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カテゴリー: BIOLOGICS

  • [Bio-Edu] 細胞生存アッセイ – ID14011 [2020/04/22]

    [Bio-Edu] 細胞生存アッセイ – ID14011 [2020/04/22]

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    細胞生存アッセイ

    細胞生存アッセイ – abcam – より

    https://www.abcam.co.jp/kits/cell-viability-assays-1
    • Cell viability assays
      • 細胞内の代謝能や酵素活性を測定
      • 細胞集団中におけるの生存細胞の割合の推定
    編集履歴
    2020/02/22 はりきり(Mr)
  • I型インターフェロン

    I型インターフェロン

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    I型インターフェロン

    I型インターフェロン: インターフェロンα、インターフェロンβの総称 (Type I Interferon)

    • ヒト、マウスのほとんどの細胞では、Type I Interferonの受容体を発現する
    • ウイルス、細菌、寄生虫、真菌への感染において、他のメディエーター誘導を通じて直接的および/または間接的に生来および適応性免疫細胞に多様な影響を及ぼす
    • インフルエンザウイルス感染などの急性ウイルス感染で免疫病理学的症状を引き起こすことが示されている。逆に、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス感染などの慢性ウイルス感染では免疫抑制につながる可能性がある
    • 細菌感染では、細胞を介した免疫応答を開始するためには、初期段階で低レベルのIFN型が必要になる場合がる
    • 高濃度のIFNは、B細胞応答をブロックしたり、免疫抑制分子の産生につながる可能性があり (リステリア単球ゲンおよびマイコバクテリウム結核の感染症)、IFNγによる活性化に対するマクロファージの応答性を低下させる
    • 結核の実験モデルにおける最近の研究は、プロスタグランジンE2とインターロイキン-1がType I IFNの発現と、その下流の効果を阻害し、サイトカインのクロスレギュレーションネットワークが感染症中に動作し、宿主への損傷を最小限に抑える保護作用が実証されている

    更に、詳細については、以下の参考文献を参照してください。

    Type I interferons in infectious disease (2015) – nature reviews immunology –

    https://www.nature.com/articles/nri3787

    編集履歴

    2020/04/21, Mr. Harikiri
    2022/03/12,追記(Type I IFNの働きについて、参考文献から一部を概要として記載)

  • [Bio-Edu] DNAワクチンとは – 2008年までの論文から、免疫細胞へのプラスミドDNAの取り込みにより特異抗体が産生される – ID13931 [2020/04/21]

    [Bio-Edu] DNAワクチンとは – 2008年までの論文から、免疫細胞へのプラスミドDNAの取り込みにより特異抗体が産生される – ID13931 [2020/04/21]

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    DNAワクチンとは

    1998年、2000年および2008年の論文から、DNAワクチンの作用機序を調査した。最近の論文調査は今後追加する。

    1998年現在

    1998年には、DNA vaccination, genetic immunizationと呼ばれている。作用機序は不明。

    • DNAワクチンの特徴としては強力な細胞性免疫の誘導能
    • 生ワクチンの長所と, 生きた病原体を使用しないため安全性が確保されるというペプチドワクチンの長所を具備
    • 合成が容易で保存性に優れ, 経済性, 長期にわたる免疫反応が持続するなどの面で従来のワクチンより優れている

    DNAワクチンの現状と展望 (1998) – J-STAGE – より

    https://www.jstage.jst.go.jp/article/jsb1944/53/2/53_2_407/_article/-char/ja/#article-overiew-references-wrap

    2000年現在

    • アレルゲン遺伝子を組み込んだプラスミドDNAを接種することによってアレルゲン特異的Th1細胞が誘導できる
    • アレルゲン特異的Th2細胞の応答を抑制でき, アレルギー反応を抑制することができると考えられる
    • DNAワクチン接種の際の条件, たとえば投与方法や投与部位の調節, あるいは, アジュバントや補助シグナル分子を発現するプラスミドDNAの併用により, 免疫応答を操作できることが明らかになってきている.

    DNAワクチン (2000) – J-STAGE – より

    https://www.jstage.jst.go.jp/article/iryo1946/54/2/54_2_89/_article/-char/ja/

    免疫細胞と非免疫細胞 (2008)

