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[Bio-Culture] 大腸菌; E.coliの増殖率は細胞長の増大に関わる [2021/02/27]
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大腸菌の増殖率

一般的に、大腸菌の増殖率(growth rate)、1時間あたり1未満であり、それを超える増殖率になってくると、大腸菌の長さが増大するのだという。

大腸菌の1時間あたりの増殖率を近似して1だとすると、1時間経てば、大腸菌は2倍に増えることになる。実際には1未満であるので、2倍に増える時間は、1時間より1割増しないし、2割増し程度の見積もりとなる。

一方、大腸菌のダブリングタイムは20分という文献もあり、この文献との整合性については、今後確認したい。

Data from: Threshold effect of growth rate on population variability of Escherichia coli cell lengths (2018)
https://translate.google.co.jp/translate?hl=ja&sl=en&tl=ja&u=https%3A%2F%2Fdatadryad.org%2Fstash%2Fdataset%2Fdoi%3A10.5061%2Fdryad.2bs69&anno=2&prev=search

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2021/02/27 Mr.HARIKIRI
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2021年2月27日
[Bio-Culture] Poloxamer 188 (Pluronic F-68) – バイオリアクターの撹拌翼による細胞のダメージを抑制 [2021/02/24]
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Poloxamer 188

Poloxamer 188という名称は、馴染みがないが、商品名のPluronic F-68はよく知られている。細胞培養において、バイオリアクターの撹拌翼による細胞への物理的ダメージを低減化を目的に培地に添加される。蛋白医薬品(バイオロジクス)においても製品での添加剤として使用され、毒性が少ないことがわかっている。

遺伝子治療用のウイルスベクター、たとえばAAVベクターの安定化剤として使用されることも多い。

Poloxamerは、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンブロックポリマーです。例として、商用グレードのポロキサマー188の不純物には、低分子量物質（アルデヒド、ギ酸と酢酸の両方）、1,4-ジオキサン、残留エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドが含まれます。ほとんどのポロキサマーは、化粧品において界面活性剤、乳化剤、洗浄剤、および/または可溶化剤として機能し、0.005％から20％の濃度で141の化粧品に使用されているようです³⁾。

1)

Development of an Improved Poloxamer 188 – Optimized for Cell Culture Performance (2017)
https://cellculturedish.com/development-of-an-improved-poloxamer-188-optimized-for-cell-culture-performance/

2)

ジスロマックの毒性試験 – pmda –

(poloxamerの毒性は非常に低い)
https://www.pmda.go.jp/drugs/2009/P200900004/40007900_22100AMX00393000_J100_1.pdf

毒性

レビュー論文³⁾には、Poloxamer 188の安全性について評価し、安全であると結論づけられています。

動物の静脈内注射 (Poloxamer)
- 尿中に急速に排泄
- 肺、肝臓、脳、腎臓の組織にいくらか蓄積
ヒトの静脈内注射 (Poloxamer 188)
- 血漿中濃度（エチレン性投与）は1時間で最大
- その後定常状態に達する
創傷治癒
- Poloxamerは一般に創傷治癒に効果がない
- 動物実験に置いて高コレステロール血症と高トリグリセリド血症を引き起こす可能性が示されています
- 術後癒着を減らすのに効果的という報告もあります
- Poloxamer 108, 4g / kgまでの短期静脈内投与
  - 体重に変化がない
  - 腎のびまん性肝細胞空胞化を引き起こした
  - 腎臓の尿細管拡張、および近位曲尿細管の上皮細胞の用量依存的な空胞化を起こした
- 97 mg / m(3)でのポロキサマー101の短期吸入毒性試験
  - 2週間の暴露後に軽度の肺胞炎を確認
  - 2週間の暴露後の観察期間で肺胞炎は治癒した
- Poloxamer 184の1000 mg / kgまでの用量でのウサギにおける短期皮膚毒性試験
  - 組織学的検査でわずかな紅斑とわずかな皮内炎症反応
  - 用量依存的な体重、血液学、血液化学、または臓器重量の変化はなかった
動物実験
- 試験系 : 摂食試験、ラットと犬
  - Poloxamer 188 (最大5%の食餌への暴露)、6ヶ月、ラットと犬、悪影響なし
- 試験系 : 摂食試験、犬
  - Poloxamer 331（0.5 g / kg日（-1）までテスト済み）、悪影響なし
  - Poloxamer 235（1.0 g / kg日（-1）までテスト済み）、悪影響なし
  - Poloxamer 338（0.2または1.0 g / kg日までテスト済み）（-1））、悪影響なし
  - Poloxamer 331（0.5 g / kg日（-1）までテスト済み）、わずかな一過性の下痢
  - Poloxamer 338（5.0 g / kg日）（-1））、犬、わずかな一過性の下痢
- 試験系 : 摂食試験、ラット
  - Poloxamer 188 (最大7.5%食餌への暴露)、2年間、5％および7.5％レベルで下痢、7.5％レベルで成長がわずかに減少、生存率に変化はなし
ラットを使用して0.5mg / kg日（-1）までの用量で2年間、血清の黄色変色、高い血清アルカリホスファターゼ活性、および血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼおよびグルタミン酸-オキサル酢酸トランスアミナーゼ活性の上昇ポロキサマーは最小限の眼刺激性ですが、そうではありません動物の皮膚刺激物または感作物質。ポロキサマーの生殖毒性および発生毒性に関するデータは見つかりませんでした。

AMES試験
- 代謝活性化の有無にかかわらず、Poloxamer 407の変異原性活性は確認されませんでした
発癌性
- いくつかの研究は、Poloxamerの抗発癌効果を示唆
- 多剤耐性癌細胞の抗癌剤に対する感受性を高める
臨床試験
- Poloxamer 188は、大量の下剤治療と組み合わせて使用すると、糞便の水分補給を増加させた
- コントロールと比較して、Poloxamer 188を投与された血管形成術患者の1つの研究では、鎌状赤血球症を患っている患者にPoloxamer 188を投与すると、コントロールと比較して痛みが減少し、入院が減少
- 心筋梗塞サイズの縮小と再梗塞の発生率の低下の臨床試験で、毒性の証拠はありませんが、他の2つの研究では効果が見られませんでした
- 皮膚刺激性および感作性は一様に陰性
化粧品

化粧品成分レビュー（CIR）専門家パネルは、以下のように述べています。

化粧品業界は、免疫グロブリン酸化物、プロピレンオキシド、および1,4-ジオキサンの低レベルを維持するために必要な精製手順を引き続き使用する必要があることを強調しています。

Poloxamerの生殖毒性および発生毒性のデータがないことに留意している。分子量と溶解度に基づくと、皮膚への浸透はほとんどなく、皮膚への浸透は遅いはずである。

また、入手可能なデータは、皮膚暴露以外の経路で体内に導入されたPoloxamerが体から急速に除去されることを示しています。

全体として、入手可能なデータは発がんについての懸念を示唆していない。製品の使用に関する知識にはギャップがあるが、製品の種類に関する全体的な情報が入手可能であり、生殖毒性および/または発生毒性のリスクがないことを示唆しています。

