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  • [用語] Host Cell

    [用語] Host Cell

    Host Cell

    目的のタンパク質を発現させるために使用する出発材料となる最適化された細胞のこと

    編集履歴
    2020/08/24 Mr.はりきり
  • [用語] PCL – Packaging Cell Line/Producer Cell Line  [2020/08/23]

    [用語] PCL – Packaging Cell Line/Producer Cell Line [2020/08/23]

    Producer Cell LineとPackaging Cell Lineの違い

    • Packaging Cell Lineは、キャプシドまたは空のウイルス量子を生産します。遺伝子治療用のウイルス・ベクターを生産するには、GOI Plasmidをトランスフェクションします
    • Producer Cell Lineは、GOIの安定生産細胞株であり、長期にウイルス・ベクターを生産します source

    プロデューサー細胞株は、遺伝子治療ベクターの製造コンポーネントの1つです。選択した細胞株の特性(起源/派生、倍加時間、ウイルス感染と複製の許容度)はウイルス生産性の効率を決定し、増殖条件は必要な下流の処理方法と最終製剤のリリーステストに影響します。この様式の細胞は、臨床目的によっては、患者に直接投与される可能性もあります。source

    FDAガイドライン

    遺伝子治療ベクターの遺伝子解析

    2018年のFDAドラフトガイドラインの概要です source

    • 「40kb以下のすべてのベクターを完全にシーケンスすることを推奨する」
    • 「ウイルスベクターを統合するには、統合されたベクターでDNAシーケンスを実行することを推奨する。シーケンシング用の材料は、プロデューサー細胞株から収集できる。」
    • 「安定したベクタープロデューサー細胞株(PLC)については、生産終了(EOP)細胞における遺伝子インサートの遺伝的安定性をテストすることを推奨する

    対応できる企業

    PCL関連文献リンク

    編集履歴
    2020/09/03 Mr.HARIKIRI
    2020/09/17 追加(対応できる企業の追加;Oxgene™️)
  • [Bio-Edu] バイオ医薬品 (バイオロジクス)は、CHO細胞の技術革新と共に進展してきた [2020/08/05]

    [Bio-Edu] バイオ医薬品 (バイオロジクス)は、CHO細胞の技術革新と共に進展してきた [2020/08/05]

    バイオ医薬品とは

    バイオ医薬品は、英語でバイオロジクスと言います。バイオロジクスには、ヒトの体内に存在するタンパク性物質をターゲット(狭義)にしているため、よく知られている「抗体」以外のタンパク質も含まれます。

    バイオロジクスは、当初、血漿分画製剤で知られているように血液から得られていましたが、技術革新により現在では、その目的物である医薬品は遺伝子組換えCHO細胞により得られるようになって久しく、正にバイオロジクスは、CHO細胞に関する技術革新とともに進展してきたと言えます。

    以下、バイオロジクスについて、CHO細胞を使うアドバンテージをまとめました。ただし、CHO細胞が完全勝利ではありません。目的によっては、インスリン製剤など低分子量のタンパク質では、大腸菌が使用されています。

    • 現在、バイオロジクスの代表は、「抗体」である
    • その原材料は、
      • 「血液、19世紀末・戦後 ~」、ジフテリアや破傷風などの感染症治療法として弱毒化毒素のウマへの投与によるマウ血清が感染症治療に高い効果があることがベーリング(behring)と北里柴三郎らにより明らかにされた
      • 「B細胞のハイブリドーマ細胞化 (抗体に限る)、1975年~」、B細胞は、細胞ごとに単一の抗体を産生するが不死化させるためにミエローマ細胞を用いたハイブリドーマ技術が発展した。得られた抗体をmonolconal antibodyという。
      • 「遺伝子組換え細胞」へと展開してきた
      • source: Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies
      • source : 抗体医薬とは, 熊谷泉 – 化学と教育 68巻 7号 (2020)
    • 原材料として
      • 「血液」
        • 動物由来の場合では異種高原であることによる免疫原性の問題
        • オリジナル機能のタンパク質を取得できる(血漿分画製剤)
        • 量的制限
        • ウイルス安全性に問題
      • 「ハイブリドーマ」細胞
        • 動物への抗原免疫(抗体作成)、脾臓(B細胞)とホスト細胞(ミエローマ)とのハイブリドーマ作製、など煩雑であり抗体に限定
      • 「遺伝子組換え技術」
        • キメラ化 : 動物由来の可変領域とヒト抗体の定常領域を結合
        • ヒト化抗体 : 動物由来のCDR (Complementarity Determining Region, VHとVLにそれぞれ3箇所ずつ存在)のみをヒト抗体に移植することで、約95%がヒト由来構造を維持
        • 製造技術の進展による大量製造
        • 実績としてのウイルス安全性(CHO細胞)
        • 宿主細胞に関わる糖鎖(CHO細胞は実績として克服)
        • 現在では様々な課題を克服できている
    • 遺伝子組換え技術での生産細胞
      • 分子量が大きな抗体の産生細胞として、殆ど全てがCHO細胞が選択される
      • 分子量が小さいインスリンやインターフェロンなどの産生細胞には微生物(大腸菌、酵母など)が使われる。
      • CHO細胞
        • バイオロジクス市販品で30年の実績
        • ヒト型に近い糖鎖を付加でき、その他不純物に関する安全性の蓄積
        • 立体構造を再現できる
        • 高い培養生産性技術が蓄積(最大10g/L)
      • 大腸菌
        • 医薬品上の問題点
          • 糖鎖を付加できないため糖タンパク質には不向き
          • 高い産生量にするとInclusion body(不溶性)になる
          • 立体構造をオリジナルに再現できない
        • 対策
          • 糖鎖問題は、目的タンパク質を限定
          • 立体構造は、Refolding技術による正常化
      • 酵母
        • 1990年代に盛んな研究
        • 医薬品上の問題点
          • 糖鎖を付加できるが、ヒト型ではないため、抗原性の問題がある。
          • 強力な蛋白分解酵素により目的タンパク質の分解問題
        • 対策
          • 糖鎖問題
            • 目的タンパク質を限定する
            • 糖鎖付加が無いタンパク質
            • 糖鎖遺伝子のノックアウト
            • 医薬品でない酵素など
          • 分解問題
            • 培養技術及ひ精製技術で対応
            • プロテアーゼ遺伝子のノックアウト

