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  • [Bio-Edu] AAV およびrAAV vector について- 長所/短所、立体構造、分子量および血中半減期 及び他ベクターとの比較[2020/11/05]

    [Bio-Edu] AAV およびrAAV vector について- 長所/短所、立体構造、分子量および血中半減期 及び他ベクターとの比較[2020/11/05]

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    はじめに

    遺伝子治療用に使用されるウイルスベクターには、AAVの他にLentivirus, Retrovirusがありますが、これらは、物理的な強度がAAVと比較して低いため精製での扱いに注意が必要です。例えば、Lentivirusは粒子サイズも大きく物理的な強度が高くありません。具体的には、pH6~8、<500mM NaCl, 低温(+4℃)で精製環境を整える必要があります。

    その点、AAVは、粒子サイズが低く、様々な条件でレジスタンスです。

    AAV

    AAVは一本鎖DNAのアデノウイルス科に属するウイルスで、アデノウイルスが存在する時だけ、増殖が可能である。

    AAV遺伝子はITR(inverted terminal repeat)と呼ばれる両末端にヘアピンのT型の配列があり、AAV自身の増殖と宿主細胞の染色体DNAへの組込み時に機能する。

    ITRで挟まれた配列には、左側には非構造蛋白質をコードスするRep領域、右側にはウイルス粒子を形成するカプシド蛋白質であるVP1, VP2及びVP3をコードするCap領域がある。

    宿主細胞の第 19 番染色体長腕の AAVS1 領域(19q13.3-qter)へ組み込まれるが、実験的には，AAVS1 領域と ITRの間を取り持つのが、 Rep(結合領域の両者に共通して存在する塩基配列 : GAGC 繰返し 配列)に，Rep78/Rep68 が結合することで、特異的に組み込まれる。

    参考

    コスモバイオ: tps://www.cosmobio.co.jp/support/technology/a/adeno-associated-virus-aav-apb.asp

    AAV を利用した遺伝子治療、小 澤 敬 也: http://jsv.umin.jp/journal/v57-1pdf/virus57-1_047-056.pdf

    AAVを遺伝子治療に活用

    PackGene社より

    PackGeen

    AAVの構成蛋白質と構造 (文献1)

    外殻蛋白質が60個でAAV粒子を構成しており、その比率はcap領域にコードされている蛋白質VP1, VP2及びVP3が1:1:10とある。そこから推察するに、(VP1+VP2+10(VP3))を1単位として、5単位あれば、60個の外殻蛋白質となり計算があう。

    すなわち、VP1 x 5, VP2 x 5, VP3 x 50で構成さそれていることになる。

    • [VP1+VP2+10(VP3)] x 5
    • VP1: 82kDa, VP2: 65kDa, VP3: 60kDa (文献2)
    • (82 + 65 + (10 x 60) ) x 5
    • 以上から、理論分子量は、3735kDa
    • 粒子分子量: 3,600kDa (文献2)
    • 遺伝子: 1,500kDa (文献2)

    2009年時点で、AAVの血清型,1,2 4,5および8で結晶構造が決定されており、6,9では部分的に決定されてる。現在2019では、ほとんどが決定されているはず。

    血中半減期 (文献1)

    AAV8, 9 (robust serotype)を用いたAAVベクターは、静脈内投与で高い効率で肝細胞、骨格筋細胞、心筋細胞に遺伝子を導入できる。AAV9の血中半減期は、半日。一方、高い遺伝子導入が可能なアデノウイルスは、血小板に吸着して血小板凝集体となり網内系での除去、肝クッパー細胞による除去などで、血中半減期は、2分程度である。

    • 血中半減期は、細胞への吸着、網内系除去に関わる
    • 必ずしも、血中半減期が遺伝子導入効率と相関しない
    • AAV9 : 半日
    • アデノウイルスベクター : 2分

    文献

    1. 急速に進化をつづけるアデノ随伴ウイルスベクター カスタムメイドベクターによる遺伝子治療の可能性: https://www.jstage.jst.go.jp/article/dds/24/6/24_6_582/_pdf
    2. https://www.wam.go.jp/wamappl/bb11GS20.nsf/0/9925e31f10c2c89d4925720a00083512/$FILE/shiryou3-1_5.pdf
    3. ア デ ノ 随 伴 ウ イ ル ス ベ ク タ ー と遺 伝 子 治 療 (1997): https://www.jstage.jst.go.jp/article/jsv1958/47/2/47_2_221/_pdf

    長所

    • AAVは非病原性である(P1での取り扱いが可能)
    • 導入させる遺伝子は、長期に渡り発現されると考えられている
    • 色々な細胞に遺伝子を導入可能 (ただし血清型での違いあり)
    • AAVはパルボウイルス科に属し、物理的に安定 (pH3~9, 56℃ 1時間, 文献2)