これらの成分が使用されており、どの濃度での使用のパターンを示しています。これらの安全性試験データと、不要な分子を制限するために製造プロセスを制御できるという情報に基づいて、専門家パネルは、これらのPoloxamerは使用しても安全であると結論付けられています。

3)

Safety assessment of poloxamers 101, 105, 108, 122, 123, 124, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 212, 215, 217, 231, 234, 235, 237, 238, 282, 284, 288, 331, 333, 334, 335, 338, 401, 402, 403, and 407, poloxamer 105 benzoate, and poloxamer 182 dibenzoate as used in cosmetics (2008)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18830866/

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2021/02/24 Mr.HARIKIRI
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2021年2月24日
[Bio-Edu] イオン交換クロマトグラフィの原理 – バイオロジクスの製造における基本 [2021/02/13]
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イオン交換の原理を使ったクロマトグラフィ

文字通りイオンを交換反応で結合できる樹脂 (レジン) を使ったクロマトグラフィです。カラムにパックすれば陰イオン交換カラムクロマトグラフィーとなります。パックしない場合をバッチクロマトなどと呼びます。

タンパク質は、アミノ基やカルボキシル基を持っているので、プラス・チャージも、マイナス・チャージも持っています。

等電点 (pI)とは、タンパク質全体として電荷が中和されている状態の溶液pHを指します。因みに、あるタンパク質を等電点にpH調整すると、沈殿すると言われています。

イオン交換分離の原理と分離に影響する4つの因子とは？ – ThermoFisher –
https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/principle-and-factors-of-ion-exchange-separation/

実務では
- 目的タンパク質の等電点(pI)を知る
- 陰イオン交換体に結合させたい場合は、目的タンパク質の電荷を負にするために溶液pHを塩基性に調整する
- 陽イオン交換体に結合させたい場合は、目的タンパク質の電荷を正にするために溶液pHを酸性に調整する
- イオン交換体との結合を弱めたい場合は、pHでコントロールできるか、実務的には塩濃度を上げることで、イオン結合を弱める手法をとる。もちろん両方を組み合わせることも可能。
原理

目的のタンパク質の電荷と溶液中の電荷を帯びたイオンとの競合により、イオン交換体(レジン)との親和性に強度が付くことで、吸着てずにパススルーさせたり、吸着後に溶出させたりする。

タンパク質の場合、弱塩基性、弱酸性のアミノ基を思っており、有効表面電荷の正負および強度に応じて、イオン交換原理によるクロマトグラフィが可能となる。下図のようにpHを酸性から塩基性にタンパク質が溶けている溶液pHを変化させた時、有効表面電化は、プラスチャージのカチオンからマイナスチャージのアニオンに変化していく。電荷がちょうどゼロ(0)になるpHを等電点 (pI)という。

Cytiva, https://www.cytivalifesciences.co.jp/newsletter/biodirect_mail/technical_tips/tips51.html

なぜpHを上げていくと電荷がマイナスチャージになるのか

前述のCytivaの参考文献に示されているように、pHを酸性から塩基性に上げていく場合、なぜ電荷が、プラスからマイナスになっていくのか、その原理を以下に解説します。

酸と塩基・代謝概要 – 熊本大学、平成25年4月15日病態生化学分野 (生化学2)教授、山縣和也 –
http://www.medic.kumamoto酸と塩基・代謝概要-u.ac.jp/dept/biochem2/class/250415-1.pdf

タンパク質は、アミノ酸で作られているので、単純化してアミノ酸で考える。アミノ酸は、アミノ基(-NH2), カルボキシル基(-COOH)を持っており、両性電解質である。例外は、プロリンでアミノ基の代わりにイミノ基を持つ(本当はイミノ酸)。
- pI; 等電点となるpHでは、以下のように解離していて総体としての電荷はゼロである
  - (-NH2) → (-NH3+)
  - (-COOH) → (-COO-)
- 酸(HCl)を添加していくと、H+が増えるため以下の様に乖離して総体として正電荷であり、陽イオン交換体に結合できる
  - (-HN3+) → (-HN3+)
  - (-COO-) → (-COOH)
- 塩基(NaOH)を添加していくと、H+が減るため以下の様に解離して総体として負電荷となり、陰イオン交換体に結合できる
  - (-HN3+) → (-HN2)
  - (-COO-) → (-COO-)
pHとは? – 鈴研株式会社 –
https://www.suzuken-ltd.co.jp/choose/ph/

pHの理解

pHは水素イオン濃度を表しています。単純式は以下の通りです。

pH = ‐log [H⁺]　

水は、以下のように電離しています

H₂O = H⁺ <-> OH^–

pHの最大と最小は、1と14です。水素イオン濃度と水酸イオン濃度を掛けるといつでも14になります。

H⁺濃度 × OH^–濃度 = 10^-14 mol/L

イオンの溶離効果は、1 価より2価の方が高い。
- 陰イオン : Na₂CO₃ > NaHCO₃ > NaOH（KOH)
- 陽イオン : H₂SO₄> メタンスルホン酸 = HCl
イオン交換分離の原理と分離に影響する4つの因子とは？ – ThermoFisher Scientific –
作成者 LATB Staff, 01.19.2017

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2021/02/13 Mr.HARIKIR
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2021年2月14日
[Bio-Edu] タンパク質の「イオン交換体」による精製原理 – 目的タンパク質の物性を知る必要性 [2021/02/25]
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はじめに

タンパク質の精製とは、どのような作業をするのでしょうか? 精製とは目的物と異なる物質を取り除き、目的物質の割合を上げること、すなわち純度を高めることです。

ここでは、イオン交換体を用いたタンパク質の精製の原理について解説します。

イオン交換体

先ず、イオン交換について説明します。その前に，タンパク質はアミノ酸の数珠繋ぎで作られています(ポリペプチド)。具体的には，アミノ酸のアミノ基と隣のアミノ酸のカルボキシル基とがペプチド結合してポリペプチドを作っています．

このポリペプチドの末端や側鎖(アミノ酸ごとの)には，フリーのアミノ基やカルボキシル基は、溶液のpHに応じてイオン化しています。そのイオン化によって、アミノ基(NH2)は、Hが一つ増えてNH3⁺になり正に荷電します。カルボキシル基(COOH)は、逆にHが減ってCOO^–になり負に荷電します。Hを増やすためには、塩酸などの酸を添加します．
1. -NH3+ ⇌ -NH2 + H+
  - (アミノ基は弱塩基であり水に溶けると右の式に傾く)
  - (右の式に塩酸を添加してH+濃度を上げるとアミノ基に戻る)
2. -COOH2+ ⇌ -COOH + H+
  - (カルボキシル基は弱酸であり水に溶けると上記左の式に傾くカルボキシラートイオンになる)
  - (左の式に塩酸を添加してH+濃度を上げるとカルボキシル:-COOH2+基に戻る)
Hを減らすには、NaOHなどの塩基を添加します。アミノ基とカルボキシル基がいずれもイオン化していない状態、すなわちNH2とCOOHになっているpHを等電点(pI)といい、荷電していない状態です。
1. NH2 →(NaOH adding)→ NH- (アミノ基が正荷電する)
2. COOH →(HCl adding)→ COOH (カルボキシル基が負荷電する)
イオン交換体は、負に荷電する合成化合物、または、正に荷電する合成化合物を樹脂(レジン)に結合させているものを言います。陰イオン交換では、陰イオンとイオン結合が可能な正に荷電した合成化合物を結合させたレジンを使用します。

