![[Bio-Raw Material] Protein A resinの簡単な説明 [2020/06/01]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/08/0C73DA60-4196-4AFF-9BF0-94BD726CDB1B.jpeg)
抗体を産生株した培養液は、清澄ろ過してから、Protein AカラムによるBinding/Elutionモードで抗体のアフィニティ精製を行う。
Mab Select SuRe
Amsphere A3
![[Bio-Material] ポリッシング用精製担体 – CHT (セラミック・ハイドロキシアパタイト)とは、BIO-RAD – ID9865](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/02/3BC25012-9BE8-4F31-9E96-E2F6B375C791.jpeg)
ヒドロキシアパタイトには、正電荷を持つカルシウムと負電荷を持つリン酸基の 2 種類の結合部位があります。 これらの部位は、マトリックスの結晶構造を介して定期的に分配されます。 溶質種は主として、リン酸基を介した陽イオン交換および/またはカルシウム原子を介した金属アフィニティーによって相互作用します。
CHT セラミックハイドロキシアパタイト Type II 担体, BIO-RAD
https://www.bio-rad.com/ja-jp/product/cht-ceramic-hydroxyapatite-type-ii-support?ID=a642d16e-5ca8-4981-acf2-a57271984632
| Type | Particle Size (μm) | 焼結温度(℃) |
| I | 20 | 400 |
| I | 40 | 400 |
| I | 80 | 400 |
| II | 20 | 700 |
| II | 40 | 700 |
| II | 80 | 700 |
| 機能グループ | Ca2+、PO43-、OH | |
| さまざまな粒径が使用可能 | 20、40、および 80 µm (公称値) | |
| 推奨される線流速 | 50 ～ 1,000 cm/時 | |
| 動作 pH 範囲 | 6.5–14 | |
| 化学的適合性 (>24 時間) | 1 M NaOH、8 M 尿素、8 M 塩酸グアニジン、エタノール、メタノール、100% アセトニトリル | |
| 再生 | 0.4 ～ 1.0 M リン酸バッファー、0.5 M リン酸ナトリウム pH 7 リン酸 3 ナトリウム 1.0 M、pH 11 ～ 12 | |
| 消毒 | 1 ～ 2 N NaOH | |
| オートクレーブ滅菌 ( 121µC、20 分) | はい | |
| 充填密度 (g/ml 充填ベッド) | 0.63 g/ml | |
| タイプ I | タイプ II | |
| 動的結合能 | >25 mg リゾチーム/g | >12.5 mg リゾチーム/g |
| 標準的な IgG 結合能 (500 cm/時の場合) | 25 ～ 60 mg/ml | 15 ～ 25 mg/ml |
| 公称孔径 | 600–800 Å | 800–1,000 Å |
| 最大動作圧力 | 100 bar (1,500 psi) | 100 bar (1,500 psi) |
| タイプ I | タイプ II | |
| 観察された IgG の動的結合能 | 25 ～ 60 mg IgG/ml CHT* | 15 ～ 25 mg IgG/ml CHT** |
| 標準的な線流速の範囲 | 50 ～ 1,000 cm/時 | |
| pH 安定性*** | 6.5 ～ 14 pH | |
| ベース安定性 | 1 N NaOH で 21 か月以上 | |
| 再生 | 500 mM リン酸ナトリウム、pH 7 | |
| リン酸 3 ナトリウム 1,000 mM、pH 11 ～ 12 | ||
| オートクレーブ滅菌 (バルク) | 121°C、リン酸バッファーに 20 分、pH 7 | |
| 消毒 | 1 ～ 2 N NaOH | |
| 推奨されるカラム保管法 | 0.1 M NaOH | |
| 有効期限 (ドライ、未使用原料) | 乾燥し、密閉され、室温で 85 か月保管 |
* 40 µm 粒子、300 cm/時、5 mM リン酸ナトリウム、pH 6.5
** 40 µm particles, 300 cm/hr, 5 mM sodium phosphate, pH 6.5
*** pH 5.5 ～ 6.0 については、セクション 3.1.1 バッファーおよびテーブル 1 を参照してください
編集履歴 2020/02/20 Mr.はりきり 2020/07/29 文言整備
