[Vc] mRNAワクチンの製造方法、moderna社とBiaseparations、その他から概略を学ぶ – ID15769 [2021/05/10]

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mRNAワクチンの製造方法

moderna社のデモ・ビデオから、mRNAの開発初期の製造法、及RNAを製造委託する場合の受託会社とその製造方法について以下にまとめた。

RNAの製造は、バイオ技術を使った方法と、低分子合成技術を使った方法で、以下ように製造できるが、タンパク質を作れるほどの長いmRNA (あるいは, pDNA)には、バイオ技術による製造方法が使われていると考えられる。今後、製造承認申請を調査しなければ詳細は不明ですが、2020/05時点で考え得る製造方法を以下に示してみました。

バイオ技術よるRNA製造
- DNA plasmidを大腸菌で大量培養して複製
  - 以下の「[Bio-Edu]Plasmid DNA(pDNA)のデザイン及び、その製造方法に関する調査」を参照。
- DNAの抽出と精製
- DNAの linearization
- DNAを鋳型にして転写酵素でRNAを複製
- RNAの精製

その後、文献調査した結果、以下の文献からmRNAをワクチンに応用する製造方法を示されたものではないが、mRNA医薬品の製造方法について言及されていたので、その方法を示しておきます。2020/05に示したmRNA製造方法と殆ど変わりませんが、一点細かいポイントですが、DNaseでテンプレートDNAを破壊する工程が必要であることがわかりました。

mRNA 医薬品の品質・安全性評価の考え方 (2019) – 医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス，PMDRS，50(6)，300 ~ 306(2019)] –
http://nats.kenkyuukai.jp/images/sys/information/20190717095649-6ABC2FA50410294C82EBEF7D74463510333BCF1FB717B3F88FCCB2CC782A63A8.pdf

[Bio-Edu] Plasmid DNA (pDNA)のデザイン及び、その製造方法に関する調査 [2020/12/24] ID24375

低分子合成技術によるRNA製造
- 30年以上も前からある、固相反応により1塩基ずつ直接合成していく
- 長いものを作ることは難しいため、タンパク質を作れるほどの長いmRNAは、現在の技術では作れないと思われる
- RNAの精製 (陰イオン担体を使用したクロマトグラフィ)

mRNAの一般的な製造方法

modernaのビデオでは、一般的なフローしか説明がされていない。最近の情報として詳細に知りたい場合は、Biaseparationsのサイト*6が参考になる。

原材料の調達; Supply Chain team delivers raw materials
- 資材調達部門による原材料の調達
DNAの製造; Plasmid production (DNA)
- プラスミドDNA構築(*2, *3)
- 1. 鋳型DNA合成
- 2. Plasmid DNA合成
- 3. 大腸菌の形質転換体の調製、大量培養による増幅及び精製
- 4. 精製Plasmid DNA
mRANへの変換; mRNA transcription
- Plasmid DNAを鋳型としてmRNAを作る
  - DNAのlinearization
  - mRNA転写
  - 注意) 転写効率は、5-メチル-Cは収率に影響しないが、2’フルオロ修飾は影響する(*1)
mRNAの精製; Purification (RNase freeで実施)
- modernaの精製方法は不明、一般的なRNA精製方法(*1)は、以下の通り。
- [1]粗抽出→除蛋白
  - 以下のa or b
  - a. Phenol extraction followed by alcohol precipitation (フェノール・クロロホルム抽出法とエタノール沈殿:90%程度で沈殿化、70%で洗浄)
  - b. Lithium chloride precipitation (>300b(*5) )
- [2] 精製
  1. a. Spin column purification (シリカゲル (*4) )
  2. b. GP-HPLC
製剤組成に調整; Formulation
無菌化; Sterile filtration and fill into vials
梱包とラベル; Pack/Lable

受託会社と製造方法

mRNAの製造受託してくれる会社として、Biologics coがあります。日本では、タカラバイオが受託してくれます。

参考文献

(*1) バクテリオファージによるmRNA製造委託に関する情報 – Biologics co.社
https://www.biologica.co.jp/products-service/custom-synthesis/nucleic-acid/transcription/#highlight

(*2)
プラスミドDNA構築 – タカラバイオ – より
http://catalog.takara-bio.co.jp/jutaku/basic_info.php?unitid=U100004295&recommend_flg=1&click_flg=1

(*3)
エンドトキシン低減プラスミドDNA大量調製 – タカラバイオ – より
http://catalog.takara-bio.co.jp/jutaku/basic_info.php?unitid=U100009275

核酸の精製

核酸の精製について、参考となる文献を以下に示しました。

(*4)
エタノール/イソプロピルアルコールの濃度と適切なpHにより、の核酸がシリカゲルに吸着する。カオトロピックイオンの存在下でも吸着可能。
Spin column-based nucleic acid purification – wikipedia -より
https://en.m.wikipedia.org/wiki/Spin_column-based_nucleic_acid_purification

(*5)
リチウム沈殿の技術的情報
– I want to know extraction of RNA with LiCl has an effect on syn of cDNA? – wikipedia -より
https://www.researchgate.net/post/I_want_to_know_extraction_of_RNA_with_LiCl_has_an_effect_on_syn_of_cDNA

https://www.modernatx.com/moderna s-mrna-technology

最近のmRNAの製造方法として参考になる文献

*6

High yield mRNA production process from E.Coli to highly pure mRNA.
Presenter: Aleš Štrancar
Date: od demand, October 19-22, 2020
Cell & Gene Therapy Bioprocessing & Commercialization (digital event)
ユーザー登録すると文献がダウンロードできます。
https://www.biaseparations.com/en/library/seminars-webinars/1098/high-yield-mrna-production-process-from-ecoli-to-highly-pure-mrna

気になる企業 – Moderna – 新モダリティ(mRNA)・ワクチン (新型コロナウイルス) で駆ける / Phase IIIの中間結果では94.5%の有効性を示す – LNP製剤による2~8℃保存が可能である優位性 – ID15029 [2020/12/03] ID15029

編集履歴

2020/05/16 はりきり(Mr)
2020/05/17 追記 (Plasmid DNAの調製、バクテリオファージによるRNA製造に関する委託内容)
2020/05/19 追記 (低分子合成技術によるRNA製造)2020/09/27 修正(mRNA製造フロー)、文言整備
2020/12/04 追記 (mRNA製造に関する最近の文献*6:Biaseparations社)

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