タンパク質の溶解液のpHを調節して、その目的のタンパク質が負に荷電するか正に荷電するかを設定し、それに応じたイオン交換体を用いて、そのレジンにタンパク質を結合させることで、目的のタンパク質を効率よく回収することができます。具体的には、イオン交換体に結合させたタンパク質は、今度はそのレジンから解離させるために、そのイオン結合を切る条件にレジンの環境を変えてやります。すると、目的のタンパク質がレジンから溶出さされます。

イオン交換クロマトグラフィ

レジンの置かれる環境を変化させるために、緩衝液(パッファ)をレジンに添加したり、バッファのみを取り除いたりすることで、レジンの置かれている環境の変化を作ってやります。

具体的には、バッチ法とカラム法があります。以下にそれぞれ説明していきます。

バッチ法

レジンに緩衝液を添加してスパテルでかき混ぜて、レジンの環境の均一化を行います。次に、
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2020/06/22 はりきり(Mr)
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条件の基本は、電気伝導度とpH

conductivityとpHの組み合わせ条件を網羅的に実験します。最初は、吸着条件です。その後、洗浄条件も必要ですが、簡便さを追求する場合は、吸着条件の実験データから目的タンパク質の部分的精製条件とすることも可能です。
- レジンの選定
  - 陽イオン交換
  - 陰イオン交換
  - 疎水担体
  - マルチモーダル
- 電気伝導度(conductivity)
- pH
- その組み合わせ
- レジンの選定
検討の概要
- 陽イオン・陰イオン交換レジン及び疎水担体では、pHとNaCl濃度の組み合わせ
- ハイドロキシアパタイト(HA)では、NaCl濃度とリン酸(K2HPO4)の組み合わせ
- Adhere、MMCでは、陽イオン・陰イオン交換レジンと同様、pHとNaCl濃度の組み合わせを使いますが、遠濃度は、高めの範囲を設定します。
実験方法

レジンの準備
- レジンの洗浄(酸・アルカリ、中和、最後に水に平衡化)
- 遠心してWet volumeを測定
- その一部を採取して、数日乾燥させて、前後の重さを測定
- レジンのwet volume(g)を使用した時、含まれる水の量を見積もる(計算しておく)
出発材料の準備
- 培養上清
- 組成が不明でも良い
- 培養液を水で希釈系列を作る
  - 1倍(希釈無し), 0.1mLを調製
  - 1.5倍, 0.1mLを調製
  - 2.0倍, 0.1mLを調製
  - 5.0倍, 0.1mLを調製
  - 10倍, 01mLを調製
吸着反応とアッセイ
- 培養液の希釈系列にレジンを添加
  - 96 well microplateで(プレートミキサー)も良い
  - 蓋つき試験管でも良い(サクラローターで攪拌)
  - 室温, 1hr
- 分析
  - SDS-PAGE
  - 特異的アッセイ
- 希釈率を決定
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2021/02/25, Mr.HARIKIRI
2021年1月25日
[用語] pDNA ; Plasmid DNA – 染色体とは異なる遺伝子/環状/自己複製/F Plasmid/R Plasmid/ Vector Plasmid [2023/03/25]
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plasmid DNAとは

pDNA ;Plasmid DNA, 輪っか状のダブルストランドDNA．細菌や酵母の細胞内に存在し、染色体DNAとは別の自己増殖性のDNAの総称．

Plasmidは，FとRのPlasmidの発見によって始まった．
1. F Plasmid (性因子)の発見, 1952年
2. R Plasmidの発見, 1960年
3. 制限酵素の発見, 1970年
4. Vector Plasmidの開発, 1977年
F/R Plasmidと制限酵素の発見とVector Plasmidの開発の歴史 (F Plasmid, R Plasmid, Vector Plasmid)が述べられている．
プラスミドの複製調節機構, 日本細菌学雑誌 41 (2), 1986年

プラスミド（Plasmid）：食品安全委員会の用語解説を以下に示しました．「細菌や酵母の細胞内に存在し、染色体DNAとは別の自己増殖性のDNAの総称で、染色体とは別に環状二本鎖 DNA として存在しています。抗生物質に耐性となる酵素等の遺伝子を含んだり、他の遺伝子の DNA 断片を組み込みやすくするため、制限酵素で特異的に切断される領域を有するものがあります。組換えDNA実験では、プラスミドをベクター（目的とする遺伝子又はDNAを宿主に移入し、増殖させ、又は発現させるための運搬用DNA）として用い、宿主内での発現を司るプロモーターやターミネーターのDNA断片とともに目的とする遺伝子のDNA断片を組み込み、宿主への遺伝子導入を行います。」

遺伝子組換え食品等の安全性評価基準の理解の一助となるように、わかりやすく記載していますので、分子生物学の観点からは十分に内容が盛り込まれていない場合があります。
食品安全委員会用語解説

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2020/12/18 Mr. Harikiri
2023/03/25 追記 (参考文献の追加)
2020年12月18日

[Bio-Edu] ウイルスの等電点(pI) – 組換えAAVでは，empty/fullの違いでpIは異なる – 分離精製は工業化の課題である[2021/02/23]

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はじめに

遺伝子治療用のウイルス・ベクターとしてAAVを使用した場合、目的通りに目的の遺伝子をAAVの殻にパッケージングできるとは限りません。導入する遺伝子の大きさが大きい程、その導入効率は低下してくると考えられます。実際に、動物細胞または昆虫細胞に対して、遺伝子導入試薬を使って目的の遺伝子を導入させ(トランスフェクション)、AAVベクターを作る時、目的遺伝が含まれないAAVも多数産生されます。

AAVはヒトにとって病原性が無く最もよく使われるウイルス・ベクターですが、ウイルスの殻は別です．殻を構成するたんぱく質などの抗原性が問題になるため、極力、目的遺伝子を含まないAAVベクター(Empty)については精製で除去すべきです。

目的遺伝子を含むAAVベクター(Full)との分離には、AAVベクターとしての等電点(pI)の違いを利用することが多く、陰イオン交換体を使用したカラムクロマトグラフィが使用できます。