    CHO細胞・エニジニアリング

    現在のバイオロジクス、特に抗体に関する遺伝子組み換え技術を使ったCHO細胞による生産性改善と取り組みは、以下の参考文献が概説として参考になります。

    • 目的タンパク質の遺伝子組込み、得られる細胞の多様性(糖鎖修飾)
    • 細胞株構築期間の長さ
    • 得られた細胞株の培養最適化
    • 比生産速度 pAB と 生細胞濃度 Xvの積分 = 生産濃度 P (IVC) (完全に理解できていません。今後要検証)

    バイオ医薬品生産におけるプロダクションサイエンス (2013)
    https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9109/9109_tokushu_3.pdf

    生産細胞の培養技術

    産生株が高い生産能力があったとしても、その培養条件がマッチしていなければ高い生産性は達成できません。抗体医薬品の場合、投与される量が多いため培養生産性は課題の一つになります。

    安定産生株の樹立と、その培養条件の開発の概説として、以下の文献が参考になります。

    • 安定発現株
    • 培養スケールアップ
    • 培養プラットフォーム
    • 電荷的多様性の制御
    • 培養終了の判断

    抗体医薬品生産培養技術の課題と展望 (2013)
    https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9109/9109_tokushu_4.pdf

    抗体医薬品・Fc融合タンパク質

    抗体医薬品について学ぶには、以下の項目を押さえておくことが重要です。「国立医薬品食品衛生研究所」のサイトに、「抗体」医薬品と「Fc融合タンパク質」について、まとめられたサイトがあります。

    抗体医薬品について全体像を把握することができます。

    抗体医薬品・Fc融合タンパク質
    国立医薬品所品衛生研究所・生物薬品部
    http://www.nihs.go.jp/dbcb/mabs.html

    抗体の分子的特徴として「Fc」と呼ばれる領域があります.Fcには抗原に対する結合機能は無く別の機能を持っていますが,抗原結合能を持っていないことから,この領域に,例えばPEGなどを結合させて,抗体自体の血中半減期を延ばしたり,がん抑制化学物質を結合させて,がん治療薬として機能を増強させたりと,このFc領域は利用されます.

    https://bio.nikkeibp.co.jp/atcl/mag/btomail/17/12/19/00339/

    バイオシミラーの基礎知識

    バイオシミラーの基礎知識について、厚生労働省取材のセミナー資料があります。最近の情報であるためバイオロジクスに関しても最新情報を得ることができます。

    バイオ医薬品とバイオシミラーの基礎知識 – 厚生労働省主催講習会「バイオ医薬品とバイオシミラーを正しく理解していただくために」- 2020年1月11日 (大阪科学技術センター 大ホール
    https://www.mhlw.go.jp/content/10800000/000496079.pdf

    抗体医薬の品質について

    日本における規制当局からのガイダンスがあります。

    抗体医薬品の品質評価のためのガイダンス (2012)
    https://www.pmda.go.jp/files/000206143.pdf

    CHO細胞以外の哺乳類細胞

    バイオロジクスで使用される動物細胞は、CHO細胞が殆ど全てと述べましたが、用途によってはラッド由来の細胞の使用が試みられています。2020/6現在、日本で上市されているYB2/0由来抗体は、0、SP2/0は4つ、NS0は5つ、CHOは57つです。以下の課題は依然として残ります。