    1. 免疫細胞が抗原特異的抗体を産生

    阪大の研究成果により、作用機序が明らかになってきた。

    • DNAの右巻きの二重らせん構造（B-DNA）注2）が細胞内でTank-Binding Kinase 1 (TBK1)注3）という酵素（シグナル伝達分子）を介して自然免疫系注4）を活性化
    • このことが、ワクチンの内因性アジュバント注5）として作用し、自然免疫系活性化のシグナルがDNAワクチンの効果発現に必須である
    • DNAワクチンの効果のうち、抗体の産生のためには樹状細胞などの免疫細胞でのTBK1依存性の自然免疫活性化が重要
    • Ｔ細胞による細胞性免疫の活性化のためにはDNAを取り込んだ筋肉細胞などの非免疫細胞でのTBK1の活性化も重要
    • この論文は、2008年2月7日（英国時間）発行の英国科学雑誌「Nature」に掲載
    • DNAワクチンとは、プラスミドDNAと呼ばれる細菌由来の環状DNAに抗原を発現する遺伝子を組み込んだもの
    • 生体に投与すると、その抗原に特異的な免疫反応を誘導
    • 製法が簡便でコストも抑えられる
    • 動物用ワクチンとしてウマの西ナイルウイルス感染症、養殖サケのウイルス感染症、ペット犬の悪性黒色腫（メラノーマ）に対するDNAワクチンが北米で認可され、実際に使用されている
    • DNAワクチンがなぜ効くのか解明はあまり進んでいません。
    • 特にDNAワクチンが持つアジュバント効果に関しては、ワクチンのプラスミドDNAに存在するCpGモチーフ注6）という特殊な配列がトル様（よう）受容体9（Toll-like receptor 9, TLR9）注7）によって認識されることで起こる自然免疫系の活性化によるものと思われていました（図1）
    • この自然免疫反応はDNAワクチンの効果に無関係であるとの報告がある。
    • 今回の研究成果
      • TLR9ノックアウトマウスでも、ワクチン効果があった
      • I型インターフェロン注9）の受容体遺伝子ノックアウト・マウスの場合では、ワクチン効果が顕著に低下
      • 従って、I型インターフェロンを誘導する経路が重要である。
    • 一方で、B-DNAがTLRを介さずに、TBK1というシグナル伝達分子（酵素）を介し、炎症性サイトカイン注10）やI型インターフェロンを産生することを発見
    • 核酸（DNA）の自然免疫賦活化作用はTLR9を介する病原体（細菌やウイルス, 塩基配列（CpGモチーフ）である
    • ウイルス、宿主細胞両方に見られるDNAの二本鎖DNAの右巻き構造が、TLRに依存しない強いインターフェロン産生能を持つことが示された。
    • 樹状細胞などの免疫細胞
      • TBK1遺伝子を持つマウスでは、(1)抗原特異的な抗体の産生（液性免疫)、(2)ヘルパーT細胞の誘導
      • TBK1遺伝子を持つマウスでは、細胞障害性Ｔ細胞（CTL）の誘導
    • 筋肉細胞などの非免疫細胞
      • 状況(1)と(2)のワクチン効果は、見られなかった。
      • TBK1遺伝子を持つマウスでは、細胞障害性Ｔ細胞（CTL）の誘導が見られる
    • (A) DNAワクチンによる抗体産生には樹状細胞などの免疫細胞でのTBK1依存性の自然免疫活性化経路が重要である
    • (B) 細胞性免疫誘導のためにはDNAが主に取り込まれる筋肉細胞などの非免疫細胞における、TBK1依存性の自然免疫活性化シグナルも働いていること、
    • (C) 免疫・非免疫細胞双方における自然免疫活性化が相互に作用し合っている

    2. 副作用関連

    • DNAはいくつかの自己免疫疾患、たとえば全身性エリテマトーデス（SLE）（自己のDNAに対する抗体ができる原因不明の疾患）などの発症、増悪の機序に関与している可能性がある

    遺伝子（DNA）ワクチンの作用機序を解明（DNAワクチンの本格開発にはずみ）2008 – 大阪大学免疫学フロンティア研究所

    http://www.ifrec.osaka-u.ac.jp/jpn/research/20080207-0524.htm

    細胞性免疫

    編集履歴

    2020/04/21 はりきり(Mr)
2020/07/24 追記　(細胞性免疫)
  • [用語] ppt ; precipitation ; 沈殿化 – 物理的性質の違いで液体と沈殿に分ける

    [用語] ppt ; precipitation ; 沈殿化 – 物理的性質の違いで液体と沈殿に分ける

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    ppt ; precipitation ; 沈澱化

  • [用語] pI ; ピーアイ ; isoelectric point – タンパク質の物理化学性質としての荷電に関する情報

    [用語] pI ; ピーアイ ; isoelectric point – タンパク質の物理化学性質としての荷電に関する情報

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    pI: 等電点, 電荷がゼロになるpHのこと。isoelectric point, アミノ基は高く、カルボキシル基は低い

  • [rAAV] 特許 0010468 – rAAV vector精製 – アパタイト・クロマト精製法 (レジメ)- ID13457

    [rAAV] 特許 0010468 – rAAV vector精製 – アパタイト・クロマト精製法 (レジメ)- ID13457

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    METHODS FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT AAV VECTORS United States Patent Application 20190010468 Kind Code:A1

    http://www.freepatentsonline.com/y2019/0010468.html

    概要

    • PEG添加でCHT (and CHF)のDBCを100倍の増強
    • All rAAV

    Claim

    1. A method for isolating a population of recombinant adeno-associated virus (rAAV) particles from in-process impurities in a feedstream, comprising the steps of:(a) contacting a feedstream containing the rAAV particles with an apatite chromatography medium in the presence of polyethylene glycol (PEG), wherein the rAAV particles bind to the apatite chromatography medium; and(b) eluting the rAAV particles bound to the apatite chromatography medium with an elution buffer containing less than 3% (w/v) PEG.