なぜ、FullとEmptyとで、電荷が異なるかについては明確にはわかっていませんが、遺伝子であるDNAのパッケージの有無に関わることから、DNAのマイナス電荷の有無に関わるものと考えられます。完全にパッケージされているなら、その電荷がウイルスの殻の外に影響するとは考えにくいのですが、完全に否定することはできません。パッケージされることでウイルスの殻を構成していカプシドタンパク質のアミノ酸レベルで、プラスチャージのアミノ酸が殻の内側に向くこともあり得ます。その結果、殻の表面の電荷が変化することもあるでしょう。

また、完全にハッケージされる場合と全くされないという二極化をイメージしてはいけません。物理現象は、連続的なので、そのような短絡的なイメージではなく、途中の状態も存在することも考えてみましょう。例えば、殻が、完全な閉鎖形になっていなくて、例えば、映画「スターウォーズ」の「デススター」のように、表面が欠けている場合です。その欠け方も範囲の小さいものから大きいものまであると考えるべきです。そうすると、一部の遺伝子DNAが殻の隙間から飛び出ているAAV粒子もあることは想像できます

以上、多様な粒子としてAAVベクターが産生されており、その中からFullのみを分離精製することが、医薬品を作り上げていく上で、downstream; 精製工程における工業化の課題となる訳です。一方、upstream; 生産工程における工業化の課題は、パッケージング効率と産生量が工業化の課題となります。

ウイルスの等電点(pI or IEP)

以下，文献によるとウイルスの表面電荷は，およそ酸性から中性域にあります(2.1~8.3)．平均値は，5.0±1.3です．ウイルス精製では，陰イオン交換体クロマトグラフィ(AEX)による吸着/溶出で可能です．等電点とは，環境pHに応じて電気的に中性となるpHを等電点(pI or IEP: isoelectric point)と言います．今回紹介する文献では，公開されているウイルスのIEPを再度検証しています．1938年以降に行われた104のウィルスのIEPのデータがまとめられています．