    短所

    • ウイルス粒子(~22nmφ)は小さく、導入遺伝子の大きさが5kbp以内に制限される
    • 成人の過半数が中和抗体を有するため、成人での投与では導入効率が低い可能性がある(ある程度の産生される蛋白量が必要な疾患、例えば血友病などでは、中和抗体の存在濃度は治療効果に重要な因子であることから、中和抗体価のスクリーニング系の構築も重要であるとのこと)
    • ベクター作成は、発展途上段階であり技術は未成熟である

    インパクト

    • 血友病などの補充療法に使用する深部出血に対して予防効果が完全でない血液分画製剤や遺伝子組換え製剤は、近い将来凌駕され遺伝子治療法に置き換わる(BY はりきり(MR))

    文献

    1. https://nsmc.hosp.go.jp/Subject/26/juku/juku011files/cyoukou/mizukami.pdf
    2. https://www.wam.go.jp/wamappl/bb11GS20.nsf/0/9925e31f10c2c89d4925720a00083512/$FILE/shiryou3-1_5.pdf

    Vectorの比較

    表1.ウイルスとしての比較
    比較項目AdenovirusAAVLentivirus
    Infection efficiency
    (感染率)    		100%30~40%~30%
    Packaging Capacity
    (遺伝子量)    		7.6 kb4.0 kb8.5 kb
    Integrate with host genome
    (ゲノムへの取り込み)    		NoYesYes
    Pathogenic
    (病原性)    		YesNoYes
    Inflammatory response in vivo
    (炎症)    		HighLowLow
    SignaGen Laboratories home page
    表2. Adenovirusの優位性
    比較項目AdenovirusAAVLentivirus
    Infects many different human cell typesYesYesYes
    Infects both dividing and non-dividing cellsYesYesYes
    Non-integrating virusYesNoNo
    High level of protein expression (up to 10-20% total protein)YesNono
    Ability to accommodate long inserts (up to 8 kb)YesNoNo
    Easy to scale-up/amplifyYesNoNo
    Easy to get titers > 1e10 IFU/mLYesNoNo
    Easy to get a multiplicity of infection > 25 copies per cellYesNoNo
    SignaGen Laboratories home page
    [Vc] アデノウイルス・ベクター・ワクチンとは – 新型コロナウイルスのワクチン開発で威力を発揮する – 必要な遺伝子のみを残す試行錯誤で、現在は第三世代 [2021/02/26] ID19393
    編集履歴
2019/09/15 Mr.はりきり
2020/08/03 文言整備、アデノウイルス・ベクター関連記事の追加
2020/10/05 追記 (Pall webinar, 2020/11/05)
  • [Data Link] rAAV vector/遺伝子治療薬に関する文献調査 [~2020/08/24] – ID2033 [2019/09/13]

    [Data Link] rAAV vector/遺伝子治療薬に関する文献調査 [~2020/08/24] – ID2033 [2019/09/13]

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    Key Considerations in Gene Therapy Manufacturing for Commercialization, 2018 – Cell Culture DISH

    (1) Phase 1 Clinical Study: 18 month (breakthrough), Several months (Traditional BLA)
    (2) Decision on BT Application: – (BT), N/A (TD)
    (3) EOP 1 Meeting Confirms BT Therapy Study: 6 months (BT), N/A (TD)
    (4) Phase 2/3 Clinical Study: 24 months (BT), P2:Several Mo. to 2y and P3:1 to 4y (TD)
    (5) EOP 3/Pre-NDA/Pre-BLA Submission Meeting: -, –
    (6) NDA/BLA Preparation: 6months(BT), – (TD)
    (7) NDA/BLA Review: 6months(BT), 10months(TD)
    (8) Development Timeline: ~5.2y (BT), ~7.4y(TD)

    ・Plasmid Manufacturing : Fermentation→Plasmid Recovery→Purification→Fromulatiion→(Transfect)
    ・Viral Manufacturing: Expand→(Transfect)→Clarification→Concentration→Purifiation→Sterilization→(Activate & Modify)
    ・Cell Processing: Isolate & Enrich→(Activate & Modify)→Expand→Harvest→Formulation

    Viruses used: Retrovirus, Lentivirus, AAV and Adenovirus.

    iCELLis Nano, 500の情報、Allegro single use bioreactor

    DSP platform : 3 chromatography system.