    2. The method of claim 1 , wherein the apatite chromatography medium is ceramic hydroxy apatite (CHT).

    3. The method of claim 1, wherein the apatite chromatography medium is ceramic fluoroapatite (CFT).

    4. The method of claim 1, wherein the specific binding of the apatite chroma attooggrraapphhyy mmeeddiiuumm ttoo tthhee xrAAAV particles is between 1014 and 1016 DNase-resistant particles per milliliter (DRP/mL).

    5. The method of claim 1 , further comprising a step of binding the rAAV particles in the feedstream eluted from the apatite chromatography medium to an anionic chromatography medium.

    6. The method of claim 1 , wherein the feedstream containing the rAAV particles in step (a) is contacted with an apatite chromatography medium in the presence of polyethylene glycol (PEG) and a basic buffer.

    7. The method of claim 6, wherein the basic buffer is between pH 7.6 and 10.

    8. The method of claim 6, wherein the basic buffer is between pH 8.0 and 10.0. 

    9. The method of claim 6, wherein the basic buffer is between pH 9.0 and 10.0.

    10. The method of claim 6, wherein the basic buffer comprises borate.

    11. The method of claim 1, wherein the PEG has an average molecular weight between about 5,000 (PEG5000) grams per mole and about 15,000 (PEG15000) grams per mole.

    12. The method of claim 11 , wherein the PEG has an average molecular weight of about 6,000 (PEG6000) grams per mole.

    13. The method of claim 1, wherein the feeds tream containing the rAAV particles in step (a) is contacted with the apatite chromatography medium in the presence of between about 3% (w/v) and about 10% (w/v) PEG.

    Claims

    1. A method for isolating a population of recombinant adeno-associated virus (rAAV) particles from in-process impurities in a feedstream, comprising the steps of: (a) (i) contacting a feedstream containing the rAAV particles with an apatite chromatography medium in the presence of polyethylene glycol (PEG), wherein the rAAV particles bind to the apatite chromatography medium; and (ii) eluting the rAAV particles bound to the apatite chromatography medium with an elution buffer containing less than 3% (w/v) PEG; and (b) (i) contacting the feedstream eluted from the apatite chromatography medium containing the rAAV particles with a hydrophobic interaction chromatography (HIC) medium in a high salt buffer comprising citrate, wherein the rAAV particles and the in-process impurities bind to the HIC medium; and (ii) eluting the rAAV particles bound to the HIC medium with a medium salt buffer.  

    2. The method of claim 1, wherein the apatite chromatography medium is ceramic hydroxyapatite (CHT) or ceramic fluoroapatite.  

    3. 3–5. (canceled)  

    6. The method of claim 1, wherein the feedstream containing the rAAV particles in step (a)(i) is contacted with an apatite chromatography medium in the presence of polyethylene glycol (PEG) and a basic buffer.  

    7. (canceled)  

    8. The method of claim 6, wherein the basic buffer is between pH 8.0 and 10.0.  

    9. (canceled)  

    10. The method of claim 6, wherein the basic buffer comprises borate.  

    11. The method of claim 1, wherein the PEG has an average molecular weight between about 5,000 (PEG5000) grams per mole and about 15,000 (PEG15000) grams per mole.  

    12. (canceled) 

    TABLE 2. Screening of resins for binding of rAAV-1 compared to binding of process contaminants

    ResinResin TyperAAV-1Helper VirusHost Cell DNASerum AlbuminSerum Proteins
    UnoS pH 5.5Cation Exchange+0−++
    UnoS pH 7.0Cation Exchange−−−−−
    UnoQ pH 8.5Anion Exchange+++++++++++
    UnoQ pH 7.0Anion Exchange++++++++++++
    Fractogel EMD SO3Cation Exchange+++−00
    CHTApatite+0++++
    CFTApatite+0++++
    HIC PhenylHydrophobic Exchange−−−00
    HIC ButylHydrophobic Exchange+++−00
    HIC HexylHydrophobic Exchange+++−00
    HIC PPGHydrophobic Exchange−−−00
    Source SIon Exchange+00++0
    Source QIon Exchange+00++0
    TMAEIon Exchange+00++0
    IMAC FeCl300−++
    Superdex 200Gel Filtrationvoidvoidchasechasechase
    HW55Gel Filtrationvoidvoidchasechasechase
    HW65Gel Filtrationvoidvoidchasechasechase
    HW75Gel Filtrationvoidvoidchasechasechase
    Key: (−) = present in flow-through (no binding); + = weakly bound (eluted very early in the gradient); ++ to ++++ = stronger binding (eluted further along the gradient).