![[Bio-Equip] Thermo Fisher 「CaptureSelect」 – AAV1~AAXをキャプチャリングできるAffinity resin – [2019/09/21]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/09/50CCA365-22B1-4985-8251-93F72B93CE10-1200x598.jpeg)
ID2320
CaptureSelectは、複数種類のアデノ随伴ウイルス(AAV)に対応するアフィニティ精製用の樹脂(resin)です。
抗体医薬での精製方法がプラットフォーム化されているように、遺伝子治療薬のデリバリーシステムであるAAVの精製に欠かせない担体です。
CaptureSelectは、抗体医薬のキャプチャリングとして使用するProtein Aレジンに相当するステップに使用します。
動画による説明 : CaptureSelect
ラクダ抗体を利用したAffinity Resin技術
Binding Capacity: >10e13~10e14
ウイルスベクター精製用 POROS CaptureSelect 樹脂および試薬 , より
吸着・溶出してAAVを精製した後は、レジンの再生処理が必要です。十分な洗浄を行って、再利用することで実製造でのコスト低減が可能でなければなりません。0.5M NaOHなどのアルカリ再生処理が可能であることに越したことはありませんが、リガンドがタンパク質なのでアルカリ洗浄には対応していないようです。3M GuHClでの再生処理が可能であるので、取り敢えずは合格というところでしょうか。本当はアルカリ耐性が欲しいところですが。
1) データシート
Enabling technologies for efficient downstream processing of biosimilars, vaccines and gene therapy vectors:
https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/latin-america/promotions/pdf/bioproducao/12-Shelly-Parra-Efficient-downstream-processing-of-biosimilars-vaccines.pdf
2019/09/21, Mr.Harikiri
2021/11/02,追記(解説、再生処理)
![[rAAV-DSP] AVB Sepharose High Performance – ID2292 [2019/09/21]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/09/4D7683CD-1478-4BEE-9D00-A9B2DD72F17A-e1579691135896.jpeg)
低pH溶出と比較して、高pH溶出および0.5または1.0 Mアルギニンでは、収量は低下したが、アルギニンを含む高pH溶出バッファーは、AAV純度が高くなることを示しており(260/280)、高pH溶出は、低pHでは敏感なウイルスを精製するための代替手段となる。
AVB SepharoseTM High Performance, GE Healthcare
https://gels.yilimart.com/Assets/Images/doc/file/28411211_DATAFILE_01.PDF
2019/09/21, Mr.HARIKIRI
![[rAAV-Edu] POROS CaptureSelect (AAV精製 resin) の性能とAEXによるfull/emptyの分離 – ID2271 [2019/09/18]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/09/5BC112DC-1A71-4B2C-898F-FF446927181A.jpeg)
POROSは、Thermo Fisherのブランドです。以前は独立したメカーでしたが、M&Aで傘下になっています。POROSプランドでAAVをキャプチャー精製する製品は、CaptureSelect(TM)というものがあります、そのラインナップは、AAV8, AAV9, AAVXです。AAVXレジンは特別で、血清型の違いに関係なく高い吸着性能を持っています。すなわち、1つのレジンで精製方法をプラットフォーム化することが可能です。
これは、抗体医薬で使用されるていProtein Aレジンと同様の位置付けに等しい将来性のあるレジンです。