    臨床段階で、YB2/0細胞由来の抗体医薬があります。YB2/0細胞は、フコース付加低減化が可能でADCC活性を高めることが可能な細胞株です。しかし、CHO細胞を代表する動物細胞の実績は、YB2/0細胞にはありません。YB2/0細胞は、2020/6現在、臨床試験が1社によって走っているのみです。新規参入企業には、ハードルは高いでしょう。

    • YB2/0細胞での生産性(?)
    • 不純物等に関わる安全性の実績(?)
    • レギュレトリーでのハードル(?)
    • 市販に対応できる自社及委託先の製造設備と技術

    高い細胞傷害活性を有する抗体医薬品の YB2/0 細胞を用いた効率的な物質生産研究 2011

    https://gair.media.gunma-u.ac.jp/dspace/bitstream/10087/6623/1/Ph.D%20E-428.pdf

    セルラインの種類

    研究用としては、以下のように種々の細胞株が使われます。Creative Labより

    •  CHO cell lines: GS system, DHFR system;
    •  BHK cell line;
    • Mouse myeloma cell lines: NS0SP2/0, etc.
    • Rat myeloma cell lines: YB2/0, etc.
    •  Human cell lines: HEK293 and its derivatives, HT-1080Huh-7PER.C6 , etc.

    以上

    編集履歴

    2020/05/23 はりきり(Mr) 2020/06/09 文言整備 2020/06/20 追記 (細胞株、日本で市販される抗体医薬の細胞株の数) 2020/08/05 追記 (ヒト化抗体)
    2022/10/23 文言整備: Fc領域の活用による機能付加について

  • [Bio] 細胞の同一性試験 – DNA Finger Printing Test (Random amplified polymorphic DNA; RAPD) – ID12852 [2020/03/31]

    [Bio] 細胞の同一性試験 – DNA Finger Printing Test (Random amplified polymorphic DNA; RAPD) – ID12852 [2020/03/31]

    細胞の同一性

    アイソエンザイム解析

    細胞株の同一性試験としては、規制当局の要件としてアイソエンザイム解析がある。

    RAPD

    同様に同一性試験としてDNAを対象にしたRandom amplified polymorphic DNA (RAPD)試験がある。

    具体例として、参考文献1が参考になる。

    STR

    その他にも、Short Tandem Repeat (STR)分析がある。

    参考

    文献1

    RAPD-PCR法によるトラフグ、ハコフグ、うまづらはぎおよびアンコウの肝臓の判定

    http://www.city.fukuoka.lg.jp/data/open/cnt/3/25273/1/35-p086.pdf

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  • [Bio-Edu] 細胞・細菌・ファージ・ウイルスを増やす 簡単な解説 – ID20721 [2020/10/06]

    [Bio-Edu] 細胞・細菌・ファージ・ウイルスを増やす 簡単な解説 – ID20721 [2020/10/06]

    はじめに

    初学者を対象にして、バイオを研究するために必要な知識を提供する[Bio-Edu]です。この記事では、バイオ、すなわち組換え体として使用する細胞や細菌、さらに関連知識として必要な更に小さな生物であるファージとウイルスについて解説します。

    生物

    生物界での病気やバイオにおける基礎知識として、「宿主 (しゅくしゅ)」という概念があります。

    ウイルスは生物ではないと考えられていましたが、最近では、生物であるともいわれます。

    この定義は、自分で自分を複製できないものは、生物ではないとする定義です。

    閑話休題 – 遺伝子の数 –
    ヒトの遺伝子は3万、大腸菌は4千、ウイルスは10個程度であり、これら、動物細胞、細菌、ウイルスのそれぞれの粒子としての大きさは、遺伝子の数に依存しています。

    ウイルスと細菌

    http://www2.nupals.ac.jp/~fmfsc/Topics/uirusuto_xi_jun.html

    生物と呼びにくい面々

    細胞、細菌は、適切な条件のもとで栄養分さえ与えてやれば、自分自身で複製できます。

    自分自身で複製できないものには、ウイルスの他にファージと呼ばれるものがあります。

    ウイルス

    ウイルスは、細胞に感染して細胞の生存機能を利用することで複製します。一方、ファージの感染対象が、細菌であることがウイルスと異なります。ウイルスは、通常丸い形をしていますが、ファージは、下図のように数十年前に初めてアメリカが月面着陸に成功した時に使用された「月面着陸宇宙船」の形にそっくりです。ファージについては、後述します。

    ウイルスとファージの形の違いには意味があります。ウィルスとは、比較的柔らかい表面の動物の細胞に感染するためには、この形(機能)で十分です。ウイルスは、細胞の表面に「ソフト」に吸着します。細胞とウイルスの表面は、よく似た膜(脂質膜)で覆われた構造であるため、「シャボン玉」同士が接触して吸着し融合していくような感じです。生命の活動とは不思議なもので、目的である細胞に融合したウイルスは、その後、細胞中へ完全に入っていきます(感染)。

