[Bio-Edu] Plasmid – バイオロジクスには欠かせない遺伝子組換え技術、そして rAAVを作るまで! – AAV Vector配列の例 [2020/08/05]

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はじめに

rAAV: recombinant Adeno Associated Virus による遺伝子治療薬の開発には、遺伝子組換え技術が使われている為、この知識がなくてはならい。

rAAVを作るには、これまでのタンパク質を作ることとは、何倍も複雑かつ多数の手間が掛かっている。

遺伝子組換え技術からrAAVを作るまでの基礎知識を解説する。

編集履歴
2020/04/07 はりきり(Mr) まずは、遺伝子組換え技術
2020/06/21 追記(rAAV作成に必要なベクター製品)
2020/08/04 追記(必要なPlasmidとその機能)

まずは、遺伝子組換え技術

1)　遺伝子工学の技術

遺伝子工学の技術 – 福岡大学 –
http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/genetech.htm

以下の用語は、同義である。

遺伝子工学 (gene technology, genetic engineering)
遺伝子操作 (gene manipulation)
遺伝子組換え技術 (recombinant DNA technique)

これら技術は、1970年代に発見された以下の要素で構成されている

制限酵素 (遺伝子の特定部位を切断する酵素)
逆転写酵素 (DNAからmRNAが作られるが、逆に、mRNAからDNA(cDNA)を作る(転写する)酵素
リガーゼ (別々のDNA断片にそれぞれ、認識特異配列を認識してDNAを繋ぐ酵素)

ベクター

有用と考えた遺伝子配列を細胞に組込む場合、先ず、ベクターという器にその遺伝子配列を載せなければならない。ベクターには、以下のものがある。

ファージ
ウイルス
プラスミド (Plasmid) : 多くのバクテリアの核外の遺伝子で、組換技術用にデザイン・改変された鋳型となるPlasmidが市販されている)
コスミド
酵母人工染色体

大腸菌とPlasmid

大腸菌(E.coli)は、2μmのソーセージの形をしていて、至適な環境では25分で2倍に分裂増殖する。4μmに成長すると中央がくびれて2個になる。菌の中央に位置する染色体DNAは、4000個の遺伝子をコードしており2本鎖で環状である
多くの大腸菌株には、染色体DNA以外に小さい環状の2本鎖DNAを持ち、これをPlasmidといいい、染色体DNAと同様に分裂増殖する際に複製される
Plasmidの種類として大きく分けてR (resistant)-Plasmid, F (fertility)-Plasmid (雄株が持つ)がある。
- Rプラスミド: 薬剤耐性の遺伝子を含む
- Fプラスミド: 雌株に接合してFプラスミドを伝達する機能
雄の大腸菌は、雌の大腸菌の細胞内に自分のPlasmidを挿入する過程で自分の染色体DNAを伝達することがあり、遺伝子の交雑が起こる
以上の現象などから、遺伝子組換え技術が考案され、大腸菌間の遺伝子組換えを人為的に行える技術が確立されできた。
- 自然界にPlasmidが存在する
- そのPlasmidの機能を利用するのが、遺伝子組換え技術

制限酵素

遺伝子組換え技術における「ハサミ」である。ThermoFisherには概説。制限酵素の一覧は、TaKaRaを参照

それぞれ種々の配列を認識して切断する多数の制限酵素が知られている
EcoRI (図1参照)は、GAATTCと相補的(CTTAAG)に結合しているDNAを選択的に、「のり代」のある形に切断する
- G-AATTC (CTTAA-G) : ‘-‘で切断

2)　大腸菌と組み換えDNA技術

大腸菌と組み換えDNA技術
京都 WEB マガジン現代アートとサイエンス No.11
https://plasmid.med.harvard.edu/PlasmidRepository/file/map/pAAV-MCS.pdf

DNAリガーゼ (ligase)

遺伝子組換え技術における「のり;糊」であるsource

Plasmid (環状DNA)の一部の領域に制限酵素により「のりしろ」付き状態にしたところに、目的遺伝子(同様に「のりしろ」状態)を結合させて、環状DNA(Plasmind)にする酵素
DNAの末端同士をリン酸ジエステル結合させる

大腸菌にタンパク質を作らせる

最も初期の遺伝子組換え技術の応用例として、糖尿病治療薬のインスリン、ウイルス抑制因子のインターフェロンの大腸菌による生産がある
天然のPlasmidを鋳型として、適切な位置にインスリンやインターフェロンをコードした遺伝子配列を挿入し、デザインしたPlasmidを作る
- まず、

Competent Cell

Competent Cellとは、Plasmidを細胞内に導入しやすいようにダメージ処理が施され安定保存された細胞のことsource、wikipedia

カルシウムイオン存在下で冷却処理(膜透過性の増大)
凍結保存(-80℃以下)

製品

XL-Blue Competent Cells(Agilent)

XL2-Blue UltraCompetent Cells
XL1-Blue SuperCompetent Cells
XL1-Blue Electroporation-Competent Cells
XL1-Blue Competent Cells
XL-2-Blue Subcloning Grade Competent Cells

