![[Bio-Raw Material] Protein A resinの簡単な説明 [2020/06/01]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/08/0C73DA60-4196-4AFF-9BF0-94BD726CDB1B.jpeg)
抗体を産生株した培養液は、清澄ろ過してから、Protein AカラムによるBinding/Elutionモードで抗体のアフィニティ精製を行う。
Mab Select SuRe
Amsphere A3
![[Bio-Equip] BioProfile FLEX 2 の簡単な説明- 細胞培養環境自動分析装着 [2020/06/01]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/06/587E16F8-863C-45E6-94FD-A64701B025AF.jpeg)
バイオ医薬品の製造では、細胞培養状態を適切に制御することは、その細胞が生産する目的物質の品質管理には欠かせない。管理すべき測定項目が多いことが、バイオ医薬品の特色の一つでもある。その管理項目を一台の装置により、短時間、且つ迅速に測定できることは、品質の向上性に寄与する。又、ambr15/ambr250との接続機能は、詳細な培養条件の最適化検討にもその力を存分に発揮する。
ノバ・バイオメディカル
https://www.novabio.us/jp/flex-2/index.php
| モジュール | 測定時間 | 検体サイズ |
| ガスモジュール pH, PCO2 , PO2 | 120 秒 | 275 μL |
| 化学モジュール Gluc, Lac, Gln, Glu, NH4+, Na+, K+, Ca++ | 120 秒 | 135 μL |
| 浸透圧モジュール 浸透圧 | 240 秒 | 145 μL |
| 細胞密度/生存判別モジュール 合計細胞密度、生存判別、細胞直径 | 240 秒 | 135 μL |
生死細胞オートアナライザー
https://ls.beckmancoulter.co.jp/products/cell-counting/vi-cell
Vi-CELL XR – BECKMAN COULTER
編集履歴
2020/06/01 はりきり(Mr)
![気になる企業 – Novartis グループ- Novartisは新薬開発、Sandozはジェネリックとバイオシミラー、AveXisは遺伝子治療 [2020/05/30]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/10/B4F24978-42E9-477E-92B0-94605AEBEAB4.jpeg)
2020年現在、Novartisは、遺伝子治療(AveXisのZolgensma)とデジタルヘルスのリーダー。
Novartis delivered strong sales growth, margin expansion and breakthrough innovation launching five NMEs in 2019. NOVARTIS -サイトより
https://www.novartis.com/sites/www.novartis.com/files/q4-2019-media-release-en.pdf
ノバルティス（Novartis International AG）は、スイス・バーゼルに本拠地を置く、国際的な製薬・バイオテクノロジー企業である。スイス証券取引所、ニューヨーク証券取引所上場企業（SIX: NOVN、NYSE: NVS）。チバガイギー社(Ciba-Geigy)とサンド社(Sandoz)という、スイスを拠点とする製薬会社2社の合併によって1996年に設立されたwikipedia
Geigyは、元は化学薬品・染料を扱う貿易会社(18世紀中頃)。Cibaは、染料の生産(1859)、Sandozは、化学薬品会社(1886)でした。更に、化学薬品製造部門を分離して、製薬会社賭してのノバルティスになりましたノバルティスの歴史
編集履歴 2020/05/30 Mr.HARIKIRI 2020/06/24 追記(売り上げ)
Sandozは、Novartisグループのジネリック事業部門である。
https://www.novartis.com/sites/www.novartis.com/files/novartis-pipeline-2019-annual-report.pdf
| mAb name | Project enterd~Potential indication – current phase – Planned filing dates | |
| canakinumab | Anti-IL 1 beta | 2017~2nd line non-small celllung cancer – P3 – 2021 2017~1st line non-small cell lung cancer – P3 – 2021 2017~Adjuvant non-small cell lung cancer – P3 – 2022 |
| iscalimab | Anti-CD40 | |
| secukinumab | Anti-IL17 | 2015~Non-radiographic axial spondyloarthritis – US/EU(Reg) 2015~Psoriatic arthritis head-to-head study vs Humira – P3 – 2020 2015~Ankylosing spondylitis .. – P3 – 2022 2017~Hidradenitis suppurativa – P3 – 2022 2018~Glant cell arterits – P2 – >=2024 2019~Lichen planus – P2 – >=2024 |
| TBD | Anti-thymic stromal lymphopoietin | 2018~Severe asthma – P2 – 2023 |
| ofatumumab | Anti-CD20 | 2015~Relapsingmultiple sclerosis – US/EU(Reg) |