    図1. 細胞とウイルス
    細胞(左図)とウイルス(新型コロナウイルス-WHO特設サイト-、右図)

    ファージ

    ファージでは、細胞表面が硬い細菌に感染するために、「月面着陸宇宙船」の形(機能)をしています。

    ファージの足の部分で、細菌に着陸(吸着)し、その後、胴体部で穴を開けて、スポイドの頭のような部分に保管されている自らの遺伝子を細菌の内部に注入します。

    図2. 大腸菌とファージ
    大腸菌(左図)とファージ(右図)

    増殖の機構は同じ

    ウイルスとファージの増殖は、細胞や細菌の生命活動を使って増殖します。細胞、細菌の中に自分の遺伝子が入ってしまえば、後はそれぞれの宿主(細胞、細菌)の生命活動の中でウイルス、ファージの独自の遺伝子が機能することにより、ウイルスやファージのパーツであるタンパク質が作られます。そのパーツから完全な形のウィルスやファージが作られ、宿主から飛び出ていきます。

    増やす方法

    細胞・細菌を増やす

    栄養分を含む溶液(培地)に細胞や細菌を浸して、適度な条件 (温度、pH、浸透圧、酸素濃度、栄養素)で維持(培養という)してやると増殖します。

    • 動物細胞、大腸菌
    • 温度
    • pH
    • 溶存酸素濃度
    • 栄養

    増殖は、1個が2個になる、中学生の頃にに学んだあの増殖です。1個が2個、2個が4個、4個が8個、8個が16個・・・。この2個になる時間を「ダブリングタイム」と言います。

    ウイルス・ファージを増やす

    ウイルスやファージは、「細胞を増やす」で増やした細胞・細菌を用います。細胞、細菌に、ウイルス、ファージを添加して感染させます。感染とは、前述したように細胞、細菌の中に入ることです。細胞に接触させるだけで、感染させることができます。

    ウイルスやファージは、自分たちが増殖しやすい宿主を知っており、その宿主である細胞や細菌の表面に付着(これを知っていると表現)して、中に入り込みます。これを感染といいます。感染した後、宿主の細胞、細菌の生命活動を利用して自分自身のパーツをつくり、複製していきます。宿主を知っているとは、受容体が存在していると言い換えることができます。

    受容体とは、相手方(細胞など)に自分(ウイルス)のある部分を認識して結合できるある部分(一番的にタンパク質)のことを一般的にそのように呼びます。受容体が存在しなけば、感染は成立しません。

    まとめ

    バイオの初学者向けに、細胞、細菌、ウイルス、ファージの増やす方法 (単に「培養」と呼んだりする)について解説しました。

    以上

    大腸菌のイラスト – 理研 –

    http://rtcweb.rtc.riken.go.jp/DNA/sec/m1.html

    ファージに関する情報です

    ファージ — – ウィキペディア –

    https://ja.wikipedia.org/wiki/ファージ

    細胞培養の種類、培地、など詳細な基礎的な情報がえられます

    細胞培養の基礎知識 – Merck –

    https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipeecoli.pdf

    線画培養からシングルコロー取得して液体培養までの必要な材料と手順などの情報が得られます

    大腸菌培養 – Sigma Aldrich –

    https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipeecoli.pdf

    昆虫細胞の培養培地に関する製品情報です

    昆虫細胞培養 – Thermo Fisher Scientific –

    https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cell-culture/insect-cell-culture.html

    参考動画 – 細胞の説明

    編集履歴

    2020/03/27 Mr.Harikiri
    2022/05/09 追記 (図)、文言整備
    2020/10/06 追記 (培養用の培地情報)、文言整備
    2022/11/08 追記(はじめに)、文言整備

  • [Bio-Edu] 細胞・細菌・ファージ・マイコプラズマ・ウイルスの大きさ — ID11542 [2020/05/23]

    [Bio-Edu] 細胞・細菌・ファージ・マイコプラズマ・ウイルスの大きさ — ID11542 [2020/05/23]

    ID11542

    はじめに

    バイオロジクス研究を志す者として、必要となる関連知識は沢山あり、且つ学際的です。色んな事柄を知っておく事は、とにかく重要です。

    今回は、バイオロジクスの遺伝子組換えのホスト細胞としてよく使われる動物細胞を基準に、疾病の原因であるウイルスやホスト細胞としても良く使われる大腸菌などの大きさを確認しておきましょう。

    生物ごとの大きさ(1)

    細胞、細菌、ウイルス、ファージの大きさは、一言で以下の通りです。

    単位

    3桁毎の単位として、m(ミリ)の1/1,000はμ(マイクロ)、μの1/1,000はn (ナノ)です。m(メーター)の1/1,000を表すのにmm(ミリメーター)とします。以下、μとnを使って、それぞれからの1/1,000を表します。