    TABLE 3. Relative strength of binding of rAAV-1 and BSA to apatite resin at pH = 6.5 or pH = 9.0, with or without 5% (w/v) PEG6000

    Binding conditionsBSA5% (w/v) PEG6000
    pH = 6.50+++
    pH = 6.50 + 5% (w/v) PEG6000++++++
    pH = 9.0++
    pH = 9.00 + 5% (w/v) PEG6000+++++
    Key: + = weak binding;, ++ = medium binding; ++++ = strong 

    TABLE4. Glucan clearance in the process

    Processing stepGlucan concentration (ng/mL)Total amount per lot (ng) (250 L scale)
    Clarification10.42,600,000
    TFF1361,541,016
    CHT elution1.94,769
    Post HIC and SEC0.2662
    Final Anion Exchange Eluate0.171

    TABLE 5. Screening for AAV1 binding in alternative buffers

    Total infectious units of Ad5 in CHT column fractionsFraction
    Load ratio6.6 mL13.5 mL33 mL
    Load9.0 × 1081.3 × 109 9.0 × 108
    Flowthrough + chase<2.5 × 105 <3.6 × 105 <6.9 × 105
    PO4 Wash2.9 × 1062.7 × 106<2.6 × 106
    Washes II & III3.6 × 1062.2 × 106 2.8 × 106
    Elution<6.9 × 104 <6.9 × 104 <3.5 × 105
    Log reduction value (LRV)>4.1>4.3>3.4

    TABLE 6

    疎水担体として一般的によく使われるButylとPhenylを比較してして、各緩衝液組成の下、パススルーさせた時、そのパススルーの回収率の比較をしている。

    一般論として、バッファ組成から吸着性が良いと考えられる条件は、以下の通りであるが、その一般論とは少し異なっているように思われる

    • 吸着性は、酸性pHで強くなり、アルカリ性pHで低くなる
    • 吸着性は、塩濃度が高い程強くなる。ただし、塩の分子量に依存しており、分子量が大きいほど強くなる
    • この表の結果では、この経験則に反しているように見える。このような場合、以下の考察が必要であると考える
      • 塩の種類による可溶性の向上/不要化の促進があるかも知れない
    • 考えられる考察
      • アルカリ性と酸性では、酸性の方が可溶的である
    Buffer System TestedButyl 650M (% in flow-through)EMD-Phenyl (% in flow-through)
    1.1M Sodium Sulfate (pH = 7)0%0%
    1M Sodium Citrate (pH = 7)0%0%
    1.3M Potassium Phosphate (pH = 7)3%3%
    2.9M NaCl, 50 mM Sodium Citrate (pH = 4)0%28% 
    1M Glycine, 50 mM Sodium Citrate (pH = 4)4%1%
    50 mM Potassium Phosphate (pH =4.5)3%NT
    50 mM Sodium Citrate (pH 4)4%NT
    2.9M NaCl, 50 mM Potassium Phosphate (pH 4.5)17% NT

    TABLE 7. Relative binding of rAAV-1 versus model in-process impurities in different HIC buffers

    表から言えることは、rAAV-1は、AAV血清型1で作ったVector、Ad5は、遺伝子治療用で最も使用されるadenovirus血清型5。疎水担体(HIC)への結合性は、rAAV-1よりもAd5の方が強い。不純物であるDNAの結合性は弱い。

    Buffer SystemrAAV-1Ad5DNA
    0.1M sodium sulfate + bis tris buffer, pH = 7.0+++−
    0.8M sodium sulfate, bis tris buffer, pH = 7.0+++0
    1M sodium citrate, pH = 7.0+++0
    2.9M NaCl (50 mM sodium citrate to buffer at pH = 4.0)−−0
    Key: “0” = no binding material present in flow-through; “−” = very weak binder; “+” = strong binder; “++” = stronger binder.

    関連記事

  • [Bio-Edu] 沈殿化法によるタンパク質の回収・分離 – 検討方法 – ID4376 [2020/12/11]

    [Bio-Edu] 沈殿化法によるタンパク質の回収・分離 – 検討方法 – ID4376 [2020/12/11]

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    はじめに

    Ribonuclease Aのアセントン沈殿の条件検討につい、学生さんが精力的に実施されている文献の紹介をして、その後、昔から知られている一般的な沈殿法について紹介してします。

    Ribonuclease Aの沈殿精製

    界面活性剤による沈殿生成とアセトンによる 沈殿溶解を利用したタンパク質の回収・分離　- 新居浜工業高等専門学校　第51号 (2014)

    逆ミセル抽出法

    • 逆ミセル
      • 無極性溶媒中、極少量の水をコアとして、界面活性剤が会合したナノスケールの分子の集合体
      • 微小水槽が、界面活性剤分子によって、有機溶媒から隔離されている状態
      • この状態では、タンパク質は変性することなく逆ミセルの内部にとじこめられる
    • 操作法
      • タンパク質水溶液を用意
      • 逆ミセルを形成した有機溶液を用意
      • 2つを接触させる
    • タンパク質の逆ミセルへの移行の原理
      • タンパク質と界面活性剤の親水基との静電的相互作用

    逆ミセルからタンパク質の抽出

    • タンパク質を含む逆ミセルに
    • 水溶液を接触させ、界面活性剤との相互作用を弱くする
    • タンパク質は、水層に移動するが、その効率は低い

    逆ミセル抽出法の改良 (Shinらの方法)