図1. タンパク質上のカルボキシル基とアミノ基の電荷の変化

環境のpHに応じて，カルボキシル基とアミノ基の電荷が変化する．

ウイルスの等電点の検証結果の詳細

表1. ウイルスのIEP

Host kingdom	Virus species	Strain	IEP(s)	Method	Purity	Reference
Animalia	Adeno‐associated virus – 4	Adeno‐associated virus – 4	2·6	IEF‐DA	High	Salo and Mayor (1978)
Animalia	Alastrim	Butler	3·4	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Cowpox	Brighton	4·3	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Cowpox	Brighton (egg)	4·3	EM‐LM	High	Douglas et al. (1966)
Animalia	Cowpox	Brighton (rabit)	4·3	EM‐LM	High	Douglas et al. (1966)
Animalia	Cowpox	Kampen	5·4	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Cowpox	Leuwarden	5·2	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Encephalomyocarditis virus	Mengovirus L	8·1 and 4·6	IEF‐PA	High	Chlumecka et al. (1973)
Animalia	Encephalomyocarditis virus	Mengovirus M	4·4 and 6·3	IEF‐PA	High	Chlumecka et al. (1973)
Animalia	Encephalomyocarditis virus	Mengovirus M	8·4 and 4·6	IEF‐PA	High	Chlumecka et al. (1977)
Animalia	Encephalomyocarditis virus	Mengovirus S	4·6 and 6·8	IEF‐PA	High	Chlumecka et al. (1973)
Animalia	Feline panleukopenia virus	Canine parvovirus	5·0	IEF‐A	?	Weichert et al. (1998)
Animalia	Hepatitis A virus	Hepatitis A virus	2·8	IEF‐DA	?	Nasser et al. (1992)
Animalia	Human adenovirus C	Human adenovirus 5	4·5	EM‐LS	?	Trilisky and Lenhoff (2007)
Animalia	Human enterovirus B	Human coxsackievirus B 5	4·75 and 6·75	IEF‐DA	Low	Butler et al. 1985
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1	5·6 and 5·1	IEF	?	Murray and Parks 1980
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1	4·0	IEF‐DA	Low	Butler et al. (1985)
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1 (4CH‐1)	5·5	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1 (R115)	6·2	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1 (V212)	6·4	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1 (V239)	5·3	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1 (V248)	5·0	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Human enterovirus C	Human coxsackievirus A 21	6·1 and 4·8	IEF	?	Murray and Parks (1980)
Animalia	Human rhinovirus A	Human rhinovirus 2	6·8	CIEF	Low	Schnabel et al. (1996)
Animalia	Human rhinovirus A	Human rhinovirus 2	6·4	IEF‐DA	Low	Korant et al. (1975)
Animalia	Influenza A virus	H1N1 (Leningrad)	4·5, 4·35, 4·25, 4·0*	EM‐LM	High	Molodkina et al. (1986)
Animalia	Influenza A virus	H3N1	6·5–6·8	IEF‐PA	Low	Brydak (1993)
Animalia	Influenza A virus	H3N2 (Leningrad)	5·0	EM‐LM	High	Molodkina et al. (1986)
Animalia	Influenza A virus	PR8	5·3	EM‐LM	Low	Miller et al. (1944)
Animalia	Influenza A virus	Influenza A virus	6·5–7·0	EDN‐FET	?	Patolsky et al. (2004)
Animalia	Mammalian orthoreovirus	Serotype 3 (Dearing)	3·8	EM‐LM	Low	Taylor and Bosmann (1981b)
Animalia	Mammalian orthoreovirus	Serotype 3 (Dearing)	3·9	IEF‐DA	Low	Floyd and Sharp (1978)
Animalia	Monkeypox	Chimpanzee Paris	6·2	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Monkeypox	Copenhague	6·5	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Monkeypox	Denmark	3·4	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Neuro‐Vaccinia	Levaditi	4·2	EM‐LM	High	Douglas et al. 1969
Animalia	Norwalk virus	Funabashi	5·9	CIEF	?	Goodridge et al. (2004)
Animalia	Norwalk virus	Hawaii virus	6·0	CIEF	?	Goodridge et al. (2004)
Animalia	Norwalk virus	Kashiwa	5·5	CIEF	?	Goodridge et al. (2004)
Animalia	Norwalk virus	Narita	5·5	CIEF	?	Goodridge et al. (2004)
Animalia	Norwalk virus	Norwalk virus	5·9	CIEF	?	Goodridge et al. (2004)
Animalia	Norwalk virus	Seto	6·0	CIEF	?	Goodridge et al. (2004)
Animalia	Papillomavirus	Papillomavirus	5·0	Aggregation	High	Beard and Wyckoff (1938)
Animalia	Poliovirus	PV‐1	7·4 and 4·0	IEF‐DA	?	Nasser et al. (1992)
Animalia	Poliovirus	PV‐1	6·9	IEF	?	Brioen et al. (1985)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 Brunender	7·4 and 3·8	IEF‐DA	?	La Colla et al. (1972)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 Brunhilde	7·1	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 Brunhilde	7·1 and 4·5	IEF‐DA	High	Mandel (1971)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 Chat	7·5 and 4·5	IEF‐PA	?	Ward (1978)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 LSc2ab	6·6	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 LSc2ab	6·6	?	?	Murray and Parks (1980)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 LSc2ab	6·75 and 4·1	IEF‐DA	Low	Butler et al. (1985)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 LSc2ab	6·75 and 4·5	IEF‐DA	Low	Butler et al. (1985)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 Mahoney	8·3	IEF‐DA	Low	Floyd and Sharp (1978)
Animalia	Poliovirus	PV‐2 Sabin T2	6·5 and 4·5	IEF	?	Murray and Parks (1980)
Animalia	Rotavirus A	Simian rotavirus A/SA11	8·0	IEF‐DA	Low	Butler et al. (1985)
Animalia	Smallpox	Butler	5·7	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Smallpox	Djibouti	5·6	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Smallpox	Harvey	5·9	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Smallpox	Harvey	3·4	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Smallpox	Moloya	5·6	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Smallpox	Sidi Amock	5·9	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Smallpox	Teheran	5·6	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Smallpox	Vannes	5·6	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Vaccinia	Chaumier	5·0	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Vaccinia	Connaught	4·9	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Vaccinia	Lister	5·1	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Vaccinia	Lister	3·9	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Vaccinia	Lister (egg)	3·7	EM‐LM	High	Douglas et al. (1966)
Animalia	Vaccinia	Lister (rabit)	3·0	EM‐LM	High	Douglas et al. (1966)
Animalia	Vaccinia	Rabbitpox (Utrecht)	2·3	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Vaccinia	WR	4·8	EM‐LM	Low	Taylor and Bosmann (1981b)
Animalia	White cowpox	Brighton	2·8	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Whitepocks	64.72.55	5·1	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Whitepocks	64.72.75	4·9	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Whitepocks	Chimp 9	4·8	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Whitepocks	MK7.73	5·3	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Whitepocks	RZ.10.71	5·1	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Whitepocks	RZ.38.75	5·2	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Bacteria	Acholeplasma phage O1	Acholeplasma phage O1	4·0	?	?	Pawlitschek et al. (1962)
Bacteria	Actinomycetes phage MSP8	Actinomycetes phage MSP8	3·5	IEF‐A	High	Kolstad and Bradley (1966)
Bacteria	Bacillus phage φ29	Bacillus phage φ29	4·2	Moving boundary	Low	Rubio et al. (1974)
Bacteria	Enterobacteria phage BZ13	Enterobacteria phage GA	2·1, 2·3*	EM‐LS	High	Langlet et al. (2008b)
Bacteria	Enterobacteria phage F1	Enterobacteria phage SP	2·1, 2·6*	EM‐LS	High	Langlet et al. (2008b)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage f2	4·0	IEF‐DA	Low	Butler et al. (1985)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage MS2	3·9	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage MS2	3·5	EM‐LS	High	Penrod et al. (1995)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage MS2	3·1, 3·9*	EM‐LS	High	Langlet et al. (2008b)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage MS2	3·9	Moving boundary	High	Overby et al. (1966)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage MS2	3·9	IEF‐DA	?	Nasser et al. (1992)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage MS2	2·2, 3·3, 3·5*	EM‐LS	Low	Yuan et al. (2008)
Bacteria	Enterobacteria phage PRD1	Enterobacteria phage PR722	3·8–4·2	Chromatofocusing	Low	Brorson et al. (2008)
Bacteria	Enterobacteria phage Qβ	Enterobacteria phage Qβ	2·7, 1·9*	EM‐LS	High	Langlet et al. (2008b)
Bacteria	Enterobacteria phage Qβ	Enterobacteria phage Qβ	5·3	Moving boundary	High	Overby et al. (1966)
Bacteria	Enterobacteria phage T4	Enterobacteria phage T2	4·2	Aggregation	?	Sharp et al. (1946)
Bacteria	Enterobacteria phage T4	Enterobacteria phage T4	2·0	EM‐LS	?	Aronino et al. (2009)
Bacteria	Enterobacteria phage T4	Enterobacteria phage T4	4·0–5·0	IEF‐PA	Low	Childs and Birnboim (1975)
Bacteria	Enterobacteria phage λ	CI47	3·8	EM‐LS	High	Penrod et al. (1995)
Bacteria	Enterobacteria phage μ2	Enterobacteria phage μ2	4·0	IEF‐PA	Low	Piffaretti and Pitton (1976)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Enterobacteria phage S13	7·0	?	High	Aach (1963)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Mutants	7·4	?	High	Aach (1963)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Wild type	6·6	?	High	Aach (1963)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Enterobacteria phage ϕX174	6·0–7·0	Chromatofocusing	Low	Brorson et al. (2008)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Enterobacteria phage ϕX174	2·6	EM‐LS	?	Aronino et al. (2009)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Enterobacteria phage ϕX174	6·6	CIEF	Low	Horkáet al. (2007)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Enterobacteria phage ϕX174	6·6	Aggregation	High	Sinsheimer (1959)
Bacteria	PM 2	PM 2	7·3	IEF	?	Schaefer et al. (1974)
Bacteria	Pseudomonas phage PP7	Pseudomonas phage PP7	4·3–4·9	Chromatofocusing	Low	Brorson et al. (2008)
Plantae	Belladonna mottle virus	Belladonna mottle virus	6·3	IEF‐A	Low	Petrzik (1993)
Plantae	Cowpea chlorotic mottle virus	Cowpea chlorotic mottle virus	3·8	EM‐LS	High	Suci et al. (2005)
Plantae	Erysimum latent virus	Erysimum latent virus	4·7	IEF‐A	Low	Petrzik (1993)
Plantae	Red clover necrotic mosaic virus	Serotype A	5·0	IEF‐A	Low	Gallo and Musil (1984)
Plantae	Red clover necrotic mosaic virus	Serotype B	4·8	IEF‐A	Low	Gallo and Musil (1984)
Plantae	Red clover necrotic mosaic virus	Serotype C	4·6	IEF‐A	Low	Gallo and Musil (1984)
Plantae	Scrophularia mottle virus	Anagyris	4·4	IEF‐A	Low	Honetslegrova et al. (1994)
Plantae	Scrophularia mottle virus	Czech isolate	3·9	IEF‐A	Low	Honetslegrova et al. (1994)
Plantae	Scrophularia mottle virus	Scrophularia mottle virus	4·0	IEF‐A	Low	Petrzik (1993)
Plantae	Southern bean mosaic virus	Variant 1	6·0	IEF‐DA	High	Magdoff‐Fairchild (1967)
Plantae	Southern bean mosaic virus	Variant 2	5·6	IEF‐DA	High	Magdoff‐Fairchild (1967)
Plantae	Southern bean mosaic virus	Variant 3	5·0	IEF‐DA	High	Magdoff‐Fairchild (1967)
Plantae	Southern bean mosaic virus	Variant 4	4·0	IEF‐DA	High	Magdoff‐Fairchild (1967)
Plantae	Tobacco mosaic virus	Cucumber virus 4	4·9	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Tobacco mosaic virus	Green aucuba	4·5	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Tobacco mosaic virus	Holmes’ masked	3·9	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Tobacco mosaic virus	Holmes’ rip‐gras	4·5	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Tobacco mosaic virus	J14D1	4·2	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Tobacco mosaic virus	Ordinary	3·9	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Tobacco mosaic virus	Yellow aucuba	4·6	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Turnip yellow mosaic virus	Turnip yellow mosaic virus	3·6	IEF‐A	Low	Petrzik (1993)