| spartalizumab | Anti-PD-1 | 2017~ Metastatic BRAF V600+melanoma – P3 – 2020 2017~Metastatic melanoma (combo) – P2 – 2023 |
| ligelizumab | Anti-IgE (high affinity) | 2017~ Chronic spontaneous urticaria/chronic idlopathic urticaria – P3 – 2021 |
| brolucizumab | Anti-VEGR single-chain | 2019~Neovascular (wet) age-related macular – US Reg, EU Registration 2017~Diabetic macular edema – P3 – 2021 2018~Retinal vein occlusion – P3 – 2023 2019~Proliferative diabetic retinopathy – P3 – 2023 |
| lanalumab | Anti-BAFF (B-cell-activating factor) | 2016~Autoimmune hepatitis – P2 – >=2024 2015~Primary Sjogren’s syndrome – P2- >=2024 |
| omalizumab | Anti-IgE | 2017~Nasal polyps US/EU – Reg.(2017) 2019~Food allergy P3 – Reg(2021) |
遺伝子治療事業部門は、AveXisです。
製品
2022年までに、40の新しい希少疾患治療薬が見込まれる。製造スロットの確保は、18ヶ月の待ち時間に直面している
PfizerとNovartisが率いる11の製薬会社は、2018年以降、遺伝子治療の製造に関する投資額を20億ドル確保している
遺伝子治療用医薬製造プラントの建設のめたに、Pfizerは6億ドル、Novartisは5億ドルを確保。これらの対応は、製造コストの削減と、時間の節約のためと言います。更には、まだ未知のことが多いい遺伝子治療用の製造方法を保護し、FDAの注文に即応することが狙いです。
*1: デュジェンヌ治療薬開発のSarepta Therapeuticsは、臨床試験を延期しており、その理由は、製造の一貫性についてのFDAからの質問を避けるためと言われている。
患者一人当たりの治療費は、100万ドルを超える額は妥当であると言われている。
一方で、AveXis部門のデータ改竄についてのFDAの対応もあったように、FDAは規則を厳格に監視しています。
Pfizer, Novartis lead $2 billion spending spree on gene therapy production (ファイザー、ノバルティスが遺伝子治療の生産に20億ドルを費やす) – REUTERS(ロイター) 2019/11/27
https://www.reuters.com/article/us-genetherapy-novartis/pfizer-novartis-lead-2-billion-spending-spree-on-gene-therapy-production-idUSKBN1Y11DP
https://www.sandoz.com/our-work/biopharmaceuticals/sandoz-biosimilar-portfolio-and-pipeline
ノバルティスグループのジェネリック事業部門のトップカンパニー。
台湾のEirGenixとのStrategic Partner連携により、trastuzumabのbiosimilarを開発しており、2019/12現在、Phase 3である。
| Biosimilar by Sandoz GmbH | Original | Approved date~Country |
| Rixathon | Rituximab Anti-CD20 | 2017/06/15~Europe 2017/11~Japan |
| Hyrimoz | Adalimumab (Abee) | 2018/07/25~Europe |
| Zessly | Infliximab Anti-TNFα | 2018/05/18~Europe |
| GP2411 (in house) | denosumab | 2020 – P3 |
| (Biocon) | development in immunology and oncology | n/a |
| (Gan & Lee) | aspart insulins | n/a |
| (EirGenix) | Herceptin trastuzumab(1998,中外製薬) | 2020~P3 |
| (Polpharma Biologics) | nataliumab (Biogen) Anti-integrin α 4(2006) | 2020-P3 |
台湾のBiologics CDMOで、最も技術力のあるCDMOの1つで、且つ、バイオテクノロジー企業です。
その理由として例えば、以下の開発力から分かります。
trastuzumabは、中外製薬がオリジナルで、ハーセプチンという製品名です。Sandoz からの委託契約でtrastuzumabのbiosimilarをin houseで開発しています。2019/4現在、世界11カ国でPhase IIIが実施されています。Sandozとの契約では、Sandozは、中国、台湾を除く全てのグローバル市場において、EirGenixのEG12014の独占的な商業的権利を所得しました。2019/6には、EirGenixは、この契約の成功報酬として$500万を受け取っています。
Sandozは、以下のtrastuzumabのBiosimilar競争に参画しようとしている訳です。
編集履歴
2020/05/29 はりきり(Mr)
以下に、CDMOとしての実力を知るために設備を中心に情報をまとめました。設備については知る機会がなかなかありませんが、EirGenixの設備について、360°で詳細を見ることができます(virtual tour)。