    検討タンパク質 : 鶏卵白リゾチーム (14.3kDa, pI:11), 牛膵臓リボヌクレアーゼ(13.7kDa, pI9.6)

    • 界面活性剤による沈殿形成
      • 原理 : タンパク質は水中でイオン性界面活性剤により沈殿形成する
      • 2-エチル(ヘルシル)スルホコハク酸Na(AOT)
      • 等量(5mL)を5sec混和、静置→遠心→ppt→蒸留水で洗浄→Acetone 1vol(5mL)で溶解→0.1M NaCl 10μL→沈殿化→静置→遠心→ppt→Acetone洗浄→乾燥→蒸留水溶解
    • 極性有機溶媒による回収
      • 形成した沈殿を溶解
      • acetone (solubilization◯、precipitation◯)
      • 1-propanol, 2propanol (solubilization◯、precipitation×)
      • ethanol/ethylene glycol (solubilization△/×、precipitation-/-)
    • 電解質水溶液を極少量添加
      • NaCl 水溶液(電解遮断効果、濃度が高いほど沈殿↓)
      • 極性有機溶媒は、タンパク質から外れ、界面活性剤は、極性有機溶媒と混和
      • タンパク質は沈殿のまま回収できる
    • 低い界面活性剤の濃度で処理可能

    硫安、アセトン、TCAなど、タンパク質の沈殿法プロトコールまとめ – ThermoFisher -より

    https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/protocols-of-protein-precipitation/

    トラディショナルな沈殿法

    • 硫酸アンモニウム（硫安）沈殿法
      • マイルドなタンパク質沈殿化法
      • 飽和硫安濃度33%でIgGが沈殿、アルブミンは50%程度で沈殿する
    • アセトン沈殿法
      • 昔の血漿分解製剤で使用
    • トリクロロ酢酸（TCA）沈殿法
      • 酸性等電点を持つタンパク質に適用できる
      • グリシン塩酸法
    • TCA/アセトン沈殿法
    • クロロホルム/メタノール
      • SDSなどを除けるMS(質量分析)用のタンパク質の回収
    • 酸性pH処理
      • pH3~pH5にすることで、沈殿するものもあります。DNAなどの核酸が沈殿します。DNAでなくタンパク質も沈殿するものもあります
      • DNAとタンパク質が共沈したとしても、その他の不純物と分離ができていれば、よしとします。後の処理でDNAとの分離を考えましょう
      • 添加する酸は、タンパク質にマイルドな酢酸を使用します。塩酸は決して使ってはいけません。タンパク変性しやすいためです
    • 食塩(NaCl)添加
      • 3~5MのNaCl溶液を少ない量から適当添加していく方法で、スモールスケールの検討を行います。
      • 酢酸を添加して酸性pHにしても沈殿が生じない場合に、追加的にNaClの添加をすると沈殿することもあります
    • EtOH分画
      • 血漿分画製剤で使用される実製造に使われている
      • この技法は高度である。再現性を得るには、温度管理、pH管理、及び伝導度管理を厳密に制御する必要がある

    参考

    タンパク質精製は、SDS-PAGE分析で検出できる狭雑タンパク質の分離だけでは不十分です。endotoxnや核酸も不純物です。タンパク質から核酸を除去する目的ではないですが、沈澱法としてCTAB沈澱法についても以下に紹介します。この方法も昔から行われていた沈澱法です。

    • CTABによるplasmid DNAとRNA/endotoxinの分離 2)

    検討方法

    マイクロサイズ法

    沈澱化の検討は、200μL程度のガラス製のバイアルを使えば効率的です。Biacore用のサンプルチューブがいい感じに使えます。透明度と数百μLで検討ができて、サンプル量も効率的です。

    操作法

    • 100μLのサンプルをGlass vialに分注
    • 酢酸原液を数μLずつ添加
    • 別途、添加量とpHを確認しておく
    • 酢酸は、タンパク質の溶解性を高めるので、入れすぎは逆効果です
    • ですが、酢酸で低pHのタンパク質溶液にNaClを添加して塩濃度を高めると疎水性がより高まるためタンパク質が沈澱化しやすくなります
    • 分子量が大きいて沈澱化効率は高まります
    • 以上のことを踏まえて、沈殿化条件を決定していきます。

    分析

    • UVスペクトル(A200~700, NanoDropが便利)
      • A260/A280比率は、タンパク質と核酸のコンタミ具合の指標
    • SDS-PAGEによるタンパク質の純度分析
      • 目的物の分子量を指標に評価
    • Endotoxin分析 (option)
      • LAL法 (Kit)
    • DNA分析 (option)
      • PicoGreen (Kit)

    1) Glass vials

    Borosilicate glass vials in a range of sizes and volumes. For use with Biacore systems.