    Transfection System

    Analytical Method

    https://cellculturedish.com/wp-content/uploads/2018/09/Key-Considerations-Gen-Therapy-Manufacturing-Commercialization.pdf

    Methods Matter — Standard Production Platforms For Recombinant AAV Can Produce Chemically And Functionally Distinct Vectors, 2019 –

    https://www.biorxiv.org/content/10.1101/640169v2.full.pdf

    Pharmacology of Recombinant Adeno-associated Virus Production, 2018 – mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Mar 16; 8: 166-180 –

    ベクターが大きいとFull率は低下する。トリプル-インフェクションでは、更にfull率は低下する。

    rAAV2-FIX vectors in A549-derived producer cell line
    (1) full particels : 8%~13%

    rAAV2 vectors inHEK293 cells
    (1) full particles : up to 74% for a 3.4kb-vector, 40%~45% for a 4.2kb-vector
    (2) full particles: 8% and 10%~12% by triple-transfection

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5908265/

    Manufacturing of viral vectors for gene therapy: part I. Upstream processing, 2014 – Pharmaceutical BIOPROCESSING –


    https://www.openaccessjournals.com/articles/manufacturing-of-viral-vectors-for-gene-therapy-part-i-upstream-processing.pdf

    Pharmacology of Recombinant Adeno-associated Virus Production, 2018

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5908265/

    In Vitro Packaging of Adeno-Associated Virus DNA ,1998

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC109794/

    Pharmacology of Recombinant Adeno-associated Virus Production
    Magalie Penaud-Budloo, Achille François, Nat    , 2018

    Next-generation AAV vectors—do not judge a virus (only) by its cover , 2019, AviGen GmbH source – ベクター開発、発現制御、プロモーター

    CATAPULT, UKにおける遺伝子治療、Cell Therapy, Viral Vectors, 製造・分析、クリニカル、Webinar開催など、網羅的に関係する情報の宝庫 soruce

    Production of Recombinant Adeno-associated Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector, 2018

    A scalable method for the production of high-titer and high-quality adeno-associated type 9 vectors using the HSV platform, 2016

    Enhancement of Adeno-Associated Virus Infection by Mobilizing Capsids into and Out of the Nucleolus
    , (2009) AAV2の感染時、核小体への導入効率の向上薬剤(MG132とHU)

    Scalable Production of AAV Vectors in Orbitally Shaken HEK293 Cells (2019)

    Quantification of Adeno-Associated Virus Particles and Empty Capsids by Optical Density Measurement (2003)

    特許公報(B2)_アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型９の配列、それを含むベクターおよびその使用、配列が特許になっている。

    特許公報(B2)_アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型８の配列

    AAVベクターの製造・品質に関するリフレクションペーパー (pmda

    https://www.pmda.go.jp/files/000221591.pdf

    平成29年度我が国におけるデータ駆動型社会に係る基盤整備 「根本治療の実現」に向けた適切な支援のあり方の調査

    https://www.meti.go.jp/meti_lib/report/H29FY/000111.pdf

    遺伝子組換え生物に係る
    法規制の動向について
    独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター (Biological Resource Center, NITE ; NBRC)

    https://www.kansai.meti.go.jp/2-4bio/kansai_smartcell/180925_4.pdf

    バイオ戦略の策定に向けた検討
    バイオテクノロジーによるイノベーションを通じて実現を目指す 経済社会像(ビジョン)

    https://www8.cao.go.jp/cstp/tyousakai/bio/1kai/siryo4.pdf

    遺伝子治療とゲノム編集治療の 研究開発の現状と課題
    Since 1874

    https://www.kantei.go.jp/jp/singi/kenkouiryou/genome/advisory_board/dai4/siryou4-1.pdf

    ウイルスを基盤とした遺伝子治療薬の臨床開発の
    現状と今後の展望

    https://www.jstage.jst.go.jp/article/dds/34/2/34_99/_pdf/-char/ja

    ex vivo遺伝子治療用製品の品質管理戦略の留意点

    Points to consider on quality control strategy for ex vivo gene therapy products

    http://jsgt.jp/CLINICAL_STUDY/2018-1pmda.pdf

    脳卒中に対する遺伝子治療の現状と将来

    http://cbfm.mtpro.jp/journal2/contents/assets/016030167.pdf

    AAV を利用した遺伝子治療
    小 澤 敬 也

    http://jsv.umin.jp/journal/v57-1pdf/virus57-1_047-056.pdf

    アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる遺伝子治療　(2003)

    AAP (Assembly Activating Proteins)

    A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

    生物多様性影響評価書

    科学研究費助成事業 研究成果報告書

    適正製造規範に適合する簡易精製が可能な次世代AAVベクターの開発

    PMDA

    厚生労働省精神・神経疾患研究委託費

    遺伝性筋疾患に対する 分子治療の基盤研究

    病原体検出マニュアル　(国立感染実用研究所)