| Service | Summary |
| Cell Line Development | DNA to stable cell line cell line : CHO, NS0, PER.C6, E.coli, Pichia identified in 19 weeks serum-free medium screening platform |
| Cell Banking | cGMP production facilities for MCB and WCB |
| Process Development | 1) Upstream -1. process optimization, troubleshooting, media, feeding, process parameter – mammalian: flask, 2L, 5L, 50L SUB – microbial: 2L, 20L fermentor 2) Downstream -1. experience – mammalian: recombinant protein, fusion and mAb – microbial: inclusion body and soluble, pegylated protein, fusion and Plasmid DNA -2. equipment – LCS: AKTA PRIME, AKTA Pilot, AKTA Avant; column size: 1mL HiTrap to 14cmφBPG column – MF & UF system, UF/DF system,centrifuge of Disc and continuous, tank (316L SS), Homogenizer (Microfluidizer and APV) 3) Formulation -1. preformulation : Lyophilizer, Stability chamber, programmable controlled freezing and thawing system 4) Purity analysis – Three Agilent HPLC, one UPLC |
| Analytical/QC | – method development; method transfer; method qualification and validation; stability testing; Characterization : glycan analysis, glycan profile and ratio, monosaccharide, secondary or more analysis |
| – Item | – Potency/Activity : ELISA, Cell base assay – Impurity : Host cell DNA, Host cell protein, Protein A residue, Others – Biological safety : Endotoxin, Bioburden, Microbial enumeration – Analytical method qualification and validation : Specificity, Linearity & range, Accuracy and precision, LOD/LOQ – Glycan analysis : N and O-linked carbohydrates site and structure: HPLC/UPLC; N and O-linked glycan mapping and ratio : CE, LE/MS; N-glycan ratio : CE, LC/MS – Monosaccharide analysis : HPIC – Secondary and higher order structures: CD (Circular Dichroism), DSC (Differential Scanning Calorimetry), Fluorescence Spectrometer – Heterogeneity analysis : IEF/cIEF, CIX-HPLC |
| cGMP Manufacturing | Mammalian Certificates : 2005(T-FDA), 2014(T-FDA), 2017(foreign manufacturer) |
| – GMP facility (bioreactor), 360 virtual tour | 1st Floor : 10,000ft2 – Media preparation : 50L ~ 700L – 100L/500L SS – 50L/200L/1,000L SUB – Millipore POD and 3M CUNO filtration system – UF/DF (0.1~14 m2) – Column : 3mm ~ 10mmφ, 5cm~60cmφ – one purification room – one final purification room – Washer room and autoclave room – 2 x 2,000L SUB in northern part of Taiwan |
| – experience | Basically, clinical trial – Anti-IL20(CHO, PER.C6) – Anti-HSV (CHO) – Anti-TNFα(CHO) – Bio-similars (CHO |
| cGMP Manufacturing | Microbial Certificates : 2013(T-FDA), 2014(T-FDA), 2017(foreign manufacturer) |
