![[Bio-Equip] Deep Freezer; 超低温保管庫 – ID9756](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/02/759F8453-5970-4ABE-85DF-48A1A8B72F1E.jpeg)
バイオロジクスを研究・製造する場合に必要となる装置について解説しています．
バイオロジクスの場合、製剤化する前の原薬の保管は、殆どが凍結保存であり、一般的には、-80℃のDeep Freezerが使用されています。
その理由は、タンパク質の安定性が、凍結温度が低い程、高くなるためでです。
新しいモダリティーであるmRNAワクチンも例に漏れず、安定性があまり良くないため、-80℃で保存される製品があります。
因みに、安定性は、補助剤の種類とその濃度を最適にすれば高めることも可能です。ただし、薬の効果が低下する場合もあるので、沢山の条件を検討しなければ、安定性と薬効の両方を最適にできる条件を見つけることは難しいのです。
編集履歴 2020/02/17 Mr.HARIKIRI
日本フリーザー
フリーズ超低温槽
![[Bio-Edu] インスリン: Insulinの製法 – ID9405](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2021/02/02EFCDFA-2F1F-4542-819B-78B1FA05C140.jpeg)
http://www.madehow.com/Volume-7/Insulin.html
insulinは、preproinsulinから酵素による分解を受けてproinsulinとなり、更にある酵素により22個のアミノ酸(A鎖)と30個のアミノ酸(B鎖)に分解され、2本の鎖がSS結合してinsulin (5,807Da)となり完成する。
遺伝子組換えによる製造において、製造メーカーにもよるが、以前は、proinsulinを遺伝子組み換えで製造し、別途製造した酵素によりproinsulinを切断してinsulinにする方法が使われていたようで、最近は、A鎖とB鎖を別々に組換え大腸菌で製造し、それぞれを混ぜてco-refoldingすることでfoldしたinsulinを得ているものもあるようです。この条件の詳細についても製造メーカーの技術の見せ所であり、当然、バリエーションが存在しているでしょう。このバリエーションが研究者・技術者の腕の見せ所ですね。
その他、酵母による分泌系・培養→精製・活性化の手順も使い得るでしょうが、酵母の場合、酵母由来の糖鎖の付加の問題が厄介なので、シンプルに大腸菌で生産するのが戦略的には間違いないと考えられます。
2020/02/14 Mr.HARIKIRI
2021/10/23,文言整備
![[Data Link] Continuous Manufacturing in Biotech Processes – Challenges for Implementation – □ID9077 [2020/02/10]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/12/942137B5-42EB-4167-9EFB-8787D7CF1D4F-1200x838.jpeg)
Continuous Manufacturing in Biotech Processes – Challenges for Implementation
https://ispe.org/pharmaceutical-engineering/november-december-2018/continuous-manufacturing-biotech-processes
FDAは、バイオロジクス医薬品の製造に関して連続生産の導入を後押しすると言っている。これにより、技術導入によりコスト低減かが進むため、バイオロジクスへの参入障壁はさらに高まるものと考えられる。乗り遅れてはならない。
連続生産の導入は、培養ではやりやすいが、精製工程は種類も多く煩雑であるため複雑な問題が残る。Repligne社では、培養での長期間の連続培養は、Perfusion Cell Cultureで可能であるとしており、導入する技術として1つの候補となる。しかし、製造におけるロットまたはバッチの考え方を再定義する必要性が生じる。
Perfusion Cell Culture
https://www.repligen.com/applications/perfusion
そもそも、連続化することで得られるメリットは何か? QDCから、Quality (品質)の安定化、Delivery (単位歩留まり辺りの製造期間)の短縮化、Cost (コンスト)の低減化。
品質試験のまとまりとしての範囲・かたまりをどう定義するかについて、根拠をもとに行わなければならない。特に重要なのは、品質に影響することを十分に確認しておななければならない。
管理の方法は、マニュアル式によるサンプリングでは安定的な管理は難しいと考えられるため、自動化技術(PAT)は必須である。
連続生産の場合、その時々の工程液の状態を把握すなければならない。人手によるマニュアル式でサンプリングなどはあり得ないので、工程液の測定に関して自動化技術が必須となってくる。
METTLER TOLEDO製のセンサーについて、連続生産方式による在庫、トレーニングコストの低減化が可能であると述べている。
METTLER TOLEDOのInterigent Sensor Managementと数種類のセンサでは、校正履歴を本体に残せる。医薬品製造では製造記録が必要であり、その記録作業の低減化が施されている。
既存の溶存酸素センサーは、気泡により誤動作する。アンチバブル光学式溶存酸素センサはノイズを除去できる
Pharmaceutical & Biotechnology News 38 ~Perspectives in Liquid Process Analytics~
https://www.mt.com/pro-library-pharma
2020/02/10, MR.HARIKIRI
2021/10/24, 文言整備
Release Testとは、医薬品の製造が正常に実施され、それによって製造された原薬または医薬品について、予め定めた規格試験に合致することを確認する試験であり、確認されることで問題の無い品質として出荷できるお墨付きが与えられる試験である。
MR.HARIKIRIの理解で表現すると、「Comparability Testとは、一般的に原薬のRelease Testを項目を網羅している。すなわち、物性、不純物など多数の項目で構成される品質試験であり、製造法変更などによる同等性を確認する試験群の塊」である。規格試験よりも、更に詳細な物性、例えば「糖鎖分析」、「フリーシステイン数」、「in vitro/in vivoなどによる活性評価」などの試験が追加される。
開発している医薬品の開発ステージが進むほど、高い同等性が求めらめることは当然であり、臨床試験でのPK/PDも必要となる場合もある。
バイオロジクス医薬品は、先行バイオ医薬品と同等性または同質性を持つ医薬品です。ここで、同等性/同質性 (comparability)とは、以下のように理解されます。
バイオロジクス医薬品は、化学合成ではなく細胞や細菌が作り出すため、分子量が大きく構造が複雑です。そのため、同等性/同質性を確保するために厳格な評価が行われます。日本では、バイオ後続品の承認審査が進められており、多くのバイオシミラーが既に承認されています1.