  • [Bio-rAAV] 遺伝⼦治療における代表的な委託製造会社 (CMO) – ID1881 [2021/02/08]

    [Bio-rAAV] 遺伝⼦治療における代表的な委託製造会社 (CMO) – ID1881 [2021/02/08]

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    rAAV vectorを製造するCMOリスト

    企業サイトサイト製造サイト特徴関係
    WuXi Advanced TherapiesUS1,000L遺伝子治療医薬品の開発と製造、AAV vector suspension platformWuXi AppTec
    CatalentUS, EU,footprint(400,000ft23)10 cGMP clinical suites, 200L, 400L, 800L, 2 x iCELLis 500, 24 HYPERStack 26/CS10
    10 cGMP Commercial Campus (including fill/finish)    		>バイオ医薬品30年の経験、20クライアント, AAV vector, 60 prgrampOriginal
    BioRelianceRockville, Maryland, USA & IrelandViral/Cell banking to fill finish (2,000 v/day), Secure Biostorageウイルス・クリアランス試験、Carsbadとの遺伝子治療用製品の開発と製造BioRelianceとCarlsbad(20+ years)がサービスする, California,親会社: Millipore-SIGMA-Merck
    Oxford BiomedicaUKUK(1,200m2, SUB 200L, BSL-C3 Lab)遺伝子治療医医薬品、PCL(*1)、Gene TherapySANOFI, GSK, NOVARTIS
    Broucher
    Lonza Pharma & BiotechUSHuston,Portsmouth, Holland, Singapore, Japan(Nikon)バイオロジクス、遺伝子治療医薬品、AAV, HSV, NDV,(Anc-AAV)Original
    NovasepEUバイオロジクス、遺伝子治療医薬品、Adeno, Lenti, HSV, VSV, VEEV2021/01/15 ThermoFisherによる買収
    MolMedEU
    YposKesiFR~500L
    ~200L SUB, 24 x Cell Factory 10    		遺伝子治療医薬品2016, Genenthonからスピンオフ
    TAKARA BIOJP遺伝子治療医薬品
    IDファーマJPiPS, CRISPR-Cas9elixirgen therapeutics
    遺伝子治療研究所 (Gene Therapy Research Institution)JP遺伝子治療医薬品
    vigene biosciences (2012~)Rockville, MarylandCellSTACK; iCELLis, 50~500L bioreactor, HEK293Plasmid製造、小規模AAVから臨床(GMP)まで、AAV、レンチウイルスOriginal (Small company)
    patheonby ThermoFisher
    詳細    		Alachua, FL
    Cambridge, MA
    Lexington, MA
    Plainville, MA,
    US    		50L~2000L
    		Florida Bio (2006~2016), 100 clients, 500 product released14+years, Brammer BioがPatheonに統合
    VIROVEK
    詳細    		Hayward, CA, USSF9/vaculovirus1e13 vg/$3,500 ~ >1e15 vg/$119.900 価格表あり2006~

    https://www.kantei.go.jp/jp/singi/kenkouiryou/genome/advisory_board/dai5/siryou4-2-8.pdf

    Merck Darmstadtは、Millipore (2010), Sigma-Aldrich(2015)を傘下に収めて

    https://ja.wikipedia.org/wiki/メルク_(ドイツ)

    編集履歴

    2020/07/17 Mr.Harikiri
2021/02/08 追記 (ThermoFisherによるnovasepの買収)
  • [GT] 世界で承認された細胞・遺伝子治療薬 – ID1872 [2019/09/06]

    [GT] 世界で承認された細胞・遺伝子治療薬 – ID1872 [2019/09/06]

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    遺伝子治療薬リスト(2017)

    2017年に経済産業省がまとめた、世界で承認された遺伝子治療薬です。補充療法とがん溶解による治療薬などが含まれます。

    • AAV1, AAV2 Vectorによる遺伝子導入
    • HSV1 による腫瘍溶解
    • T細胞遺伝子治療
    製品名開発企業承認国、年対象疾患導入遺伝子製品の種類投与方法
    GlyberaUniqueオランダ、2012リポ蛋白リパーゼ(LPL)欠乏症LPLAAV1筋肉内投与
    in vivo
    ImlygicAmgenUS, 2015切除不能悪性黒色腫顆粒球マクロファージ刺激因子(GM-CSF)HSV1腫瘍内投与
    in vivo
    Strum eli’sGSKUK, 2016アデノシンでアミナーゼ(ADA)欠損症ADA遺伝子導入自己CD34+細胞(RV)静脈投与
    ex vivo
    ZalmoxisMolMedイタリア, k2016高リスク造血器悪性腫瘍(GVHD重症化防止)HSV-TK+ΔLNGFR遺伝子導入同種T細胞(RV)静脈投与
    ex vivo
    KymriahNovartisUS, 2017急性リンパ芽球白血病(ALL)(小児、若年成人)CD19 CAR遺伝子導入自己T細胞(LV)静脈投与 ex vivo
    Yes artsKite PharmaUS, 2017びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫CD19 CAR遺伝子導入自己T細胞(RV)静脈投与
    ex vivo
    LuxtumaSpark TherapeuticsUS, 2017レーバー先天性黒内障RPE65AAV2網膜内投与
    in vivo