Isoelectric points of viruses – B. MichenT. GrauleFirst published: 09 July 2010 https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2010.04663.xCitations: 63 –
https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1365-2672.2010.04663.x

AAV1~AAV10のpI計算

以下の文献には，表面構成タンパク質について個別にpIを算出されていますが，ウイルス粒子を構成する天然の状態でのpIは，表面に出ているアミノ酸の分布割合に依存します。そのため、正確なpIが算出されているとは考えにくと考えられます．やはり，実際にAEXなどのクロマト法などで検定されている結果の方が信頼できると思われます．

しかし，組換えAAVでは，以下の「AAV8, AAV9のpI」で示したようにEmpty/Fullの違いでpIが異なることが知られています．すなわち，GOIの配列によってもpIは異なると考えられます．単純計算ではいかないようですね．

Calculated pI values for AAV1 to AAV12.
https://www.researchgate.net/figure/Calculated-pI-values-for-AAV1-to-AAV12-The-histogram-of-the-pI-values-for-the-AAV_fig1_235682725

AAV8, AAV9のpI

AAV8とAAV9のpIを分析カラムメーカーSCIEX社が報告しています．

AAV8 : 約pI9
AAV9 : pI7.1~7.6

Determination of Full, Partial and Empty Capsid Ratios

for Adeno-Associated Virus (AAV) Analysis

Tingting Li, Tie Gao, Hongxu Chen, Zuzana Demianova, Fang Wang, Mukesh Malik, Jane Luo,

Handy Yowanto, Sahana Mollah

SCIEX, Brea, CA
https://sciex.com/Documents/tech%20notes/2019/AAV-Full-Partial-Empty.pdf

AAV tree

参考まで，AAV系統樹について示しておきます．pIの関連があるかも知れません．今後調査するかもです．

Expanded Repertoire of AAV Vector Serotypes Mediate Unique Patterns of Transduction in Mouse Brain
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616320755

編集履歴

2020/11/04 Mr.Harikiri
2021/02/08 文言整備
2021/02/23 追記 (「はじめに」を追加し、工業化の課題について言及)

2020年11月4日

[Bio-Edu] DNAとRNAの違い – レジメ – [2020/10/11]
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ID24191

DNAとRNAの違い

DNAはRNAの設計図になります。RNAは、タンパク質の設計図になります。
- DNAを設計図にして、RNAポリメラーゼという酵素により、RNAが作られる
3つの部品単位

「糖」と「核酸塩基」の単位を含めて「ヌクレオシド」といい、更に「リン酸」を含めて「ヌクレオチド」という。リン酸を介して直鎖を形成する。核酸塩基には、水素結合親和性がある相補的結合が可能な5種類の塩基がある。AとTまたはU、GとCがそれぞれ結合できる。これにより2本鎖になることができる。以下に詳細を示す。
- リン酸 : リン酸を介して糖が数珠繋ぎされてDNA, RNAの直鎖構造が形成される(ホスホジエステル結合)
- 糖 (2種類)
  - リボース : RNA用
  - デオキシリボース : DNA用
- 核酸塩基 (5種類)
  - アデニン(A)
  - チミン(T) : DNA専用
  - グアニン(G)
  - シトシン(C)
  - ラウシル(U) : RNA専用(Tの代わり)
ヌクレオチドとは　— 受験のミカタ —
https://juken-mikata.net/how-to/biology/nucleotide.html
```
編集履歴
2020/10/11 Mr.HARIKIRI
```
[用語] UNA; unlocked nucleic acid [health] [2023/10/14]

2023年10月14日 [用語] UNA; unlocked nucleic acid [health] [2023/10/14] へのコメントはまだありません

[用語] RNA, tRNA, rRNA, etc. [Biotech] [2022/09/03]

2022年9月3日 [用語] RNA, tRNA, rRNA, etc. [Biotech] [2022/09/03] はコメントを受け付けていません

[Bio-Edu] DNAとRNAの違い – レジメ – [2020/10/11]

2020年10月11日 [Bio-Edu] DNAとRNAの違い – レジメ – [2020/10/11] はコメントを受け付けていません

[用語] DNA; Deoxyribonucleic acid – Histoneを介した染色体の折り畳みまでを順を追って解説 [2020/09/23]

2020年8月22日 [用語] DNA; Deoxyribonucleic acid – Histoneを介した染色体の折り畳みまでを順を追って解説 [2020/09/23] はコメントを受け付けていません
2020年10月11日
[Bio-Education] 医薬品の開発スケジュール [2021/04/08]
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医薬品の開発スケジュールの概要

バイオロジクスの開発スケジュールは、以下のようにモダリティの開発を進めつつ、臨床試験を実施し、その結果をもとにさらに臨床試験を実施し、最終的に製造許可を受けます。

その後、製品についてのモニタリングも臨床試験としての位置づけとしてデータを取得していきます。
1. Drug Discovery
2. Pre-Clinical
3. IND申請(EUではIMPD)と臨床試験開始(Phase I)- 安全性
4. その結果を受けて、Phase II試験 – 有効性
5. その結果を受けて、Phase II試験 – 被験者を増やす
6. そのデータをもとに、NDA申請 (BLAともいう)
7. 当局から許可が降りれば、製造販売が可能
8. その後、コマーシャル品でのデータ取得を続ける
9. (これを市販後調査という)
10. 問題が生じれば、速やかな対応が義務づけられている
11. (医薬品メーカーは、定期的な模擬テストにより、情報伝達と対処法の稼働状況を確認し、実際の問題対応に備えている)
以下は、2015の記事で少し古いが、考え方は変わっていないので、参考になる記事です。
Special Report on Product Stability Testing: Developing Methods for New Biologics and Emerging Markets, 2015
https://bioprocessintl.com/manufacturing/formulation/special-report-on-product-stability-testing-developing-methods-for-new-biologics-and-emerging-markets/

バイオロジクスの開発における細胞株から製造方法

Manufacturing Process of Biologics (2011, ICH)
各ステップに関連するICH
https://www.ema.europa.eu/en/documents/presentation/presentation-manufacturing-process-biologics-kowid-ho-afssaps_en.pdf