| – GMP facility (bioreactor) | 5th Floor : 4,000ft2 – cell banking area (provide maximum 400 vials/batch) – inoculation suite – fermentation & harvest suite – – fermentor 20L/100L fermentor – – mixer tank 100L/200L/400L – – homogenizer 10L/hr, 100L/hr – purification suite – – UF/DF 0.5 ~ 5 m2 – – Centrifuge 10~100L semi-continuous – – Column 3mm ~ 6mmφ, 7cm ~ 45cm – bulk fill room – buffer preparation room – wash & autoclave room |
| – experience | – recombinant proteins – – soluble protein, Pichia – – complexes soluble protein, E.coli – – Pegylated proteins inclusion body, E.coli – Protein vaccines – – soluble protein, E.coli – Bio-similars – – Inclusion body, E.coli – Plasmid DNA (E.coli) |
| Special | Antibody Drug Conjugate (Four ADC commercial >60 in clinical in world situation) |
| – Strategic partner | Formosa Laboratories (58 chemists, 9 process patents) – high potency drug manufacturing – 2000L scale of APIs manufacturing – 50~1000L SS Reactor – 50~1000L chromatography column – Isolator (glove box) – 280L Falling Film Evaporator |
| – Linkers by partner | Linkers are key component in ADC EirGenix has partners with the leading linker development companies |
編集履歴 2020/05/2o Mr.HARIKIRI
Precision NanoSystems Inc (PNI)は、RNA、DNA、CRISPR、低分子医薬品、COVIDワクチン、治療法を開発して患者に迅速にアイディアを提供する技術とソリューションのグローバルリーダーです。
https://www.precisionnanosystems.com/
CanSino BiologicsとPrecision NanoSystemsがCOVID-19 RNAワクチンを共同開発するためのコラボレーションを発表 (2020/05/20)
それぞれは，天津、中国およびVANCOUVERの企業、2020年5月20日/ CNW /-CanSino Biologics Inc.（CanSinoBIO、HK6185）とPrecision NanoSystems（PNI）は本日、COVID-19に対するmRNA脂質ナノ粒子（mRNA-LNP）ワクチンの共同開発契約を発表した．
COVID-19 mRNA-LNPワクチン候補をヒトの臨床試験に向けて、CanSinoBIOは前臨床試験、ヒトの臨床試験、規制当局の承認および商品化を担当．
CanSinoBIOは、ワクチン製品をアジア（日本を除く）で商品化する権利を有し、PNIは他の国々の権利を保持．
契約には、非公開の支払いとロイヤリティが含まれる．
Sparkという製品は、マイクロリットルの製剤を調製できます。原料をピペットで添加してスタートボタンを押すだけです。処理時間は、10秒程度/条件で、数百の配合は割合を数時間で処理し、各条件の製剤を取得できます。
https://www.precisionnanosystems.com/our-technology/spark
Scalable manufacturing is a significant challenge to making revolutionary nanomedicines available to patients in need.
2018年、脂質ナノ粒子（LNP）製剤であり、FDAの承認を受けた最初の低分子干渉RNA治療薬であるPatisiranのFDA承認により、非ウイルスRNAデリバリーの最高技術としてLNPが確立されました。 同時に、マイクロ流体混合を利用するNanoAssemblr®プラットフォームは、100％に近いカプセル化効率でさまざまなタイプの核酸をカプセル化するLNPのシンプルで堅牢かつスケーラブルな製造方法として実証されています。 LNPは、in vitroおよびin vivoでの遺伝子ノックダウンまたは遺伝子発現研究のための多様なオプションを提供します。 NanoAssemblr SparkTMは、マイクロ流体混合の追加の利点を活用します：新規脂質やmRNAなどの高価値材料を保存するマイクロリットル規模の製剤。 超少量の製剤と迅速でシンプルかつ再現性のあるプロセスのこのユニークな組み合わせにより、SparkはmRNA-LNP製剤のスクリーニングと初期の前臨床開発のための理想的なプラットフォームになります。 効果的なスクリーニングプログラムは、次世代のデリバリーテクノロジーとナノ粒子治療法を開発および最適化するためのパラメータースペースを大幅に狭めることができます。