    沈殿化検討に使用する透明なガラスバイアル。ゴム栓も購入できるので、それを使えばしばらく保存が可能。検討である程度たまったら写真を撮ってから廃棄です。

    https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/protein-analysis/spr-label-free-analysis/accessories-vial/glass-vials-p-05546

    2) Milligram scale parallel purification of plasmid DNA using anion-exchange membrane capsules and
    a multi-channel peristaltic pump (2007)

    低濃度CTAB (0.1-4g/L) 沈殿法によるpDNAとRNA/Endotoxinの分離 : 2g/L or 10g/L CTAB/50mM NaCl溶液を添加し、Incubation20分, cfg(38,000xg 20min, 20℃)/pptを70% EtOHで洗浄し、0.6M NaCl, 25mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.4で氷冷下で溶解。

    https://www.researchgate.net/profile/Stefan_Schmidt15/publication/6232344_Milligram_scale_parallel_purification_of_plasmid_DNA_using_anion-exchange_membrane_capsules_and_a_multi-channel_peristaltic_pump/links/59de01f545851557bde325bd/Milligram-scale-parallel-purification-of-plasmid-DNA-using-anion-exchange-membrane-capsules-and-a-multi-channel-peristaltic-pump.pdf?origin=publication_detail

    まとめ

    今回、タンパク質の沈殿化方法の色々を紹介しました。これらの方法で、タンパク質を純度よく精製するには、条件をもっと厳密にコントロールしなければなりませんが、今回紹介した中では、そこまで条件を詰めて設定されたものはありません。

    沈殿化法で、更にタンパク質の精製を極めたいと思っているなら、エタノールを使用した沈殿化による血漿タンパク質の精製方法として、Cohn Ethanol Fractionationが知られているので、それを当たるのも手です。Cohn法では、厳密な条件のコントロールが必要です。例えば、温度(4℃)、pH(酸性から中性に徐々に上げていく)、塩濃度、EtOH濃度(徐々に上げいく)により、血漿から段階的にタンパク質画分を沈殿させていきます。大雑把に言うと、最初に沈殿化する画分には、高分子(Fibrinogenなど)、続いて免疫グロブリン(IgGなど)、最後に、血漿タンパク質として最も多いアルブミムです。少しの条件設定のミスで、純度・回収率が悪化したり、タンパク変性したりします。機会があれば、Cohn Ethanol Fractionについてもご紹介したいと思います。

    今回、紹介したタンパク質の沈殿化法でも、回収率が悪いとか、純度が悪いとかいった場合は、pH, 塩濃度、温度などを見直してみてください。

    編集履歴
2020/04/09 はりきり(Mr)
2020/05/23 追記 (はじめに、まとめ)
2020/09/23 追記 (酢酸の添加、NaClの添加、検討方法)
2020/11/05 追記 (CTAB沈殿法によるpDNAとRNA/endotoxinの分離)
2020/12/11 追記 (操作法 by Mr.HARIKIRI)

    以上

  • [Virus-Edu] WHO が、新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)の治療薬に関する大規模臨床を開始する – ID13021 [2020/04/09]

    [Virus-Edu] WHO が、新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)の治療薬に関する大規模臨床を開始する – ID13021 [2020/04/09]

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    WHOがCOVID-19治療薬の臨床を開始

    4つの薬剤について大規模な臨床試験を開始。

    1. レムデシビル
      • エボラ出血熱など抗ウイルス化合物(ギリアドサイエンス社)
      • RNA依存性RNAポリメラーゼ阻害(エボラでの効果は確認できていない)
    2. クロロキンとヒドロキシクロロキン
      • マラリア薬
      • 中国の研究では効果があるとされているが、その根拠データは不明
      • クロロキンは細胞実験で多少の効果はあるが、用量が非常に多い
      • ヒドロキシクロロキンは、様々な副作用が知られている
    3. ロピナビルとリトナビルの組み合わせ
      • HIV薬(プロセアーゼ阻害薬)
      • 2000年、米国でHIV感染症の治療に承認されている
      • ロピナビルは、生体内での分解が早い
      • リトナビルは、比較的持続する
      • この組み合わせは、MERSのマーモセットの試験で効果があった
    4. 同じ組み合わせ(ロピナビルとリトナビル)に加えて、
      • ウイルスを不自由にするのを助けることができる免疫系メッセンジャーであるインターフェロンベータ
      • 抗ウイルス効果が期待できるインターフェロンベータの併用だが、副作用も懸念される

    WHO launches global megatrial of the four most promising coronavirus treatments

    https://www.sciencemag.org/news/2020/03/who-launches-global-megatrial-four-most-promising-coronavirus-treatments

    新型コロナウイルスの感染機序

    編集履歴
2020/04/09 Mr.HARIKIRI
  • [rAAV-Design] – 治療用AAV Vectorの設計 – 考慮事項 – ID12947 [2020/06/24]

    [rAAV-Design] – 治療用AAV Vectorの設計 – 考慮事項 – ID12947 [2020/06/24]

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    もとの設計図

    天然のアデノ随伴ウイルス(AAV)のゲノムは、1本鎖DNA (single stranded DNA; ssDNA)です。両端に遺伝子複製に関わるITRがあり、その間にAAVが複製に必要な構成タンパク質や機能性タンパク質の遺伝子が格納されています。