Cell Bankの作成

FraunhoferのGMP manufacture of master and working cell banksと題する説明には、以下のように解説されている。
- セルバンクの製造は、医薬品のライフサイクルと生産チェーンにおける最初のGMP要素である.
- これは、生物学的APIを一貫して作成するための前提条件である.
- 繰り返しの継代培養または複数世代の生物は、特性と完全性に予期しない変化をもたらす可能性がある
- そのため、すべての生物学的原薬の生産は、少数の世代倍増で準備されたマスターセルバンク（MCB）とワーキングセルバンク（WCB）に基づいている.
- MCBとWCBで構成される2層セルバンクシステムは、バイオ医薬品のライフサイクル以降にわたって一貫した原材料/細胞基質の供給を保証する.
- 更に、セルバンクのストレージは、安全で制御され、監視されたセルバンクシステムで、超高温、つまり液体窒素より上の気相で行われる必要がある.
Fraunhofer ITEMのサービスから

Fraunhoferのサービスから、MCB/WCBは、ICHQ5Dに準拠したGMP製造で行うとしていることから、これは要件であると捉えられる. 前述の文献( 2011 ICH)にもMCB/WCBに関連するのは、ICHQ5Dとの記載がある。
- 原核生物および真核生物（細菌、酵母、真菌、哺乳類細胞株など）のマスターおよびワーキングセルバンク（MCBおよびWCB）のICHQ5D準拠のGMP製造
- MCBまたはWCBバイアルの数量：最大300
- MCBまたはWCBの容量：クライオバイアルあたり1 ml〜5 ml
- セルバンキング用の特別装備の生産設備、すなわちクラスDおよびクラスCのクリーンルーム
- 25年にわたる社内の技術および規制に関する専門知識
- 液体窒素の気相での超低温（<-150°C）でのMCBおよびWCBのGMP準拠の保管
- テストと特性評価のために、FraunhoferITEMはすでにいくつかのテストラボと契約関係を確立しています。
Fraunhofer ITEM
GMP manufacture of master and working cell banks
https://www.item.fraunhofer.de/en/services-expertise/drug-development/development-of-biotherapeutics/GMP_manufacture.html

ICHQ5D
- バンク化された株が対象
- 動物細胞、微生物
- 微生物の代謝産物、例えば、抗生物質、アミノ酸、炭水化物、及びその他の低分子物質はこれに含まれない
- 起源、由来、履歴
  - 微生物細胞の場合、細胞株として樹立した後の継代数を記載すればよい
  - 血清、酵素、加水分解物、又はその他の生細胞等
  - ヒト又は動物由来の材料に細胞が曝露されることがあったのか
  - それら生体成分の起源、調製及び管理方法、各種試験結果、並びに品質保証に関する情報
  - 適切な親株
    特別な操作の例としては、細胞融合、形質導入、細胞の選択、コロニー分離、クローニング、遺伝子増幅、特定の培養環境や培地への適応化など
    細胞基材の開発過程でどのような方法が用いられたかに関する情報
  - 「細胞基材」とは、目的の遺伝子配列が導入された形質転換細胞であり、更に、単一の前駆細胞からクローニングされたものである
  - セル・バンクの品質、及び各セル・バンクについて実施した試験の内容を保証する責任負っている
  - セル・バンク・システム
    MCBからワーキング・セル・バンク(WCB)を調製するという2段階方式のセル・バンクの考え方
  - セル・バンクの適格性に関する評価基準
  - ローニングはされていないが、既に十分均一であり、製造目的にかなう細胞集団の場合も、クローン細胞からセル・バンクを調製する必要はない
  - 重要な点は、特性解析されたセル・バンクによって、一定品質の医薬品が得られるということである
  - 微生物発現系においては、セル・バンクの更新にあたって、形質転換を改めて行って、新たなセル・バンクを調製する場合がある。この方法は、新規の形質転換ごとに、あらかじめ綿密に試験してある宿主セル・バンク及びプラスミド・バンクを使用すること、並びに形質転換して得られたセル・バンクごとに改めて試験を実施することが前提となる
    このような代替法が妥当と認められる理由は、細菌や酵母での形質転換が、後生動物細胞の形質転換とは異なり、一般的に高い再現性を有し、しかも容易な操作で行い得るからである
  - セル・バンクで起こる可能性がある汚染すべてを検出できるような試験方法はない。したがって、細胞をバンク化する過程で以下の予防策を講じることで、汚染がないことを
    採用したバンク・システムの種類、セル・バンクのサイズ、用いる容器(バイアル、アンプル、その他の適当な容器など)及びその密封方法、凍結保護剤や培地を含むセル・バンクの調製方法、並びに凍結に際しての条件や保存条件について明らかにする必要
  - 微生物汚染や同一室内で使用される他の細胞との交叉汚染を回避
    方法、並びに各セル・バンクを構成する容器について事後の追跡調査をするための方法を記載
  - バンクを構成する各保存容器の内容が均一であることを保証するためには、各容器に分注する前に、すべての培養容器の培養液からの細胞を合わせて、1つの細胞プール
  - 細胞プールから細胞を滅菌済の容器に分注し、密栓後、適当な条件下で保存
  - 製造に使用
    火災、停電、人的過失がある。製造業者は、こうした状況に対する予防措置について明らかに
    複数の冷凍庫でのセル・バンクの重複保存
    予備電源や液体窒素をセル・バンク保存ユニットへ自動供給するシステムの使用
    MCBやWCBの遠隔施設での分割保存
    MCBの更新
  - 特性解析/品質評価
    細胞基材への他の細胞株の混入、外来性の有害因子及び内在性因子やその他の混入物質(例えば、宿主由来の毒素や抗生物質)の有無について評価す
  - ウイルス安全性評価
    ICHQ5A
  - 遺伝子発現構成体の分析
    ICHQ5B
    目的タンパク質をコードする遺伝子配列が既に明らかにされている場合には、同様の方法により塩基配列を解析すれば、有用な情報となる
    しかし、関連する遺伝子群から発現するタンパク質ファミリー、微生物ワクチン抗原、ハイブリドーマから得たモノクローナル抗体のような複雑な構造を持つタンパク質の遺伝子配列の解析は、必ずしも必要とは考えられない。
  - 特性解析
    表現型、遺伝子型
    フル試験は、MCB
    一部の試験は、WCB
    動物細胞
    形態解析
    アイソザイム
    微生物
    選択培地
    ファージ型分析
  - 純度試験
    以降、執筆中
ICHQ5D (2000)— pmda —
生物薬品(バイオテクノロジー応用医薬品/生物起源由来医薬品)製造用細胞基材の由来、調製及び特性解析
https://www.pmda.go.jp/files/000156150.pdf

編集履歴
```
2020/09/24 Mr.Harikir
2021/04/08 追記: バイオロジクスの開発における細胞株から製造方法
```
2020年9月24日
[Bio-Education] 細胞のモノクローナル化のための基本原理 – 最新装置を中心に解説 – [2020/09/03]
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ID22024