    薬価サーチサイト KEGG MEDICUS 薬価

    DailyMed

    文献

    遺伝子治療の課題と方策、平成30年3月1日、経済産業省、商務・サービスグループ 生化学産業課

  • [Bio-rAAV] アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使用する意義(特徴)と製造概要 – ID1862 [2019/09/06]

    [Bio-rAAV] アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使用する意義(特徴)と製造概要 – ID1862 [2019/09/06]

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    ID1862

    rAAVベクターの特徴

    遺伝子がランダムに導入される理由を掘り下げて調査した。

    1. 導入目標: レトロウイルスでは分裂細胞にしか遺伝子導入できないが，AAVでは，分裂，非分裂を問わず導入可能で長期発現が可能
    2. 免疫原性: センダイウイルス，ヘルペスウイルス及びアデノウイルスが免疫原性が高いのに対して，AAVは低い
    3. 遺伝子毒性: 正常遺伝子導入の際、ベクター配列が染色体に入ること、正常遺伝子が組み込まれる位置の制御できないため、癌遺伝子近傍に入るとがん化の可能性がある(文献1, p.20)、また、文献2には、宿主の染色体にランダムに遺伝子が導入されるため，レトロウイルス，レンチウイルスと同様に遺伝子毒性がある (現状での技術面の成熟が期待される)
    4. 1997年現在では、野生型AAVが持つ染色体第19染色体の長腕(q13.4-ter)への特異的な遺伝子導入は、組換え技術で作ったAAVベクターで特異的な部位への遺伝子導入は達成できない(文献4)。
    5. 特定部への遺伝子導入制御方法に関する特許は、2008に公開されている(文献5)ので、この時点で、染色体の特定部位への遺伝子導入は難しい技術であったことが伺える、1997年では、その技術はなかった可能性がある。
    6. 上記の最近の文献でもランダム導入などの記載があり、野生型AAVの特異的に特定の部位に遺伝子を導入できるまでには至っていないものと考えられる(今後も調査予定)。
    7.  臨床計画書を見ると、rep遺伝子は使われないようだ。すなわちランダムに遺伝子が組み込まれる。
    8. 細胞毒性: 細胞毒性が低いとされるレトロウイルス，レンチウイルスなどと比較しても，細胞毒性はほとんどない
    9. 大量調製が容易
    10. 治験応用実績: 血友病，パーキンソン病，Leber先天性黒内障
    11. 投与経路: 全身投与により大量投与が可能

    rAAVのメリット

    1. 拡散防止措置P1施設で取り扱う
    2. 増殖/非増殖のいずれの細胞にも遺伝子導入が可能
    3. 非増殖性の細胞での長期発言
    4. 免疫原性が低い

    rAAVベクター製造

    • プラスミドベクター製造
      • AAV ssDNA(pAAV-GOIvector)
        • pAAV CMV Vector
        • pRC Vector
        • pHelper Vector
    • ウイルス作成細胞(HEK293/Tなど) Cell Bank製造
    • プロセス開発
      • 培養
        • Transfection条件(細胞濃度とプラスミドベクターの比率)
      • 精製
        • 抽出法
        • カラム精製
        • UF/DF
    • non-GMP ウイルスベクター製造
    • 非臨床試験
      • in vivo実験(1012 vg/mL)
    • カルタヘナ申請
    • GMP ウイルスベクター製造

    参考

    文献

    1. TAKARA: catalog.takara-bio.co.jp/research.htm
    2. 経済産業省: https://www.kantei.go.jp/jp/singi/kenkouiryou/genome/advisory_board/dai5/siryou4-2-8.pdf
    3. 平成27年7月24日、国立医薬品食品衛生研究所: http://www.nihs.go.jp/oshirasejoho/symposium/documents/H27_suraido_3.pdf
    4. https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-08672600/(1997)
    5. 公開特許公報(A)_アデノ随伴ウイルスのＩＴＲをもつＤＮＡのヒト第１９番染色体への組込み部位の制御方法(2008): https://biosciencedbc.jp/dbsearch/Patent/page/ipdl2_JPP_an_2006263018.html
    6. 遺伝子治療臨床計画書(2017) – rep遺伝子を欠いているためAAVS1へは導入されずランダムに組み込まれる(p.14): https://www.mhlw.go.jp/file/05-Shingikai-10601000-Daijinkanboukouseikagakuka-Kouseikagakuka/0000186212.pdf