特徴

プラスミドベクター/ラムダファージベクターの両ベクターの増幅に両できる菌株
表現系: EndA(-)
Plasmid DNAの増幅/回収に適したCompetent Cell
Blue/White スクリーニング、ファージミドDNAのsingle-strandレスキューが可能
F7エピソームは、抗生物質耐性
XL1-Blue : エレクトロポレーション・コンピテント・セル(>=1e9)
- 遺伝子型: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’proAB lacI^qZ△M15 Tn10 (Tet^r)]
XL2-Blue : ウルトラコンピテント・セル(>=5e9)
- 遺伝子型: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’proAB lacI^qZ△M15 Tn10 (Tet^r) Amy Cam^r]^a
カルタヘナ対応が必要

rAAVを作る

必要なPlasmidとその機能

ベクタープラスミドとヘルパープラスミドには、共通する塩基配列があると、相同性組換えによって野生型のウイルスの出現の可能性が高まるため、共通配列が存在しないようにデザインする。

ベクタープラスミド (Vector Plasmid)
- 目的は、目的遺伝子の挿入
- 両端のITRのみを残し、目的遺伝子を挿入
Rep/Cap プラスミド (Rep/Cap Plasmid)
- 目的は、DNA複製タンパク質とカプシドタンパク質をコードする遺伝子の挿入
ヘルパープラスミド (Helper Plasmid)
- 目的は、AAVの増殖に必要なadenovirus由来遺伝子の挿入　(宿主のHEK293には、更に必要となるE1A, E1Bを持っているため、これらは必要ない)
- E2A, VA, E4 or f6

3) AAVを利用した遺伝子治療

4. AAVを利用した遺伝子治療 – ウイルス　第57巻　第1号 pp.47-56, 2007 –
http://jsv.umin.jp/journal/v57-1pdf/virus57-1_047-056.pdf

Vector製品

Vectorは、Plasmid構造になっています。「運び屋」の別名を特に付けている訳です。

Agilent社のベクター製品

recombinant AAVを生産させるための材料として、どのようなものが必要なのか理解することができる。

(1)目的遺伝子ベクター、(2)rep/capベクター、および(3)Helperベクター、の3つのベクターを、感染性AAV粒子を作るために必要な補間遺伝子をコードするHEK293細胞に同時感染させ、感染性recombinant AAV (rAAV)を作成するための製品群。

pCMV-MCSベクター
- 4.5kb
- クローニング・ベクター
- マルチクローニングサイトに目的遺伝子をクローニング → 「pAAV-CMV-MCSベクター」作成
  - 同時トランスフェクション
- pAAV-MCS、pAAV-LacZへサブクローニグ可能
pAAV-LacZベクター
- 7.3kb
- クローニング・ベクター/コトロール・ベクター
- LacZはレポーター
- pAAV-MCSを作るため自立複製能を持たないAAVベクター
- Not IでLacZカセットの切り出し、pCMV-MCSベクターから取り出した目的遺伝子カセットクローニングできる →「pAAV-MCSベクター」作成
  - 同時トランスフェクション
pAAV-RCベクター
- 感染性があるrAAV2粒子を作るのに必要
- rep/cap遺伝子 (DNA複製タンパク質/カブシドタンパク質)
- 同時トランスフェクション
pHelperベクター
- rAAV2発現用
- AAV-293細胞との組み合わせで機能する
- Adenovirus由来遺伝子(E2A, E4, VA RNAs)
- AAVのlytic phaseの誘発
- 同時トランスフェクション
AAV-293細胞
- Adenovirus由来の遺伝子をコード(E1A, E1B)
- トランスフェクション用細胞
AAV-HT1080細胞
- ウイルスのタイター測定用細胞

4) AAV Helper-Free System

AAV Helper-Free System
Agilent (ストラタジーン)
https://www.chem-agilent.com/contents.php?id=300079

AAV Vector

Example

図1. pAAV-MCS ベクター

Type	Name	Description	Start Position	End Position
viral LTR	ITR	AAV inverted terminal repeat	0	0
promoter	CMVp	CMV promoter for mammalian expression	0	0
gene fragment	bgexII	beta-globin exon II fragment	0	0
gene fragment	bhIVSII	bgIVSII fragment	0	0
MCS	MCS	MCS (EcoRI, NotI, BamHI, SalI, XhoI, BlgII)	0	0
gene fragment	bgexIII	bgexIII fragment	0	0
viral LTR	ITR	AAV inverted terminal repeat	0	0
ssDNA origin	F1 ori	F1 origin for ssDNA production	0	0
selectable marker	ampR	ampicillin resistance gene	0	0
bacterial origin	ColE1	ColE1-type bacterial origin	0	0

https://plasmid.med.harvard.edu/PLASMID/GetVectorDetail.do?vectorid=221

5) AAV – wikipedia

AAV – wikipedia
https://ja.wikipedia.org/wiki/アデノ随伴ウイルス

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はじめに