細胞のモノクローナル化のための3つの基本操作

細胞をモノクローンにするには、1つの細胞を取得したことを確実に証明する必要があります。その基本操作は、以下の3種類あります。3種類とも浮遊細胞への適用は可能ですが、FACSとCell Printerは、付着細胞には不向きですsource: Solentim.com。そのため、付着性の強い細胞には、限界希釈法が未だ使われています。Solentim社のVIPSという装置は、これらを改善してマイルドな分注により高い生存率を達成し、1細胞の分注を高い確率で行い、それを高い確率で生存させてクローナリティにつなげる装置になっています。

従来の装置と方法
- FACS
  - FACS; fluorescence-activated cell sorter
  - 蛍光標識の検出と電場ソート (参考文献1)
    レーザー光照射による蛍光励起により蛍光を測定、同時に細胞サイズを前方散乱光の強度を測定する
    マイクロ流路から出てきた細胞をピエゾ振動子によりエンベロープ(液滴)化し、同時に荷電して、偏向版によりソートする
    処理能力は、30,000~70,000細胞/秒 (2011年技術)
  - ラミナフロー原理
    マイクロ流路に細胞懸濁液を流すと細胞が1列に並んで流れる
  - 目的細胞の存在比率による制限
    0.1%を下回るとヒストグラムにおける位置予測ができない
  - 高流速こうと高電荷(数千V)による制限
    脆弱な細胞には適さない(2011年技術)
  - 原理の発明者 : レナード・アーサー・ハーツェンバーグ
  - 参考文献
    全自動1細胞単離解析装置の開発, 2011, 生物工学会誌, 89, 2, 72-78 link
    フローサイトメトリーの原理、基礎や一般的なプロトコルを解説フローサイトメトリー入門講座, コスモ・バイオ, link
  - メーカー
    Cellavista, FACSの説明
- Cell Printer
  - インクジェット方式 source: InkJet-Bio.com
- 限界希釈法
  - ある一定容量の細胞懸濁液を分取したときに、1細胞となるように希釈する方法
VIPSおよびCell Metric

VIPSとCell MetricはSolentim社の製品です。VIPSは、単一細胞播種に特化した製品、Cell Metricは、播種0日からのモニタリングについて、ウェルのエッジ付近の細胞も見逃さずクローン保証を確実にする製品です。
- VIPSは、Solentim社の装置 source: Solentim.com
  - VIPS; Verified In-situ Plate Seeding)
  - 単一細胞をプレートに播種した直後に、細胞を画像により確認するベンチトップサイズの装置、装置説明 link
    細胞を含む培養懸濁液が入ったリザーバーから、プレートウェルの中心部に1滴分注する
    そのご自動的に単一細胞の有無を画像撮影により検出する
    もしも、1細胞以上の細胞が確認されると自動的に培地を補充する
    もしも、細胞が確認されない場合は、再度の1滴分注を行い、以上を繰り返えす。
    96穴1プレートの処理に10分
  - SMART LD™️
    1psi未満の圧力でナノリットル単位でウェルに分注
    穏やかなディスペンスにより高い生存率が得られることで、1つの細胞からのコロニー化が高い確率になる
  - インテリジェンスな画像分析
  - 日々の個々のウェルを撮影してライブラリを作ることで、そのコロニーが0日まで遡った時にタインツの細胞から始まったことを確認できる
- Cell Metric
  - 装置概要 link
  - 大手製薬企業、CRO/CDMOでの使用実績がある
  - 蛍光ラベルの必要がなく、ヴェルエッジの細胞も見逃さない
  - 蛍光ラベルにも対応している
  - クローンのスクリーニングに使用する
    クローナリティのアシュアランスデータを得るために、コロニーの生育をモニタリングする
    高速スキャニングが可能
    播種0日から定期的な撮影を実施
    撮影期間は、10-21日館程度
  - 複数プレート撮影(10枚格納カセット装着可能)
  - プレートのバーコード管理
  - 処理時間 : 4.5分/プレート(6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 well plate対応)
  - 蛍光検出機能(オプション)
  - 規制当局対応のレポート作成機能
プロデューサー細胞株は、遺伝子治療ベクターの製造コンポーネントの1つです。選択した細胞株の特性（起源/派生、倍加時間、ウイルス感染と複製の許容度）はウイルス生産性の効率を決定し、増殖条件は必要な下流の処理方法と最終製剤のリリーステストに影響します。この様式の細胞は、臨床目的によっては、患者に直接投与される可能性もあります。source
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編集履歴
2020/09/03 Mr.はりきり
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[用語] PCL – Packaging Cell Line/Producer Cell Line [2020/08/23] ID22010
2020年9月3日
[Bio-Edu] 核酸の抽出 – QIAGEN製品 – ID21335 [2020/08/17]
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核酸抽出に使用されるキット

検体によって使い分けます。

Source: DNAチップ研究所

■ QIAamp DNA Mini Kit (通常組織用)
https://www.qiagen.com/jp/shop/sample-technologies/dna/genomic-dna/qiaamp-dna-mini-kit/

■ GeneRead DNA FFPE Kit (FFPE検体用)
https://www.qiagen.com/jp/shop/sample-technologies/dna/plasmid-dna/generead-dna-ffpe-kit/
※ 酵素Uracil-N-Glycosilase（UNG）により、DNA から脱アミノ化されたシトシン残基を特異的に除去します。

■ QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (ヒト血漿・血清用)
https://www.qiagen.com/jp/shop/sample-technologies/dna/genomic-dna/qiaamp-circulating-nucleic-acid-kit/
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編集履歴
2020/08/17 はりきり(Mr)
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2020年8月17日

タグ: education

大腸菌の増殖率

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Poloxamer 188

1)

2)

毒性

動物の静脈内注射 (Poloxamer)

ヒトの静脈内注射 (Poloxamer 188)

創傷治癒

動物実験

AMES試験

発癌性

臨床試験

化粧品

3)

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イオン交換の原理を使ったクロマトグラフィ

実務では

原理

なぜpHを上げていくと電荷がマイナスチャージになるのか

pHの理解

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はじめに

イオン交換体

イオン交換クロマトグラフィ

バッチ法

条件の基本は、電気伝導度とpH

検討の概要

実験方法

レジンの準備

出発材料の準備

吸着反応とアッセイ

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plasmid DNAとは

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はじめに

ウイルスの等電点(pI or IEP)

図1. タンパク質上のカルボキシル基とアミノ基の電荷の変化

ウイルスの等電点の検証結果の詳細

表1. ウイルスのIEP

AAV1~AAV10のpI計算

AAV8, AAV9のpI

AAV tree

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DNAとRNAの違い

3つの部品単位

医薬品の開発スケジュールの概要

バイオロジクスの開発における細胞株から製造方法

Cell Bankの作成

Fraunhofer ITEMのサービスから

ICHQ5D

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細胞のモノクローナル化のための3つの基本操作

従来の装置と方法

VIPSおよびCell Metric

核酸抽出に使用されるキット