    1mm = 1,000μm = 1,000,000 nm

    大きい > 細胞 > 細菌 > ファージ > ウイルス > 小さい


    病原体:ウイルスと細菌と真菌(カビ)の違い — 大幸薬品

    https://www.seirogan.co.jp/fun/infection-control/infection/dengerous_pathogen.html

    生物ごとの大きさ(2)

    実は、これら以外に、真菌、マイコプラズマ、リケッチア、ファージも役者として追加してみます。

    真菌の形は、球菌 (球状)、 桿菌 (棒状)、らせん菌 (らせん)などと色々あるため、大きさを定めのは難しいですが、細胞あたりの大きさに設定しました。

    • 大きい
    • 細胞(10μm) | 真菌
    • 細菌(5μm)
    • ファージ(0.025μm ~ 0.2μm)
    • マイコプラズマ(0.2μm ~ 0.8μm)
    • リケッチア (0.1μm ~ 2μm)
    • ウイルス(0.02μm (20nm) ~ 0.1μm)
    • 小さい

    大きい > 細胞 | 真菌 > 細菌 > ファージ > マイコプラズマ > リケッチア > ウイルス > 小さい

    以上、ウイルスと細菌の大きさの違い – 秋田大学 大学院医学系研究科・医学部 – より

    http://www.med.akita-u.ac.jp/~doubutu/kansensho/virus17/virus2-2.html

    リケッチアを含む「微生物」の大きさ

    臨床微生物学基礎編 より

    http://www.kankyokansen.org/common/fckeditor/editor/filemanager/connectors/php/transfer.php?file=/publication/edu_03_pdf/uid000001_332D325F32332E706466

    3 マイコプラズマの検出と除去・予防 – より

    最小の自由生活・自己複製微生物、大きさ: 0.2μm~0.8μm、細胞質を持たない単純な原核細胞、180種類以上が確認されている

    http://www.lonzabio.jp/pdf/mycoplasma.pdf

    微生物の特徴

    実利増殖遺伝子核膜細胞壁
    ウイルスDNA or RNA
    細菌DNA有(まれに無)
    真菌DNA
    原虫DNA

    目でみる真菌症シリーズ2

    http://www.pf.chiba-u.ac.jp/medemiru/me02.html

    細菌を包んでいる膜

    • グラム陽性菌 (菌の内側から)
      • 分厚い「細胞膜」: リポタイコ酸、タイコ酸
      • 薄い「細胞膜」 : 二重膜
    • グラム陰性菌 (菌の内側から)
      • 薄い「外膜」 : 二重膜(ポーリン孔、リポ多糖)
      • 薄くて弱い「細胞壁」: ペリプラスム空間
      • 薄い「細胞膜」: 二重膜

    大腸菌

    実験者の間では、E.coli(いーコリー)と言ったりもします。

    遺伝子組換えに使用される大腸菌は、グラム陰性菌です。組換え産生タンパク質は、ペリプラスム空間に溜まる場合は、比較的、立体構造を保っている場合があります。

    臨床微生物学基礎編

    http://www.kankyokansen.org/common/fckeditor/editor/filemanager/connectors/php/transfer.php?file=/publication/edu_03_pdf/uid000001_332D325F32332E706466

    臨床微生物学基礎編

    https://www.med.kindai.ac.jp/transfusion/ketsuekigakuwomanabou-252.pdf

    まとめ

    生物は細胞で作られています。細胞は一つの生命活動の単位です。その細胞内に似ているものの生物としてヒトや動物を形作らい面々がいます。一般的に病原体と呼ばれています。

    これらは、細胞に似ているから病原体になるのかもしれません。

    この解説では、以上のような背景を踏まえて、それぞれの大きさいを比較しました。

    以上

    編集履歴

    2020/03/07 はりきり(Mr)
    2020/05/06 追記 (生物ごとの大きさ(2))
    2020/05/09 文言整備
    2020/05/23 追記 (真菌、大腸菌)
    2021/10/31 追記 (単位の説明を修正)
  • [Bio-Process] 細胞バンク – ID9833 [2020/02/01]

    [Bio-Process] 細胞バンク – ID9833 [2020/02/01]

    生産細胞株

    通常、Cell Bankの保管は、劣化を極力抑えるために液体窒素蒸気下の極超低温で行われます.