ナノ医薬品の早期発見と開発における一連の医薬品有効成分、賦形剤、製剤パラメーターのスクリーニングにより、より集中的に パラメータスペースを狭めることにより、後の段階で効率的に開発できます。 この目的のために、製剤の特性または活性の観察された違いが、ナノ医薬品の合理的な設計を通知する組成または条件の制御された変化に起因する可能性があることを保証するために、少量での高速で再現可能なナノ粒子の生産が必要です。 さらに、これを少量で達成すると、APIと賦形剤の使用が最小限に抑えられます。これは、発見段階では、入手が制限されたり、入手に費用がかかったり、生産に手間がかかる場合があります。 特に、低分子干渉RNA（siRNA）、ガイドRNA（gRNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）、プラスミドなどの細胞の遺伝子操作に使用される有効成分は、不足しているか非常に高価です。 非ウイルス性核酸送達システムは、mRNAワクチン1、2、免疫腫瘍学3、標的腫瘍学4-6、CRISPR / Cas9遺伝子編集7-9、およびまれな疾患の治療10、11などの革新的な治療を可能にしているが、かなりのニーズが残っている 核酸デリバリーシステムの基本的な理解を改善し、遺伝子デリバリーナノ粒子の品質と性能を改善するためのさらなる革新のため。 具体的には、これらのペイロードをカプセル化し、保護し、病変細胞に送達するために使用されるナノ粒子賦形剤のさらなる革新が、分野を前進させるために必要です。 これらの賦形剤は、その革新的な性質により、大規模で低コストの商品スケールではほとんど利用できません。 したがって、発見空間の研究者に適した遺伝的ペイロードを含むナノ粒子の堅牢で再現性のある少量生産の分野では、満たされていないニーズがあります。 たとえば、in vitroスクリーニングでマイクロリットルのみが必要な場合、Tチューブ混合の最小容量は10 mL程度です。 このため、研究者たちは粗ピペット混合法を使用して、複雑な核酸ナノ粒子製剤のボトムアップナノ沈殿を実行しています。 ピペットとの混合はほとんど制御を提供しません、オペレーターです
図1.）ナノ粒子を製造するためのマイクロ流体混合技術：溶解した脂質を含む有機溶媒と核酸を含む水溶液
NanoAssemblrカートリッジの2つの注入口チャネルに注入されます。 層流の下では、2つの溶液はすぐには混合されません。
しかし、チャネルに組み込まれた微視的な機能により、2つの流体が混ざり合います。
分子が拡散によって互いに相互作用する、制御された再現可能な方法で。 1ミリ秒以内に2つの流体が完全に混合され、核酸がロードされたナノ粒子の均一な自己組織化をトリガーする溶媒極性の変化を引き起こします。
mRNA Lipid particles – Robust low-volume production for screening high-value nanoparticle materials – Precision NanoSystems Inc, Vancouver,BVC, Canada –
https://www.precisionnanosystems.com/docs/default-source/pni-files/app-notes/spark-mrna-appnote-1018.pdf?sfvrsn=50662346_0
編集履歴 2020/05/28 はりきり(Mr)
![[Bio-Lab] 実験の自動化 – 小型PLCでUF/DF工程を低コストで自動化する [2020/05/25]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2021/02/80F3D755-3019-49C6-BDAE-47D137C87826.jpeg)
バイオの実験でUF/DFは、結構面倒です。メーカーからは、大袈裟な装置が市販されています。もっとシンプルに簡単に低コストで、サンプルを調製することが可能です。
PLCとは、三菱電機は、「シーケンサー」と言っています。業界では、Programable Logic Controller (PLC)といいます。ラダー言語で、リレーのON/OFF、タイマーをプログラミングすることで、シーケンシャルな自動制御を行うことを担うコントローラーです。
シーケンス制御は、JISでも定義されています。至る所で密かに使用されています。AIではないので、学習はしません。
編集履歴
2020/05/25 はりきり(Mr) 図などは、また今度、追加します。
とにかくどんなところにも使用されています。
自作でクロマトグラフィー装置もUF/DFシステムも構築できます。
組み立ては、以下の通りシンプルです。
PCにソフトウェアをインストールして、プログラミングします。
以上で、濃縮段階での自動化は、完成しました。
上記の完了状態から、もう一台用意していた送液ポンプ(2)で、用意していたバッファーを、サンプルのビーカーに送液します。すると、液面が上がり、ファイバーセンサーが反応して、濃縮が開始されます。送液ポンプ(2)の流速をろ過流量より小さく設定しておくことで、バッファー交換の自動化運転が行われることになります。
以上が基本的ですが、安全装置も必要です。以下にシンプルにできるかも課題なので、以下のようなアイデアも有るので、ご参考にしてください。もちろん、フル構築も可能です。
以上
LFBは、血漿由来製品および組換えタンパク質の開発・製造・販売するバイオ製薬グループです。1994年にフランスで設立された、欧州屈指のバイオ製薬企業です1)
2018年に、ビジネスフォーカスをrecombinantを含めたものにチェンジしたsource。
ライセンス活動
1994年1月 GIP LFB（公益団体）の創設製薬会社
2006 GIP LFBはLFB SAの作成と大多数の国有有限会社となり、LFB BIOMEDICAMENTSとLFB BIOTECHNOLOGIES、フランスの子会社。
2007 LFB BIOMANUFACTURING（旧MABgène）をアレス（フランス）で買収。
2008オランダの血漿由来医薬品メーカーであるSANQUINとの産業協定の署名
2009年
2010年：
2013ドイツの子会社であるLFB GmbHの立ち上げ
2014年：
2015：
2016年
2017年：
2018 LFBグループの新しい戦略
2019 LFB戦略的変革：LFBコアビジネス、血漿または組換えタンパク質由来の医薬品に再び焦点を当てる
Biochemistry (Mosc). 2013 Dec;78(12):1371-3. doi: 10.1134/S0006297913120080.