    編集履歴

    2019/09/06 はりきり(Mr)
    2019/09/14 追記 (文献3, 4追加)
    2020/04/28 文言整備

  • [Bio-Edu] rAAVの臨床投与量 [2019/07/31]

    [Bio-Edu] rAAVの臨床投与量 [2019/07/31]

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    rAAV vectorの投与量

    遺伝子治療薬(in vivo)では、遺伝子を運ぶベクターとして、アデノ随伴ウイルス(AAV)が使用されます。AAVの殻の部分をCapsidといいますが、そこに目的の遺伝子が挿入されてrecombinant AAV (rAAV)が設計され、動物細胞や微生物でrAAVが製造されます。rAAVの数は、vector genomes (vg)単位で表されます。

    non-clinical(動物試験)の結果をもとに、ヒトでの試験(臨床試験)の試験デザインが立てられます。

    rAAVを使用した遺伝子治療薬の開発では、副作用が無く且つ治療効果が期待できるrAAV投与量が臨床試験で確認される必要があります。

    そのrAAVの必要な投与量は、どれくらいなのかは、そのrAAVの品質、対象疾患などで異なるため、一概に言うことはできませんが、どれくらいの範囲になるのかは、先行する臨床試験や文献から理解することが可能です。

    non-clinical

    参考文献1)のタイトルは、「ムコ多糖症VI型の治療のために静脈内投与されたAAV2 / 8ベクターの非臨床的安全性と有効性」です。非臨床試験、すなわち動物実験を行い、静脈投与における安全投与量での有効な量が示されています。以下の何の試験においても毒性はなかったとのことです。

    試験 (マウス:C57/BL6-Tg ARSBC91S/MPS VI)、投与後の15日後(D15)、150日後(D150)及び180日後(D180)で動物の状態を検査しています。

    投与

    • 毒性試験(toxicity) : 2e13 vg/kg, D15, D180/マウス
    • 生体分布(biodistribution) : 2e12 vg/kg, D15, D180/マウス
    • 生殖細胞伝達 (Germline transmission) : 2e12 vg/kg, D150/マウス
    • 遺伝子発現試験(expressi) : 2e12 vg/kg, D150/ウサギ
    • 用量反復(dose response) : 2e11, 6e11, 2e12 vg/kg, D150, D180/マウス

    評価

    • hematology
    • clinical chemistry
    • necropsy
    • histopathology
    • general health, phiysical
    • functional and neurobehavioral examination
    • body weight
    • body temperature
    • food intake

    Non-clinical Safety and Efficacy of an AAV2/8 Vector Administered Intravenously for Treatment of Mucopolysaccharidosis Type VI, 2017

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5552066/

    Clinical

    最近、あるrAAVを使用した臨床試験で、死亡例が出てしまいClinical Holdになりました。その濃度のオーダーは、1e14/kgでしたが、肝臓をターゲットにするrAAV vectorでした。死亡原因については、今後、解析結果がレポートされるものと思われます。

    患者さんへの投与は、1回の投与で、必要な遺伝子としてrAVVを必要十分に投与できれば、理論的には、その1回の投与で治療は終了します。その投与量の決定として、先行する臨床試験では、2回の投与、2濃度の投与量、などについて臨床デザインに含まれています。

    臨床事例

    rAAVの臨床投与量(clinical)

    2020/02に、BIOMARINが開発されたした血友病Aの遺伝子治療薬(rAAV5)が承認されました。同様にROCHEに買収されたSPARKも血友病Aの開発を行っています。

    以下のようにBioMarinの臨床試験で4e13 vg/kgを投与しているということは、動物試験では、さらに10倍程度は高い投与量での安全性の確認をしているのでは無いかと考えられます。

    BioMarin (SPK-8016)

    • 4e13 vg/kg
    • 6e13 vg/kg

    Spark (SPK-8016)

    • 5e11 vg/kg
    • 1e12 vg/kg

    まとめ

    BIOMARINは、低容量6e12、高容量4e13~6e13 vg/kgで臨床試験を行っています。高容量では、その後の2年間、出血制御は良好な状態を維持していると言っています。

