる企業: Novavax 新型コロナウイルス・ワクチンには、遺伝子組換えタンパク質とナノパーティクルの技術で挑む – ID29176 [2021/09/08]

Post Views: 23 目次1 NOVAVAX2 事業内容3 提携4 参考5 サイト内記事6 編集履歴 NOVAVAX NOVAVA社の新型コロナワクチンへのアプローチは、先進的とは言えないかも知れません。世界では […]

Page: 1 2 70
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID24747
  • by Google Ads ID:11145
  • by Google Ads ID23293

最新記事(Education)

BIOLOGICS, culture, education
[Bio-Culture] 大腸菌; E.coliの増殖率は細胞長の増大に関わる – ID28121 [2021/02/27]

Post Views: 41 目次1 大腸菌の増殖率2 編集履歴 大腸菌の増殖率 一般的に、大腸菌の増殖率(growth rate)、1時間あたり1未満であり、それを超える増殖率になってくると、大腸菌の長さが増大するのだ […]

BIOLOGICS, culture, education
[Bio-Culture] Poloxamer 188 – バイオリアクターの撹拌翼による細胞のダメージを抑制 – ID28021 [2021/02/24]

Post Views: 38 目次1 Poloxamer 1882 毒性2.1 動物の静脈内注射 (Poloxamer)2.2 ヒトの静脈内注射 (Poloxamer 188)2.3 創傷治癒2.4 動物実験2.5 AM […]

BIOLOGICS, education, purification
[Bio-Edu] イオン交換クロマトグラフィの原理 – バイオロジクスの製造における基本 – ID27722 [2021/02/13]

Post Views: 45 目次1 イオン交換の原理を使ったクロマトグラフィ2 実務では3 原理4 なぜpHを上げていくと電荷がマイナスチャージになるのか4.1 pHの理解5 編集履歴 イオン交換の原理を使ったクロマト […]

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
AAV, BIOLOGICS, education
[Bio-Edu] ウイルスの等電点(pI) – 組換えAAVでは,empty/fullの違いでpIは異なる – 分離精製は工業化の課題である – ID24561 [2021/02/23]

Post Views: 50 目次1 はじめに2 ウイルスの等電点(pI or IEP)3 ウイルスの等電点の検証結果の詳細4 AAV1~AAV10のpI計算5 AAV8, AAV9のpI6 AAV tree7 編集履歴 […]

BIOLOGICS, education
[Bio-Edu] DNAとRNAの違い – レジメ – ID24191 [2020/10/11]

Post Views: 48 目次1 DNARNAの違い1.1 3つの部品単位 DNARNAの違い DNAはRNAの設計図になります。 DNAを設計図にして、RNAポリメラーゼという酵素により、RNAが作られる 3つ […]

BIOLOGICS, education
[Bio-Education] 医薬品の開発スケジュール – ID23493 [2021/04/08]

Post Views: 43 目次1 医薬品の開発スケジュールの概要2 バイオロジクスの開発における細胞株から製造方法3 Cell Bankの作成3.1 Fraunhofer ITEMのサービスから4 ICHQ5D5 編 […]

Page: 1 2 14
スポンサーリンク
  • by Google Ads ID24747
  • by Google Ads ID23293
  • by Google Ads ID:11145

その他記事(ALL-RANDOM, ID:16786)

AAV, AVIGEN, BIOLOGICS, company, COMPANY-FAVOR
気になる企業 – AVIGEN – Genezymeに買収 – ID11266 [2020/03/03]

Post Views: 41 現在は、Avigen社は存在しない。 「気になる企業」シリーズ。バイオ医薬品に関わる企業の情報を取りまとめています。遺伝子治療薬の開発ベンチーであった「Avigen」社は、Genezymeに […]

AAV, BIOLOGICS, culture, transfection
[Data Link] ウイルスベクターによる遺伝子導入と発現(4) – ID4158 [2019/12/09]

Post Views: 50 3.遺伝子導入と発現シリーズ ウイルスベクターによる遺伝子導入と発現(4)、三宅 弘一 島田 隆 日本医科大学生化学・分子生物学(分子遺伝学)

スポンサーリンク
by Google Ads ID19417
スポンサーリンク
by Google Ads ID:11143(2)

- 以下のツールに敬意を示します -
Support to AMP (Accelerated Mobile Pages) by official AMP plugin for WordPress, and compatible powered by
Post viewing : Flex Posts - Widget and Gutenberg Block