YB2/0細胞を使ったADCC活性増強モノクローナル抗体の開発は、2012年にLFBからスピンオフしたTG Therapeuticsに譲渡している。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24460972
Olovnikova et al。（「免疫調節および細胞毒性特性を制御する方法としてのモノクローナル抗D抗体のN-グリコシル化プロファイルへの影響」（2012）Biochemistry（Moscow）、77、925-933）は、モノクローナル抗体上の「外来糖」の存在に言及しました（mAbs）YB2 / 0細胞株によって生成されます。この論文では、この細胞株で産生された2つの抗D mAb（LFB-R297およびLFB-R593、いわゆるRoledumab）のグリコシル化プロファイルに関する以前の知見を要約します。私たちの結果は、免疫原性グリコトープが存在しないことを示しており、さらに臨床試験中に免疫原性や他の深刻な副作用は観察されませんでした。
https://ci.nii.ac.jp/naid/500000552461/
YB2/0細胞を用いた研究について、どのよう内容が実施されているか見てましょう。
バイオ医薬品業界の一般的なヘルスケアへの貢献は急速に増加しており、1982年以来165を超える製品が世界的に承認されています。 バイオ医薬品の治療用途では、モノクローナル抗体（MAb）への関心が高まっています。 最近、20を超える治療用MAbおよび関連タンパク質が市場に投入されました。 この状況は、製薬経済に圧力をかけるため、両刃の剣です。 したがって、商品コスト（COGS）の最小化と抗体活性の最大化は、治療用MAbの開発における活発な研究分野です。 ラットハイブリドーマYB2 / 0細胞株を使用して特定のMAb産生率（SPR）のいくつかのエンハンサーをスクリーニングし、コエンザイムQ10（CoQ10）が有望なエンハンサー候補であることを発見しました。 CoQ10は呼吸鎖の強力な抗酸化物質としてよく知られており、ヘルスケアやその他のアプリケーションに使用されています。 CoQ10は水にほとんど溶けないため、ほとんどの研究は低濃度で制限されています。 いくつかの濃度でナノ粒子の分散液（Q-Media）を使用して培養液にCoQ10を添加し、流加培養を行いました。 Q-Mediaは累積生細胞密度に影響を与えませんでしたが、SPRを66％向上させました。 さらに、Q-MediaはMAbの結合または細胞毒性に影響を与えませんでした。 Q-Mediaはまた、CHOおよびNS0細胞株でSPRを30％増強しました。 一方、Q-Mediaは、培養上清中の酸化ストレスマーカー8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンの濃度を変化させませんでした。 さらに、Q-Mediaは乳酸生成とグルコース消費の比率をわずかに減少させ、CoQ10（232μM）は細胞内Ca2 +濃度を上昇させ、ATP（10μM）も上昇させました。 これらの観察は、CoQ10が細胞増殖の特性を変えずに、またはMAbの品質または生物学的活性に悪影響を与えることなくSPRを増強することにより、MAbの生産における強力な助けとして役立つことを示唆しています。 抗体依存性細胞傷害（ADCC）は、MAbに結合したオリゴ糖のフコース含量に依存します。 フコース含有量が低いMAbはADCC活性が高いため、MAbの脱フコシル化レベル（deFuc％）を制御し、deFuc％に影響を与える要因を分析することが重要です。 この研究では、deFuc％がYB2 / 0細胞株で産生されたMAbの培地浸透圧に反比例し、r2値が0.92と高いことがわかりました。 さらに、浸透圧の調節に使用される化合物の種類（NaCl、KCl、フコース、フルクトース、クレアチン、またはマンニトール）や培養スケール（1〜400 L）に関係なく、deFuc％は同じ相関を示しました。 灌流培養と流加培養の両方で一定の培地浸透圧を一定に維持することにより、MAb deFuc％を制御することに成功しました。 しかし、グルコースによる中浸透圧の調節は、YB2 / 0細胞培養における効果的なADCCに必要なdeFuc％を設計するのに十分です。 これらの観察と一致して、リアルタイムPCR分析により、解糖、GDPフコース供給、およびフコース転移に関与する遺伝子の転写の低下が明らかになりました。 この研究では、生産効率を向上させる両方の方法が、既存のプロセスの拡張として実現されています。 中浸透圧でdeFuc％を制御する現在の方法は、タンパク質に結合したオリゴ糖のフコース含有量が望ましくないほど高く、かつ/または制御できないために使用できなかった糖タンパク質の生産に、これらの哺乳動物細胞を使用する方法を開きます。 これらの発見により、細胞バンクの連鎖などの再始動なしで効力を低下させることなく、低用量で脱フコシル化IgG1を使用できるようになります。