    SPARKのケース(SPK-8016)は、BIOMARINより1/10から1/100です。

    編集履歴

    2020/07/31 Hr.Harikiri
2020/09/19 追記 (臨床投与量から動物試験での投与量を推察)
2024/01/15 文言整備
  • rAAV精製に必要な精製機材　工事中 – ID1165

    rAAV精製に必要な精製機材　工事中 – ID1165

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    Thermo /

    POROS™ CaptureSelect™ AAV9 Affinity Resin

    Antibody Fragment for AAV8, AAV9 , AAVX

    4M Urea, 3M GuHCl, <pH10,, 

    Equiriblation

    PBS

    Washing

    PBS

    1M NaCl containing

    Elution

    pH2-3, citrate

    CIP

    6M Urea, 6M GuHCl

    https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A27357

  • [Bio-Edu] rAAV vectorの製造・品質に関するリフレクションペーパー – [2019/07/21]

    [Bio-Edu] rAAV vectorの製造・品質に関するリフレクションペーパー – [2019/07/21]

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    ID1065

    リフレクションペーパー

    リフレクションペーパーとは、その後成熟してガイドラインとなる。

    日本のpmdaは、遺伝子治療用製品についてのリフレクションペーパー(総19ページ)を発行した。

    参考となる欧米ガイドライン

    Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products – 22 March 2018 EMA/CAT/80183/2014 – EUROPEAN MEDICINES AGENCY –

    1. Draft at April 2014
    2. Adoption by CAT at February 2018
    3. Adoption by CHMP at March 2018

    https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf

    EMA, 2011, 遺伝子治療用製品の設計変更

    FDA, 2018, 遺伝子治療用製品の製法変更を含めた考え方をしめしたが、基本的にはバイオ医薬品のICH Q5Eに沿った同等性評価を求めている。

    • ベクターゲノムのIntegryty
    • ベクターの翻訳後修飾
    • 安全性評価: 感染細胞での持続発現性
    • カルタヘナ対応

    ispe.gr.jp – EMAからの最新のガイドライン

    https://www.ispe.gr.jp/ISPE/05_fda_issue/05_08.htm

    Cellular & Gene Therapy Guidances

    関連のガイダンスが1998年から最新の2020までが収録されている

    1. Vectorに関して3件
    2. 製造関連で2件
    3. Human Cellに関して3件
    4. その他

    https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/biologics-guidances/cellular-gene-therapy-guidances

    編集履歴

    2019/07/21, Mr. Harikiri

  • [Edu] AAVウイルス感染のメカニズム – ID1039 [2019/07/20]

    [Edu] AAVウイルス感染のメカニズム – ID1039 [2019/07/20]

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    AAVおよびAAVベクターの特徴

    • AAV(アデノ随伴ウィルス)はパルボウイルス科(Parvoviridae)のデペナドウイルス属(Dependovirus)
    • 直径20nm直径
    • 32個のカプソメアからなる正20面体の粒子構造
    • エンベロープを持たない1本鎖DNAウイルス
    • AAVベクター*1は，染色体への組込みは稀
    • 非分裂の細胞にも効率に感染可能
    • 重複感染が可能
    • ヒトやサルから100以上のAAV型が発見
    • ヒト成人の85%でAAVに対する抗体を有する
    • ヒトへの病原性は証明されていない．
    • AAVはアデノウイルスとの間でDNA塩基配列の類似性はない．
    • 自立で増殖できない
    • アデノウイルスをヘルパーととして，共感染状態で増殖できる
    • 変異原物質存在下で宿主細胞が同調分裂を行う条件下では自立増殖できる．
    *1 : 人工的にAAVウイルスの殻を作り、そこに目的遺伝子と機能性遺伝子を封入した人工のAAV(recombinant AAVともいう)

    感染の順序

    1. 宿主細胞の表面にあるレセプターにウイルスが吸着
    2. 細胞内への侵入
    3. (上記1、2の説明)細胞との接触
      • 融合型
        ウイルス・エンベロープが宿主細胞膜と融合し、粒子内部のヌクレオカプシドが細胞質内に送り込まれる膜融合タイプ(エンベロープを持 つウイルス)
      • 貪食型
        宿主細胞の飲食作用(エンベロープを持たないウ イルス)
      • バクテリオファージ型
        吸着したウイルス粒子の尾部にある管を通しての移動
      • カプシドごと細胞内に侵入
    4. カプシドが分解
    5. 核酸が宿主細胞質に遊離
    6. 核酸の複製とウイ ルス・タンパク質の合成は、基本的には別々に行われる
    7. カプソメアが核酸を包み込みカプシドを形成し、ヌクレオカプシドが作られる
    8. 出芽や宿主細胞が死ぬことにより、宿主細胞外に放出