ラクダの重鎖抗体を応用したnonobody技術により、AAVに対する結合性のあるLigandをPorosレジンにカップリングした製品である。
CaptureSelectのラインナップの内、AAVXは殆どのAAVの血清型に対して高い親和性を有している。
AAVXレジンと各血清型のAAV (培養、抽出、清澄化したサンプル液)を混合し、チューブ内で10分間の吸着反応させる系で、溶出バッファー(0.1M citric acid, pH2)により回収した溶出液をqPCRでvgを測定し、その回収率を評価している。
その結果、AAV1(99.63%), AAV2(97.8%), AAV2_HSPG(98.33%), AAV4(98.05%), AAV5(97.88%), AAV6(97.45%), AAV6.2(98.93%), AAV7(98.37), AAV8(97.76%), AAVrh10(96.28%), AAVrh32.33(99.29%), AAV9PHPB(98.51%), AAV7m8(98.39%)、と多数の血清型のAAVを高い効率で吸着・溶出が可能であることが示されている。
比較に使用したレジン
その結果、下図のように、AABレジンでは、AAV8, AAV9、AAV10を吸着できるものの60%から80%程度の吸着能しかないことが示されている。AABレジンの製品仕様ではAAV1, AAV2, AAV3及びAAV5で使用できるとあることから、当然の結果である。
CsCl2密度勾配の超遠心処理で精製した遺伝子が封入されていないempty AAVと封入されているfull AAVを混和して、AEXカラムであるPOSOR HQカラムにアプライしてクロマトグラフィーを行うと、emptyとfullを分離できる。
Overcoming downstream purification challenges for viral vector manufacturing: enabling advancement of gene therapies in the clinic: https://pdfs.semanticscholar.org/935c/2e2ee928ba35ebbe22bf43c2e5e1ebe1a4f0.pdf
Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0166093406004022?via%3Dihub
Review – ラクダが持つ不思議な抗体の魅力:https://harikiri.diskstation.me/myblog/biologics/2300/
2019/09/18, Mr. Harikiri
2021/11/02,記載整備
![蛋白質の精製装置とその精製 [2019/08/25]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/08/8C1F08FE-6501-4ABA-9B84-E5DD120721D9-1200x976.jpeg)
もう40年も前から蛋白質の精製装置は開発されている。当時はPharmaciaという社名の企業で市販されていたFPLCという装置が有名だった。
今では、Pharmaciaの社名なくなり、GE Healthcareに変わっていて、精製装置のブランド名は、AKTAになった。
GE Healthcareは、今年中には、GEの業績が不振なことから放出されて、別会社の子会社となるようだ。
引用元 : https://www.gelifesciences.co.jp/newsletter/biodirect_mail/technical_tips/tips60.html
一般的に蛋白質は、熱や有機溶剤に弱く、変性してしまうため、有機化合物のようには精製できない。
蛋白質の精製では、水溶液状態を維持しながら精製工程を進めて純度を上げていく必要がある。
そこで、液体をハンドリングする液体クロマトグラフィーであるFPLCやAKTAの出番となる。
蛋白質の精製とは、液体をどうコントロールするかということであり、言い換えるとその液体組成のコントロールをいかにするかに尽きる。
主要な溶液組成は、塩濃度を表す電気伝導度 (conductivity)とpHの2つが基本となる。
これらの組み合わせを作り出し、精製の舞台となる担体という場で蛋白質の精製を行う。
担体とは、蛋白質と相互作用がある樹脂と定義できる。
担体は、通常ビーズ状でありその大きさは50~100μmφ、樹脂(Resin)ともいう。
粒子であるため、粒子と粒子の間に水分を濾(こ)すことができる。
具体的には、ガーゼのようなもので樹脂を捕捉し、水分と分離させる。
実際には、樹脂より小さい網目のハードメッシュを円筒の上下につけて樹脂を挟み込んでカラムという筒に充填し、このカラムの片方から液体を流し、もう一方から液体を出すという原理で、担体を使用する。これをクロマトグラフィという。
