[Bio-Edu] Plasmid – バイオロジクスには欠かせない遺伝子組換え技術、そして rAAVを作るまで! – AAV Vector配列の例 [2020/08/05]

rAAVを作る

ベクタープラスミドとヘルパープラスミドには、共通する塩基配列があると、相同性組換えによって野生型のウイルスの出現の可能性が高まるため、共通配列が存在しないようにデザインする。

ベクタープラスミド (Vector Plasmid)
- 目的は、目的遺伝子の挿入
- 両端のITRのみを残し、目的遺伝子を挿入
Rep/Cap プラスミド (Rep/Cap Plasmid)
- 目的は、DNA複製タンパク質とカプシドタンパク質をコードする遺伝子の挿入
ヘルパープラスミド (Helper Plasmid)
- 目的は、AAVの増殖に必要なadenovirus由来遺伝子の挿入　(宿主のHEK293には、更に必要となるE1A, E1Bを持っているため、これらは必要ない)
- E2A, VA, E4 or f6

4. AAVを利用した遺伝子治療 – ウイルス　第57巻　第1号 pp.47-56, 2007 –
http://jsv.umin.jp/journal/v57-1pdf/virus57-1_047-056.pdf

Vectorは、Plasmid構造になっています。「運び屋」の別名を特に付けている訳です。

recombinant AAVを生産させるための材料として、どのようなものが必要なのか理解することができる。

(1)目的遺伝子ベクター、(2)rep/capベクター、および(3)Helperベクター、の3つのベクターを、感染性AAV粒子を作るために必要な補間遺伝子をコードするHEK293細胞に同時感染させ、感染性recombinant AAV (rAAV)を作成するための製品群。

pCMV-MCSベクター
- 4.5kb
- クローニング・ベクター
- マルチクローニングサイトに目的遺伝子をクローニング → 「pAAV-CMV-MCSベクター」作成
  - 同時トランスフェクション
- pAAV-MCS、pAAV-LacZへサブクローニグ可能
pAAV-LacZベクター
- 7.3kb
- クローニング・ベクター/コトロール・ベクター
- LacZはレポーター
- pAAV-MCSを作るため自立複製能を持たないAAVベクター
- Not IでLacZカセットの切り出し、pCMV-MCSベクターから取り出した目的遺伝子カセットクローニングできる →「pAAV-MCSベクター」作成
  - 同時トランスフェクション
pAAV-RCベクター
- 感染性があるrAAV2粒子を作るのに必要
- rep/cap遺伝子 (DNA複製タンパク質/カブシドタンパク質)
- 同時トランスフェクション
pHelperベクター
- rAAV2発現用
- AAV-293細胞との組み合わせで機能する
- Adenovirus由来遺伝子(E2A, E4, VA RNAs)
- AAVのlytic phaseの誘発
- 同時トランスフェクション
AAV-293細胞
- Adenovirus由来の遺伝子をコード(E1A, E1B)
- トランスフェクション用細胞
AAV-HT1080細胞
- ウイルスのタイター測定用細胞

AAV Helper-Free System
Agilent (ストラタジーン)
https://www.chem-agilent.com/contents.php?id=300079

Type	Name	Description	Start Position	End Position
viral LTR	ITR	AAV inverted terminal repeat	0	0
promoter	CMVp	CMV promoter for mammalian expression	0	0
gene fragment	bgexII	beta-globin exon II fragment	0	0
gene fragment	bhIVSII	bgIVSII fragment	0	0
MCS	MCS	MCS (EcoRI, NotI, BamHI, SalI, XhoI, BlgII)	0	0
gene fragment	bgexIII	bgexIII fragment	0	0
viral LTR	ITR	AAV inverted terminal repeat	0	0
ssDNA origin	F1 ori	F1 origin for ssDNA production	0	0
selectable marker	ampR	ampicillin resistance gene	0	0
bacterial origin	ColE1	ColE1-type bacterial origin	0	0

AAV – wikipedia
https://ja.wikipedia.org/wiki/アデノ随伴ウイルス