    保管容器

    Nunc™ Press Out Tool for Cryobank and Bank-It™ Vial Systems, ThermoFisher

    https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/374009
    • 凍結保管セルバンクの融解とフラスコ培養

    関連するICHガイドラインと試験項目

    Q5シリーズ、FDAガイダンス、その他ウイルス否定試験、無菌、マイコプラズマ、などの試験項目を示します。

    • Q5A : 安定性
      • in vitro迷入ウイルス(今日培養CPEアッセイ, MRC-5, Vero, HEK293)
      • 血球吸着反応
    • Q5B : バンクシステム
    • Q5D : 考慮事項
    • Q5E : 同等性/同質性
    • FDA Guidance
      • in vivo迷入ウイルス(鶏卵、若齢マウス、成熟マウス、モルモット)
    • その他ウイルス否定
      • ヒトウイルス(qPCR)
      • ウシブタウイルス(9-CFR)
      • マウスウイルス(マウス抗体産生株)
      • レトロウイルス(電顕, F-PERT, HEK293共培養F-PERT)
    • 無菌試験
      • PH Eur 2.6.1, <JP 4.06, USP 71>
    • マイコプラズマ否定
      • PH Eur 2.6.7 (USP 63)
    • DNA finger print (PCR)
    • 細胞濃度、生存率
  • [用語] HEK細胞 ; ヘックさいぼう – バイオ医薬品で用いられる生産用宿主細胞

    [用語] HEK細胞 ; ヘックさいぼう – バイオ医薬品で用いられる生産用宿主細胞

    HEK 細胞 ; human embryonic kidney cell

    詳しくは以下の記事をご覧ください。

    BIOLOGICS, key-word

    [用語] HEK293細胞 – その他派生種の概説 [2020/12/22]

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  • [用語] codon ; コドン – 遺伝子の構成要素はA,T,G,C、アミノ酸は3つの組み合わせ

    [用語] codon ; コドン – 遺伝子の構成要素はA,T,G,C、アミノ酸は3つの組み合わせ

    codon

    コドン(英: codon)とは、核酸の塩基配列が、タンパク質を構成するアミノ酸配列へと生体内で翻訳されるときの、各アミノ酸に対応する3つの塩基配列のこと wikipedia

    遺伝子は、A,T,G,Cで構成されており、3つの組合せでアミノ酸をコードしているが、アスパラギンはAAUかAACの組合せであり、2種類のコドンが存在する

    編集履歴
    2020/07/11 Mr.HARIKIRI

    [Vc] mRNAワクチンとは – Sanofi, Modernaなどが開発を進めている – ID15091 [2020/05/23]

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    [用語] codon ; コドン – 遺伝子の構成要素はA,T,G,C、アミノ酸は3つの組み合わせ

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    [Bio-Edu] RNA とは – mRNAはタンパク質を作る直接的な設計図 – その他 rRNA, tRNA – ID7254 [2020/01/15]

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    [Bio-Edu] 遺伝子 – 生体内におけるDNAからタンパク質の合成 ・基礎知識 – [2020/06/13]

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    [健康] 神経疾患(ミオパシー、てんかん)に共通する異常なリピート配列の発見 – リピート配列は開始コドンがなくてもたんぱく翻訳される – ID1093 [2020/07/11]

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  • [Bio-Edu] バイオ医薬品における生産細胞株の構築の方法 – ID5029 △[2020/08/19]

    [Bio-Edu] バイオ医薬品における生産細胞株の構築の方法 – ID5029 △[2020/08/19]

    細胞株の構築

    最近のバイオ医薬品の生産細胞株構築フローを以下に示します。

    1. Host Cell : 目的のタンパク質を発言させるために使用する出発材料である最適化された細胞。目的遺伝子を導入する予定の細胞。
    2. Transfection : 遺伝子の導入プロセス
    3. Selection & Cloning : 高い生産性と増殖による世代安定性を維持するモノクローンを選択するプロセス
    4. Cell Bank : Master Cell Bank (MCB)の候補となる細胞株
    5. MCB : 品質試験されて正式に決定した生産細胞株(Characterized Cell Bankという言い方もある)
    6. Working Cell Bank (WCB) : Expanded MCB/マスターセルバンクの拡大培養により細胞を増やして、MCBと土曜用に品質試験されて正式に決定した生産細胞株。ルーチン製造に使用される。

    生産細胞株の構築フロー

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    Post Views: 236 Working Cell Banking マスターセルパンク(MCB)の拡大培養により細胞を増やし、MCBと同様に品質試験されて、正式に決定された生産細胞株であるWorking Cell …
    Post Views: 236 Master Cell Banking GMPに従いマスターセルバンク(Master Cell Bank; MCB)を製造し液体窒素による超低温保管する。日本、米国、欧州の3つの薬局方(3…
    Post Views: 210 Cell Banking GMPに従いマスターセルバンクとワーキングセルパンクを製造し液体窒素による超低温保管すること。セルバンクには、開発段階ごとに以下のようなものが作成される。 Res…
    Post Views: 249 目的物質の生産性、生産物の品質、培養容易性、培養安定性の観点からからプール細胞のスクリーニングとモノクローニングすること。 スクリーニングに用いられる評価試験項目は以下の通りです。 目的物…
    Post Views: 235 transfection transfection ; トランスフェクションは、遺伝子組換え技術の基本である目的遺伝子(plasmid)を細胞 (Host Cell)の中に入れる操作です。…
    Post Views: 240 Host Cell 目的のタンパク質を発現させるために使用する出発材料となる最適化された細胞のこと 編集履歴 2020/08/24 Mr.はりきり