このようなバイオシミラーは、先行バイオ医薬品と同等な品質を持ちつつ、治療効果を提供する重要な選択肢となっています。
詳細情報
3.fujifilmkyowakirin-biologics.com
以上がCoPilotの答えた同等性/同質性の解釈 (2024/06/21現在)．
バイオロジクスは、低分子ドラッグと比較して細胞などの生命原理を利用した製造原理であり、完全に理解されているものではない。また、Upstreamの培養、Downstreamの精製工程も複雑であるため、製造方法は、開発当初から完全な条件設定が完了することはできない。そこで、段階的な最適化が進められるのが通常である。製造承認取得後も、これら製造工程の変更が行われることも多いが、その変更される主な理由は、主に経済性であり以下の通りである。
Potential impact (潜在的影響)としては、不純物が増加したり、目的物質の物性変化、最悪の場合は活性の低下など品質への影響が考えられる。品質以外の結果として、毒性が顕在化することもあり得る。
Potential impactを検出するために、Release Test (出荷試験)にあげられる試験項目の実施の他に、extended Characterization Test (追加的な物性試験)が、追加される。
また、品質における変化があれば、Stability studies data (保存安定性)に影響することも考えられ、悪い影響としては、安定性が維持できず保存期間の短縮化という悪影響も起こり得る。
| 変更箇所 | 考えられるインパクト | 原因 | 試験方法 |
| 培養方法、条件 | 細胞の生理学的(physiology)な影響、プロダクトの変化、C末端Lysの脱落(clipping)、その他翻訳後修飾(post-translational modifications;PTMs) | 細胞の生理的活動の変化による生体化学反応の変化 | N型糖鎖分析(glycoforms)、IEF, SDS-PAGE, SEC, AUC, ESI-MS, Freeチオール、ペプチドマッピング |
| 精製方法、条件 | 重合体(aggregates), 分解物(fragments), 2本作が1本作ずつに乖離(dissociation)など, variants, 不純物(Impurity level) | 成分の変化による相対的なインタラクションの変化 | SEC, AUC, SDS-PAGE, IEX, ESI-MS, oligosaccharide |
| UF/DF, buffer, time | aggregates, fragments, dissociation, conformation, activity | 濃度の変化やシェアストレス、Donnan-Effectによるバッファ組成の変化 | CD, peptic mapping(MS/MS), Cell Based Assay |
Comparability Protocols for Human Drugs and Biologics: Chemistry, Manufacturing, and Controls Information, Guidance for Industry, DRAFT GUIDANCE (2016), 24 page/all
https://www.fda.gov/files/drugs/published/Comparability-Protocols-for-Human-Drugs-and-Biologics–Chemistry–Manufacturing–and-Controls-Information-Guidance-for-Industry.pdf
ICH Topic Q5E
Comparability of Biotechnological/Biological Products, Step 5 (2005), CPMP/ICH/5721/03
https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-q-5-e-comparability-biotechnological/biological-products-step-5_en.pdf
ICH Topic Q5Eの解説 – Brigitte Brake BfArM Germany – @2011 ICH, International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use
https://admin.ich.org/sites/default/files/inline-files/SESSION_II_ICH_Q5E_Comparability.pdf
pmdaサイトにあるQ5Eの文書「生物薬品(バイオテクノロジー応用医薬品/生物起源由来医薬品)の製造工程の変更にともうなう同等性/同室性評価について」
https://www.pmda.go.jp/files/000156276.pdf
2020/02/02, Mr. HARIKIRI 2021/04/17 追記(表1に項目「原因」を追加) 2021/08/16,文言整備 2021/08/27,追記(開発ステージ関連の記載) 2024/06/21,追記(CoPilotの解釈)
![[Bio-Process] 原薬の超低温保管 ID9640 [2020/02/02]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/02/6CC8074B-AED3-4C66-AEDC-F0E171FA16AC.jpeg)
バイオロジクス精製原薬を長期保存するには、除菌ろ過フィルターでろ過、ガス透過性が低いHDPE製のプラスチックボトルに小分け分注(aliquot)し、長期保存も考慮して超低温冷凍庫にて凍結保管する。
従来のバイオロジクスとシンモダリティのAAV Vectorについて個別に解説する。
従来のバイオロジクスである抗体医薬などでは、超低温冷凍庫による保管の期間として3年程度を設定される。
保管されている原薬は、その期間内で製剤化され製品化される。製品化された製剤は、病院での使用前保管を前提に、一般的に液状での保管となり、3年程度の期間の保証がされる。