    REP遺伝子とCAP遺伝子は、1本ずつですが、翻訳開始位置をずらして翻訳されタンパク質が作られ、異なる構成タンパク質が作られるという効率的な遺伝子になっています。

    AAVは、ウイルスの中でも最も小さいウイルスの1つのParvoviarusであり、そのコンパクトさは遺伝子を使い回す設計にあるようです。

    図1. AAV Genome Map
    編集履歴
2020/04/08 はりきり(Mr)
2020/06/24 追記(もとの設計図)
追記予定 : Biomarinが開発したF.VIII遺伝子治療AAV5には、FullのF.VIII遺伝子は大きさ的に入らないはずだが、どのような設計を行ったのか調べてみたい。

    治療用の設計

    治療用の設計では、単に遺伝子をカセットしてしまえば済むものではありません。

    効力面では、標的細胞からAAVの血清型を選択することも必要です。

    安全性面では、挿入する遺伝子にリスクがないのかもを考慮しなければなりません。

    詳細については、今後、取りまとめていきたいと思っています。今、思いつく事は、以下の通りの項目です。

    • 発現量関連
      • プロモーター : 強力
      • エンハンサー
    • 効力関連
      • 組織特異性
        • 血清型
      • 生体内分布
        • 中和抗体にすぐにやられなければ、血流に乗り続けて全身に及ぶことが可能なはず
    • 安全性関連
      • 癌化リスク配列
      • 生殖細胞への感染
        • 生体内分布と関連すると考えられる
      • 染色体への挿入
        • AAVベクターでは、rep/cap遺伝子は、目的plasmidに組み込まれないため、AAVの持つ染色体へのインテグレート機能は基本的に持たないが、相同組換えなどの偶然のケースは考えられる
      • 増殖(rcAAV)
    • 中和抗体対策関連
      • 血清型
      • 変異株
        • Lonzaでは、Ancestor AAV株の提供が可能
      • 自然免疫応答(ssDNA)

    AAVのセロタイプの違いや現在の臨床治験、治療応用について解説しますアデノ随伴ウイルス（AAV）とは

    コスモ・バイオ株式会社 -より

    https://www.cosmobio.co.jp/support/technology/a/adeno-associated-virus-aav-apb.asp
    変異修理歴
2020/04/08 Mr.HARIKIRI

    アデノ随伴ウイルス(AAV)ベ クターの開発 と 血友 病B遺 伝子治療 への応用、村 松 慎 一
    Recombinant Adeno-associated Virus Vectors -Application to Gene Therapy bor Hemophilia B-

    https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjsth1990/9/1/9_1_13/_pdf
  • [Bio-Edu] Surfactant – PF-68, PS80 の添加は常識 – 凝集の抑制 – ID12904 [2021/06/19]

    [Bio-Edu] Surfactant – PF-68, PS80 の添加は常識 – 凝集の抑制 – ID12904 [2021/06/19]

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    界面活性剤

    タンパク質の凝集抑制には、古くから界面活性剤 (surfactant)の添加で改善されることが知られている。いろいろな界面活性剤の研究実績が積まれて、現在では、プルロニック (Pluronic)とポリソルベート (Polysorbate)の2種類が、その役割を代表するようになった。抗体医薬品では、殆どがPolysorbate 80が使用されるまでになっており、添加することは常識的なナレッジである。

    凝集と一口で表現しているが、実は、「Aggregate」、「Visible Particle」及び「Sub-visible Particle」に分けて考えられることが多い。凝集抑制剤の効果は、それぞに得意な対象がある。昔は、粒子サイズを測定することができなかったが、今では、目に目えないサイズの粒子を観測できる装置があり、今では、科学的に凝集抑制剤の評価が可能となった。

    • Pluronic
    • Polysorbate

    Pluronic F-68 (ploxamer 188)

    F-68は、凝集抑制に多用される

    特許において、0.001% PF-68の添加することは、常識のようで有る

    – AAVベクターの凝集を防ぐための組成物およびその方法 (特許, 2012)
    【課題】凝集なく、ビリオン、特にＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ビリオンの高濃度ストック溶液を調製するための組成物および方法の提供。

    【解決手段】ビリオン調製物におけるビリオンの凝集を防ぐ方法であって、少なくとも約２００ｍＭのイオン強度を達成するためにビリオン調製物に１種類以上の賦形剤を添加することを含む、方法。高いイオン強度および適度な浸透圧のこの組合せは、クエン酸ナトリウムのような高い価数の塩を用いて達成される。

    https://patents.google.com/patent/JP2014111625A/ja

    AAV Purification by Iodixanol Gradient Ultracentrifugation – イオジキサノール勾配超遠心によるAAV精製

    https://www.addgene.org/protocols/aav-purification-iodixanol-gradient-ultracentrifugation/