LFB社の製品です。血友病Aおよび血友病Bでは、それぞれFVIIIおよびFIXが付属しています。血漿分画製剤のFVIII、FIXを補充治療しなければなりません。しかし、何れは、それぞれの製剤に対して抗体が生じてしまいます。これをインビビターと言います。インビビターが生じてしまうと、薬効が低下します。
今回のLFBの「SEVENFACT」は、それぞれの血友病の患者の血液凝固の経路として、アルターネイティブ(バイパス)なFVIIa(活性型第七因子)を使用するものです。
SEVENFACTは、LFBの最先端技術であるrPROで製造されてます。
副作用 : 頭痛、めまい
禁忌 : ウサギ由来タンパク質に他する過敏症、アレルギー
1)
LFB、新しい組み換え型血液凝固第VIIa因子をインヒビター保有血友病A／Bの成人／青年患者の治療薬としてSEVENFACT®をFDAが承認と発表 (2020/04/08) – Businesswire – より
https://www.businesswire.com/news/home/20200408005278/ja/
LFBが、血漿分画製剤ビジネスにおいて、どのような競争状況下にあるかの詳細が、以下の文献によりわかります。
この分野での世界的なシェア1位は、grifolsです。
以上
![[Bio-Edu] バイオ医薬品 (バイオロジクス)は、CHO細胞の技術革新と共に進展してきた [2020/08/05]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/04/7913F478-4409-40B3-B393-A2F40B52CF99.png)
バイオ医薬品は、英語でバイオロジクスと言います。バイオロジクスには、ヒトの体内に存在するタンパク性物質をターゲット(狭義)にしているため、よく知られている「抗体」以外のタンパク質も含まれます。
バイオロジクスは、当初、血漿分画製剤で知られているように血液から得られていましたが、技術革新により現在では、その目的物である医薬品は遺伝子組換えCHO細胞により得られるようになって久しく、正にバイオロジクスは、CHO細胞に関する技術革新とともに進展してきたと言えます。
以下、バイオロジクスについて、CHO細胞を使うアドバンテージをまとめました。ただし、CHO細胞が完全勝利ではありません。目的によっては、インスリン製剤など低分子量のタンパク質では、大腸菌が使用されています。
現在のバイオロジクス、特に抗体に関する遺伝子組み換え技術を使ったCHO細胞による生産性改善と取り組みは、以下の参考文献が概説として参考になります。
バイオ医薬品生産におけるプロダクションサイエンス (2013)
https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9109/9109_tokushu_3.pdf
産生株が高い生産能力があったとしても、その培養条件がマッチしていなければ高い生産性は達成できません。抗体医薬品の場合、投与される量が多いため培養生産性は課題の一つになります。
安定産生株の樹立と、その培養条件の開発の概説として、以下の文献が参考になります。
抗体医薬品生産培養技術の課題と展望 (2013)
https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9109/9109_tokushu_4.pdf
抗体医薬品について学ぶには、以下の項目を押さえておくことが重要です。「国立医薬品食品衛生研究所」のサイトに、「抗体」医薬品と「Fc融合タンパク質」について、まとめられたサイトがあります。
抗体医薬品について全体像を把握することができます。
抗体医薬品・Fc融合タンパク質
国立医薬品所品衛生研究所・生物薬品部
http://www.nihs.go.jp/dbcb/mabs.html
抗体の分子的特徴として「Fc」と呼ばれる領域があります．Fcには抗原に対する結合機能は無く別の機能を持っていますが，抗原結合能を持っていないことから，この領域に，例えばPEGなどを結合させて，抗体自体の血中半減期を延ばしたり，がん抑制化学物質を結合させて，がん治療薬として機能を増強させたりと，このFc領域は利用されます．
https://bio.nikkeibp.co.jp/atcl/mag/btomail/17/12/19/00339/