    Refference : https://www.chem-agilent.com/stratagene/strategies/pdfs/19.3/Strategies%20Vol.2%20No.3_p8.pdf

    編集履歴

    2019/07/20, Mr. Harikiri

  • [Bio-Edu] AAV2の感染に関わるレセプターは何か? – ID18442 [2019/07/20]

    [Bio-Edu] AAV2の感染に関わるレセプターは何か? – ID18442 [2019/07/20]

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    レセプターを考えるとき

    生体内の物資が、特定の組織に収束するのは、受容体(receptor)を介している。例えば、生体内でホルモンが分泌された時、血流に乗って全身に運ばれる。次に、必要な組織に到達するするのは、そのホルモンと結合親和性の有るreceptorが、その組織にあって、それに結合するためである。その結合の初期段階については、以下の様式を念頭に置いて置かなければならない。

    • 電荷的(正負のイオン的結合)
    • 構造的(パズルのマッチング)
    • 疎水的(疎水性が高いもの同士は収束する)

    AAV2のレセプター

    感染に関わるレセプターは、AAVの血清型によって異なるが、AAV2は、ヘパリンはよく知られており、そのHeparin分子について、AAV2の結合性を検討してしている2)、この文献によれば、Heparinの分子の長さによって親和性が異なるとのこと。

    個人的なコメントをすると、Heparinは、正電荷であるため、不電荷とはイオン的に結合が可能であり親和性を持つことが可能である。AAV2の表面に負電荷を持つ領域があるものと理解できるし、その分子の長さとその電荷の状態でAffinityは異なるものと思われる。

    編集履歴
2019/07/20 はりきり(Mr)
2020/05/31 文言整備、追加(レセプターを考えるとき、まとめ)
    Ref : 2) Characterization of Interactions between Heparin/Glycosaminoglycan and Adeno-associated Virus

    AAV2の必須な受容体の特定

    AAVは，ほとんどの細胞に高効率に感染することから，遺伝子治療用のベターに多用されている．参考文献3)によれば，感染細胞として、一倍体細胞を用いて遺伝子を1つずつノックアウトし，AAV2が感染するか否かを繰り返しAAV受容体を特定した後，ノックアウト動物で最終確認している．

    • Ig-likeドメイン (PKD: polycystin Kidony disease)の5回貫通する細胞外ドメインが受容体である
    • N末のIgドメインの2つがAAVと結合する
    • このIgドメインは，KIAA0319L遺伝子であり，小胞体輸送に関わる分子と結合し，ゴルジ体と細胞表面を行き来する．
    PKD : βシートが3枚と4枚で構成された構造

    基本的知識

    感染力(細胞内に入り込む能力)が有るrAAVを作る為には、天然AAVにコードされているrep/cap遺伝子が必要で有る。

    rep遺伝子

    Repタンパク質を発現する遺伝子．AAVの製造に必要である．

    cap遺伝子

    Capタンパク質を発現する遺伝子．AAV粒子を構成する3つのVP1, VP2及びVP3をコードしている．これらのカプシドタンパク質質により，正20面体の立体的構造を作り，その中にAAVの遺伝子が包含される．

    感染フロー

    StepProcessMemo
    1AAVの細胞への付着attachment, この付着する機序が2016年まで不明だった
     ↓ 
    2エンドサイトーシスendocytosis
     ↓ 
    3エンドソームによる輸送trafficking
     ↓ 
    4エンドソーム又は，リソソームからの脱出escape
     ↓ 
    5核への転移translocation
     ↓ 
    6rep遺伝子の発現expression
     ↓ 
    7ゲノム複製replication
     ↓ 
    8cap遺伝子の発現，及び子孫ssDNAを含むAAV粒子を合成expression
     ↓ 
    9子孫AAVの完成assembly
     ↓ 
    10感染宿主細胞からの脱出release

    まとめ

    今回は、AAV2について、そのレセプターに関する参考文献を紹介した。

    良く知られたAAVの血清型としては、AAV1~AAV10程度が知られている。血清型によって、レセプターは異なるようである。なぜなら、感染ターゲットとなる細胞種が、血清型で異なることから、そのように推察されている。

    参考文献

    1)

    基礎知識 –
    Adeno-associated virus

    https://en.wikipedia.org/wiki/Adeno-associated_virus

    2)

    AAV2とHeparinの親和性について –
    Characterization of Interactions between Heparin/Glycosaminoglycan and Adeno-associated Virus – Biochemistry, 2013 –

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3859860/#!po=2.00000

    3)

    AAV2のレセプターついて –
    An essential receptor for adeno-associated virus infection – Nature, 2016 –

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3859860/#!po=2.00000

    編集履歴

    2019/07/20, Mr. Harikiri