    導入遺伝子の構築

    • gene配列の合成
    • Plasmid DNAの合成
    目的遺伝子をのりしろ付きで合成し、Plasmidにパッケージする

    制御遺伝子には、Promoter、Enhancer などがあり、高い生産性を目的とする。抗生物質耐性遺伝子は、目的遺伝子が正しく細胞に導入された場合、それと共に発現するため、抗生物質を添加した培地でも生き延びることが可能となる。遺伝子が導入できなかった細胞は、死滅させることができる。

    遺伝子導入とは

    遺伝子の導入 (transfection)するの目的は、ある細胞に目的遺伝子を導入(Transfection)することで、宿主細胞の力を借りて、その遺伝子にコードされている蛋白質を生産させることである。

    どんな細胞を使うか

    一般的に通常の細胞は寄り添います。たとえば、皮膚細胞は、それぞれの細胞は積み上がることなく横に広がる性質があります( monolayer cell ).

    バイオ医薬品に使用される細胞は、1個1個の細胞が単独で浮遊するように改良が加えられており、細胞の培養において、個々の細胞に栄養分が均一に行き渡らせることが可能です。コントロールしやすい細胞になっています。

    長い歴史の中で、HEK細胞、CHO細胞などが、遺伝子導入する細胞として適しているとして多くのバイオロジクスで使用されています。

    原材料

    細胞とPlasmid DNAについて

    • 1個の細胞を使って1のPlasmid DNAを、その細胞に導入できる技術は、世の中にはありません。
    • 細胞もPlasmid DNAも物理化学的に不安定な部類です。人工的な処理やある環境下では、一定の確立で死ぬか壊れてしまいます。
    • 実際の導入には、細胞やPlasmidが、死ぬか壊れるかを考慮し、確実に細胞に遺伝子を導入するために、細胞数として数十万個、あるいは数百万個を用意します。
    • 細胞の中に導入したいPlasmid DNAも細胞に対して等倍はあり得ず、複数倍を用意します。経験則も存在します。

    導入 ( Transfection )

    導入法の種類

    • リン酸カルシウム
      • リン酸カルシウム溶液とPlasmid DNA複合微粒子を細胞に混和すると、プラス荷電化によりマイナス荷電している細胞膜表面に結合し、その後、エンドサイトーシス機構で取り込まれる
    • 陽イオン性脂質 (lipofection*1)
      • Plasmid DNAを包含したリン脂質と細胞膜が膜融合する原理で導入する
      • 試薬 ThermoFisher
    • マグネットフェクション (magnetofection)
      • 作製した磁気ナノパーティクルとPlasmid DNAの結合物を、底に沈めた細胞がある容器に注入し、細胞へ向かうように容器の下から磁気をかけて導入する
      • 試薬 funakoshi
    • エレクトロポレーション (electroporation)
      • エレクトロトランスポレーターを使用して電気のパルスをかけて細胞膜に小さな穴を開けてPlasmid DNAを導入する
      • 装置 参考記事*
    • ウイルス (virus vector)
      • 原理的にはLipofectionと類似。包含体としてのキャリアとしてウイルスを使われる。retrovirusなどが使われる

    参考記事

    遺伝子導入から細胞株構築まて

    遺伝子増幅

    生産量を増加させるには、導入遺伝子の増幅が行われるDHFR(Dihydrofolate reductase)系、GS(Glutamine synthetase)系などがある。

    • DHFR
      • DHFRの拮抗剤である MTX(methotrexate)の添加
      • dhfr 遺伝子が増幅す る現象を利用
      • dhfr 欠損 CHOを使用する
        • DG44
        • DXB11
      • 増幅方法 : MTX の濃度を徐々に上げていく

    蛋白質科学会アーカイブ, 2, e050 (2009)

    http://www.pssj.jp/archives/files/articles/050.pdf

    スクリーニングとクローニング

    スクリーニングとモノクローニングは、手法によって前後することができる。

    スリーニング

    スクリーニングの目的

    染色体DNAに導入された数十・数百万個の細胞には、以下のような違いが生じます。それを均一な集団にしていく作業がスクリーニングです。

    • 導入操作によって死んでいたり、弱っているいる細胞が混在している
    • 導入位置よっては、今は死んでいないが、数世代の分裂増殖によって細胞が弱わり死んでしまう細胞が混在している
    • 目的遺伝子による目的蛋白質の生産性が低い細胞が混在している
    • 元気がよく、目的蛋白質の生産性が高い細胞が非常に低い確立で含まれている