新モダリティのAAV Vectorに関しては、市販されている製品が一桁と少ないため、そのベストプラクティスのロジスティック戦略を実績を含め示すことは難しい。
ここでは、私が考えるロジスティック戦略について思案を示す。
GORE(R) STA-PURE(TM) Flexible Freeze Container
https://www.gore.com/products/gore-sta-pure-flexible-freeze-container
![[Bio-Process] Sterile Filtration – ID8462](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/02/25AF0E86-110D-4166-B05A-2B2714A8E7F7.jpeg)
Sartorius Stedium
Pioneering Sterile Filtration
![[Bio-Process] Virus Reduction Filtration – ウイルス除去膜 – ID8631 [2020/02/02]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/02/15E29E07-8DAE-4F72-94D2-5C53F6995B32.jpeg)
ウイルス除去をフィルターろ過で実現できることを最初に実用化したのは、AsahiKASEIです。
その先駆者として、現在もなおバイオCMOで使用されている。
ウイルス除去膜工程は、殆どの場合、下流工程じ実施される。
抗体医薬の場合、通常実施される工程である。
rAAV製造において、その必要性があるかは不明であるが、小さいrAAV(20nmφ)より大きないウイルスを除去する目的で、実施する意義はあると思われる。
80L/m2
Planova™ 15N、20N、35N ウイルス除去フィルター
https://planova.ak-bio.com/jp/products_services/virus-removal/planova-n/
![[Bio-Process] Affinity & Polishing chromatography – 抗体の精製 [2021/10/30]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/02/423DC16C-4444-4A16-A0BD-40403E2C6C90.jpeg)
ID8453
タンパク質精製の基本であるクロマトグラフィーには、以下のモードがある。
抗体の精製では、長い歴史があり精製プラットフォームが完成しているため、使用するカラムの種類とその順序は検討する必要は通常ない。それぞれのクロマトの条件についても、検討範囲はある程度狭く限定するとが可能である。
抗体を産生株した培養液は、清澄ろ過してから、Protein AカラムによるBinding/Elutionモードで抗体のアフィニティ精製を行う。
AAV (rAAV)の精製においても、抗体の精製プラットフォームに従うように、レジンの開発が勧められており、Affinity resinの市販品も既に存在する。
Mobius® FlexReady Solutions
https://www.merckmillipore.com/JP/ja/Mobius-Single-Use-Manufacturing/Mobius-FlexReady-Solutions/EcGb.qB.e04AAAFZUuNiYtcV,nav
Single-use for Downstream, GE Healthcare –
https://www.gelifesciences.com/en/us/solutions/bioprocessing/products-and-solutions/downstream-bioprocessing/single-use-for-downstream
2020/02/02, Mr. Harikiri
2021/10/30, 追記(レジンに期待する機能など)
![[Bio-Process] 清澄ろ過/Harvest – 必要な膜面積の求め方 – ID8347 [2020/06/25]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/02/632CB1CB-99EF-4478-BF3C-871597F219D3.jpeg)
ハーベスとは、細胞培養が終了して、次の工程であるクロマト工程にロードするために行う清澄化工程のことです。
昔は、フィルター性能が低かったら異から、連続遠心機が使われていましたが、現在では、フィルターろ過によるハーベストが主流になりました。その別な要因としては、培養スケールが小さくなってきたことも一因です。
処理目的の溶液に対して、ろ過に必要なフィルターの膜面積を求める方法には、3つあります。
| Method | Particle retention | measurement (X-Y dimension) | Constant | Endopoint |
| Pmax | Size Exclusion is primary method | Throughput – Pressure | Flow rate | Maximum Pressure |
| Tmax | Adsorption is general | Throughput – Tubidity | Flow rate | Filtrate Quality |
| Vmax | Size Exclusion is primary mechanism | Throughput – Flow rate | Pressure | Minimum Flow rate |
Filter Sizing Methods
https://www.dcvmn.org/IMG/pdf/5.application_note-_filter_sizing_methods.pdf
日本ポール
https://www.pall.jp
スモールスケールでは、ろ過膜により実施される
rAAVの精製の場合で、細胞を破砕する必要がある場合は、Extraction Processを実施した後、Harvest Processを実施する。