    その他情報

    製品情報、毒性関連、分析手法など。

    • molecular weight : 8.4kDa (approx.)
    • 製品
      Non-ionic surfactant (100x) – Thermo Fisher Scientific –
      https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/24040032
    • 哺乳類細胞培養液中の界面活性剤プルロニックF-68の測定のためのアッセイの開発 (1998)
      –
      • 動物細胞培養液中のプルロニックF-68の比色測定法
      • 以前に肝臓組織でプルロニックを測定するために開発された「チオシアン酸コバルト」との複合体の形成に基づく
      • 複合体の吸光度を328 nmで測定にり感度アップ
      • 複合体を酢酸エチルで洗浄 → アッセイの再現性が向上
      • 培養液の未知の成分によって引き起こされる干渉を低減には、臨界量のエタノールの添加が必要
      • 無血清培地でのプルロニック濃度が0.01から0.2％（w / v）の間で直線的
      • 0.01％（w / v）の低い検出レベルでは、相関係数（R2）は0.998
      • 培地中血清の存在は、感度を低下させるが、0.04から0.16％（w / v）プルロニックまで直線的
      • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9735146/
    • F-68は、試験した範囲の用量で末梢運動、感覚、または動機付けの影響を混乱させることなく、神経伝達物質の取り込みと放出を減らし、ラットに学習と記憶障害を引き起こす
      https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC311314/
    • 細胞培養の攪拌翼により生じる剪断力から細胞を保護、トリプシン損傷細胞を修復し膜の多孔性の減少、細胞付着を低減する :
      Pluronic Enhances the Robustness and Reduces the Cell Attachment of Mammalian Cells –
      https://www.researchgate.net/publication/5523814_Pluronic_Enhances_the_Robustness_and_Reduces_the_Cell_Attachment_of_Mammalian_Cells/link/09e414fa0ed97088ed000000/download
    • プルロニック F-68の分析方法 (2010):
      Determination of Pluronic F-68 in High Protein Matrices by HPLC-RAM-ELSD, – Helen Chung, Melissa Khor, and Jinshu Qiu* Amgen Inc., One Amgen Center Dr., Thousand Oaks, CA 91320
      http://imtakt.com/jp/Support/UserReport/@USA-Amgen/2010-05-18_HPLC_2010_Poster_v3.pdf
      • Cadenza HS-C18 (150 x 3.0 mm, 3μ)
      • restricted access media (RAM) 固定層
      • HPLC system
        • pump, 0.4 mL/min
        • autosampler
        • column switching valve
        • evaporative light scattering detector (ELSD)
      • 0.1% acetic acid (HAc)
      • 0.1% HAc in acetonitrile
      • gradient elution
        • 0 – 5.0 min : 0% B
        • 5.1 – 10.0 min : 10% B
        • 10.1 – 15.0 min : 45% B
        • 15.1 – 25.0 min : 100% B
        • 25.1 – 35.0 min : 0% B
      • Proteins eluted in the void volume
      • while PF-68 eluted at 14.5 min
      • sensitivity (10 mg/L quantitation limit)

    Polysorbate

    特にPolysorbate 80は、日本油脂から高純度品が市販されたことで、多くのバイオロジクスで使用されている。

    molecular weight : 1,310 Da

    Information for the package leaflet regarding polysorbates used as excipients in medicinal products for human use – EMA/CHMP 2018

    https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/draft-information-package-leaflet-regarding-polysorbates-used-excipients-medicinal-products-human_en.pdf

    BIoPharm International 22(6) 32-48 Best Practices for Formulation and Manufacturing of Biotech Drug Products

    https://www.researchgate.net/publication/279558359_Best_Practices_for_formulation_and_manufacturing_of_biotech_drug_products

    Concise Review: Considerations for the Formulation, Delivery and Administration Routes of Biopharmaceuticals

    https://www.heighpubs.org/hjb/abb-aid1004.php

    参考　UF/DF関連

    Control of Protein Particle Formation During Ultrafiltration/Diafiltration Through Interfacial Protection (2014)

    この研究は、限外濾過/ダイアフィルトレーション（UF / DF）中のタンパク質粒子形成のメカニズムを調査し、攪拌がタンパク質界面の吸着と脱着を促進することにより粒子形成を促進することを発見しました。導電率が低く、界面活性剤が存在しているため、小規模の攪拌試験では粒子形成のレベルが低下し、ポンプとUF / DFでも同じ傾向が見られました。ポリソルベート80（PS80）およびヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（HPβCD）は、UF / DFでの粒子形成をそれぞれ15倍および4倍減少させました。構造安定性、コロイド安定性、および表面張力の測定により、PS80がタンパク質界面の吸着を防ぐことで粒子形成を防ぎ、低導電率がタンパク質のコロイド安定性を改善し、HPβCDの作用メカニズムが不明であることを示しました。

    Control of Protein Particle Formation During Ultrafiltration/Diafiltration Through Interfacial Protection
    編集履歴
2020/04/07 はりきり(Mr)
2020/05/26 追記 (PF-68の事例)、誤記訂正
2021/06/19,追記 (Aggregate, Visible particle, Sub-visible particleについて少し解説)