はじめに
Ribonuclease Aのアセントン沈殿の条件検討につい、学生さんが精力的に実施されている文献の紹介をして、その後、昔から知られている一般的な沈殿法について紹介してします。
Ribonuclease Aの沈殿精製
界面活性剤による沈殿生成とアセトンによる 沈殿溶解を利用したタンパク質の回収・分離 - 新居浜工業高等専門学校 第51号 (2014)
先ず定義から
AIくんに詳しく説明してもらおう>
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ChatGPT: 核酸やタンパク質の抽出や沈殿化の工程では、界面活性剤や有機溶媒の性質を利用する場面が多く、その原理の一つとして「ミセル化（micellization）」や「逆ミセル化（reverse micellization）」が関与します。以下にそれぞれの概念と、核酸・タンパク質の操作との関連を解説します。
🔹 ミセル化（Micellization）
【定義】
ミセル化とは、界面活性剤（両親媒性分子）が水中で疎水性相互作用により、疎水基を内側、親水基を外側にして球状構造（ミセル）を形成する現象です。
【核酸・タンパク質抽出との関係】
🔹 逆ミセル化（Reverse Micellization）
【定義】
逆ミセル化は、有機溶媒中で界面活性剤が親水基を内側、疎水基を外側にして形成する構造です。これは**疎水性溶媒中で極性分子（例：水分子やタンパク質）**を包み込むための仕組みです。
【応用】
🔹 まとめ：核酸・タンパク質操作での活用イメージ
| 原理 | 溶媒環境 | 構造 | 応用例 |
|---|---|---|---|
| ミセル化 | 水相（極性） | 疎水基：内側 親水基：外側 |
細胞膜破壊、タンパク質の可溶化 |
| 逆ミセル化 | 有機相（非極性） | 親水基：内側 疎水基：外側 |
タンパク質の選択的抽出、精製 |
補足：他の関連原理
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逆ミセル抽出法
逆ミセルからタンパク質の抽出
逆ミセル抽出法の改良 (Shinらの方法)
検討タンパク質 : 鶏卵白リゾチーム (14.3kDa, pI:11), 牛膵臓リボヌクレアーゼ(13.7kDa, pI9.6)
硫安、アセトン、TCAなど、タンパク質の沈殿法プロトコールまとめ – ThermoFisher -より
https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/protocols-of-protein-precipitation/
トラディショナルな沈殿法
参考
タンパク質精製は、SDS-PAGE分析で検出できる狭雑タンパク質の分離だけでは不十分です。endotoxnや核酸も不純物です。タンパク質から核酸を除去する目的ではないですが、沈澱法としてCTAB沈澱法についても以下に紹介します。この方法も昔から行われていた沈澱法です。
検討方法
マイクロサイズ法
沈澱化の検討は、200μL程度のガラス製のバイアルを使えば効率的です。Biacore用のサンプルチューブがいい感じに使えます。透明度と数百μLで検討ができて、サンプル量も効率的です。
操作法
分析
1) Glass vials
Borosilicate glass vials in a range of sizes and volumes. For use with Biacore systems.
沈殿化検討に使用する透明なガラスバイアル。ゴム栓も購入できるので、それを使えばしばらく保存が可能。検討である程度たまったら写真を撮ってから廃棄です。
2) Milligram scale parallel purification of plasmid DNA using anion-exchange membrane capsules and
a multi-channel peristaltic pump (2007)低濃度CTAB (0.1-4g/L) 沈殿法によるpDNAとRNA/Endotoxinの分離 : 2g/L or 10g/L CTAB/50mM NaCl溶液を添加し、Incubation20分, cfg(38,000xg 20min, 20℃)/pptを70% EtOHで洗浄し、0.6M NaCl, 25mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.4で氷冷下で溶解。