樹脂(resin)といっても、昔は天然の素材からつくるセルロース系しかなかったが、今日では、合成樹脂(ビニル系など)が使われる。
精製をしようとしている目的蛋白質と不純物質(木吹物質の分解物や重合物、原料上混入してくる産生細胞由来のDNA,細胞成分など)を担体との相互作用によって分別する。
担体は、以下の種類のものを選択する。1種類の担体での精製では不十分であるため、相互作用が異なる単体を選択する。多くても3種類の担体が使用される。
先ず、陰および陽の電荷を持つイオン性のリガンドと呼ばれる低分子化合物を担体に結合させているイオン交換体があげられる。
これらの担体には、親水性の素材が通常使われている。
次に、電荷を持たないが、疎水性の担体がある。これらの担体の性質を併せ持つマルチモーダルな担体もあり、昔らか高度に精製したい場合に、使用されていたハイドロキシアバタイト(リン酸カルシウム塩: HA)は、今でも高度なタンパク精製に使用される。
更に、目的蛋白質と強い特異性で結合できるリガンド分子を担体に結合させたアティニティ担体がある。
アフィニティ担体として、一般的に良く知られているのが、Protein A担体である。血漿分解由来の凝固系蛋白質は、ヘパリンに親和性を持つものがおおく、ヘパリン担体もアフィニティ担体と呼ばれる。
通常は、蛋白質精製装置(AKTAなど)を使用してカラム・クロマトグラフィーを行う。
また、カラム・クロマトグラフィー工程のつなぎの工程として、UF/DF処理、沈殿化処理、ウイルス除去フィルターろ過なども実施される。
2019/08/25 記載 2020/02/01 改定(個別の工程の説明を分離しそれぞれ個別に説明) 2020/02/18 文言整備、Desktopでは2カラム化(右にフローチャート配置) 2020/10/04 体裁変更
![[Bio-Edu] 血漿由来の抗体精製 – Poll AcroSep resin), 2009 – ID14 [2019/08/12]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/08/9903D49B-B662-4FFD-AB79-1F4DEF6F692C.jpeg)
2019年現在、抗体医薬品のほとんどは、遺伝子組換えCHO細胞から造られている。これらの抗体医薬品は、特定の疾患に対する特異抗体、即ちモノクローナル抗体である。
今回紹介する血漿からの抗体は、補充療法としての抗体である。ヒトの血漿中にある抗体は、モノクローナル抗体ではなく、様々な抗原にたいする抗体が混合体として存在しており、上述の場合をモノクローナル抗体と呼ぶのに対し、ポリクローナル抗体という。
例えば、川崎病では従来から血漿由来抗体の投与が試みられる。川崎病はウイルス感染をきっかけとして、遺伝子素因に起因すると考えられる異常な免疫反応により血管炎が生じる疾患である。ウイルスは変異をするので、モノクローナル抗体では、変異したウイルスに治療効果はない場合がある。比較してポリクローナル抗体では、治療効果の確率が高くなる、理屈的には考えられる。
余談だが、異常な免疫反応に対しては、抗体では効果はないと考えられるため、抗体で効かない場合は、免疫抑制のあるステロイド剤が使用される。
PlasmaをBlue Trisacryl AcroSep columnでAlbuminを吸着除去し, Mix modeのMEP AcroSep columnでIgGを吸着、EDTAでtransferinを洗浄除去後、IgGをpH5で溶出する
4-Mercaptoethylpyridine (4-MEP)
https://products.pall.jp/jp/ja/Laboratory/Protein-Sample-Prep-and-Detection/ID25/mep–zidgri78m5c
[ED] 免疫グロブリンG; IgG
https://harikiri.diskstation.me/myblog/biologics/8697/
![[Bio-Lab] GE Healthcare PD-10 Column – カスタムな使い方として、中身を取り除いて、好みのレジンを詰める方法 – ID776 [2021/03/10]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/07/901D7AC1-2559-47B4-B477-AF371406C575.jpeg)
中身のレジンを除外して、別のレジンに積み替えて、簡易精製検討に汎用していました。
2019/07/15 Mr. HARIKIRI 2021/03/10 追記 (自家充填の方法)