    スクリーニングの操作

    • まだ、クローンになっていない段階をプール(株)といいます。トランスフェクション後の細胞について、大まかな集団を一塊として、選別を行なっていきます。
    • 選別基準
      • 高い細胞増殖性 : 組み込んだ遺伝子により、生産される目的物質の生産量が培養当に多くなる
      • 高い培養期間生産性 : 一定の培養期間で高い生産性により、生産される目的物質の生産量が培養当に多くなる
      • 培養安定性 : スクリーニング過程では、継時的な培養が進められます。その過程では、細胞の世代数が進んで行きます。即ち老化です。すると、死んでいくプールもあり脱落します。元気に生きていくプールが残って行きます

    クローニング

    クローニグの目的

    スクリーニングによって元気が良く、目的蛋白質の生産性が高い細胞について、何種類かを選別できたあと、1つの細胞から増やしてクローン株として取得します。

    クローニングの操作

    • 先ずは、目的達成のために、処理する母数を増やす
    • 最終的には、1個の細胞のみを小さい容器に振り分ける操作の実施(限界希釈法)
      1. 数十個から数百個の細胞プールとして小さい容器に振り分ける(数千から数万プール)
      2. 培養装置により増殖させて元気がいい細胞プールを選別する。
      3. 1と2を何回か繰り返し、細胞プールを数十に絞る
      4. 限界希釈法により計算上1の細胞になるよう容器に振り分ける
      5. 元気が良いものを選び、生産性も高い10個程度の方法細胞を選出する
      6. 最終的には、生産する蛋白質の品質を確認し良い細胞1つに決定する。
      7. 選んだ細胞がモノクローンであることを確認する。

    Cell Bankの調製

    限外希釈により、1個の細胞しか、1の培養ウェルに入っていないことを確認して、拡大培養させます。ある程度の細胞数が得られたたら、それをCell Bankとして、クリオバイアルに分注して、液体窒息保管します。

    細胞融合法

    トラディショナルな技術です。

    ELISA用の抗体など、試薬に使用する抗体は、マウス由来の免疫抗体がほとんどです。ずいぶん昔では、このような抗体でもそのままか、抗体のフレームにヒトの配列と差し替えたりしてキメラ化した抗体が、医薬品として使用されていたこともあったようですが、免疫原性の問題を解決すべく、最近の抗体医薬は、完全ヒト化がほとんどです。

    細胞融合法による抗体産生細胞株の作成方法の概要は以下の通りです。

    • 細胞融合法の手順
      • 抗原取得(精製品)→
      • 動物に接種(免疫)→
      • サクリファイ→
      • 抗体産生細胞の取得(脾臓)→
      • 不死化細胞と細胞融合(ミエローマ; SP2/0, etc)→
      • ハイブリドーマ(hybridoma cell)→
      • スクリーニング→
      • 増殖性を獲得した抗体産生モノクローナル細胞
    • 細胞融合法には。
      • 融合効率は、1e-6 ~ 1e-4 (細胞1万個から100万個から1個)
      • PEG法
      • 電気融合法 (以下に最初の文献リンク)

    高効率細胞融合技術の開発

    https://www.tosoh.co.jp/technology/assets/2009_02_02.pdf

    Human Hybridoma Cells Produced by Electro-Fusin
    FEBS Letters, Vol.147, Issue 1, 1982

    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/6982832/

    用語

    *1: Lipofection : DNAを封入した脂質二重膜を細胞と接触させて、膜融合の現象により、DNAを細胞内に取りませんるTransfection手法の1つ

    参考文献

    徹底網羅!トランスフェクションにおける化学的手法、生物学的手法、物理的手法まとめ

    https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/gene-delivery-technologies/

    MATra-Magnet Assisted Transfection / Lipofection - マグネットフェクションとリポフェクションの原理に関する参考文献

    https://www.nacalai.co.jp/update/pdf/Information-441-light.pdf

    MSD マニュアル プロフェッショナル版 – 医療についての情報サイト

    https://www.msdmanuals.com/ja-jp/プロフェッショナル

    MSD マニュアル 家庭版 – 医療についての情報サイト

    https://www.msdmanuals.com/ja-jp/ホーム

    3.遺伝子導入と発現シリーズ 遺伝子導入と発現(1),

    https://www.jstage.jst.go.jp/article/manms/7/2/7_2_92/_pdf

    安定型細胞株作成のガイドライン

    http://www.lonzabio.jp/tech/pdf/tech_12.pdf

    トランスフェクション手法の紹介・比較

    https://www.funakoshi.co.jp/contents/65100
    編集履歴
    2020/01/11 はりきり(Mr)
    2020/04/23 追記 (Cell Bankの調製)
    2020/06/26 追記 (細胞融合法によるHybridoma cell取得)
    2020/08/19 追記 (構築フロー)