バイオシミラーの基礎知識について、厚生労働省取材のセミナー資料があります。最近の情報であるためバイオロジクスに関しても最新情報を得ることができます。
バイオ医薬品とバイオシミラーの基礎知識 – 厚生労働省主催講習会「バイオ医薬品とバイオシミラーを正しく理解していただくために」- 2020年1月11日 (大阪科学技術センター 大ホール
https://www.mhlw.go.jp/content/10800000/000496079.pdf
日本における規制当局からのガイダンスがあります。
抗体医薬品の品質評価のためのガイダンス (2012)
https://www.pmda.go.jp/files/000206143.pdf
バイオロジクスで使用される動物細胞は、CHO細胞が殆ど全てと述べましたが、用途によってはラッド由来の細胞の使用が試みられています。2020/6現在、日本で上市されているYB2/0由来抗体は、0、SP2/0は4つ、NS0は5つ、CHOは57つです。以下の課題は依然として残ります。
臨床段階で、YB2/0細胞由来の抗体医薬があります。YB2/0細胞は、フコース付加低減化が可能でADCC活性を高めることが可能な細胞株です。しかし、CHO細胞を代表する動物細胞の実績は、YB2/0細胞にはありません。YB2/0細胞は、2020/6現在、臨床試験が1社によって走っているのみです。新規参入企業には、ハードルは高いでしょう。
高い細胞傷害活性を有する抗体医薬品の YB2/0 細胞を用いた効率的な物質生産研究 2011
https://gair.media.gunma-u.ac.jp/dspace/bitstream/10087/6623/1/Ph.D%20E-428.pdf
研究用としては、以下のように種々の細胞株が使われます。Creative Labより
以上
2020/05/23 はりきり(Mr) 2020/06/09 文言整備 2020/06/20 追記 (細胞株、日本で市販される抗体医薬の細胞株の数) 2020/08/05 追記 (ヒト化抗体)
2022/10/23 文言整備: Fc領域の活用による機能付加について
![[Bio-Edu] Fcエフェクター活性 – ADCC活性を増強するafucosylation技術 [2020/05/22]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/05/5754D002-C57A-4FC9-8992-BA71D66B5952.jpeg)
ID15631
ADCC活性は、NK細胞などの免疫エフェクター細胞(immune effector cells)上に存在する抗体のFc領域に対するレセプターであるRcγRIIIaが関与しています。
IgG1のFc領域は、FcγRIIIaと結合親和性があり、その結合強度によってADCC活性が増強されます。この結合親和性の強さに影響するのが、Fc領域の糖鎖です。一般的にFc領域には、糖鎖結合部位がありますが、付加されている糖鎖として「フコース; fucose」含有量が少なければ、立体構造上から結合力が増加してADCC活性(エフェクター機能)が高まることが知られています。
fucoseは、Fc領域の糖鎖負荷領域のN型結合グリコシル(N-linked glycosylation)に付加されます。
抗体のFc領域を介した生体反応は、(1) IgG1のFc領域と補体系のC1分子と作用する古典経路の活性化を惹起します(CDC)。また、(2) IgG1のFc領域とFc受容体(FcγIIIa)を介して貪食細胞の動員による作作用経路の活性化(ADCC)を惹起します。
FcγIIIaは、Fc領域にあるヒンジ部とCH2ドメインと相互作用します。
この相互作用は、CH2ドメインのAsn297 (N297)に付加される糖鎖構造に左右されます。この糖付加をできなくするアミノ酸の変異により、FcγRIを除くFcγRs (FcγRII, FcγRIII)への結合親和性は完全に消失します。
ヒトにおける天然のIgGの付加糖鎖は非常に不均一です。そのfucosylation研究では、フコシル化(afucosylation)のレンジは、1.3%~19.3%でした2)。CHO細胞から作られているモノクローナル抗体のフコシル化は、90%程度です。この差によるADCCやCDCに関わる活性の違いが生じています。
FcγIIIの遺伝子は、2つあり、FcγIIIa (細胞の膜貫通型;殆どのエフェクター*)細胞で発現 )とFcγIIIb (好中球でのみGPIアンカー型タンパク質として発現)です。その配列相同性は97%ですが、FcγIIIbのADCCはありませ。しかし、貪食に関する役割を持つ可能性があります。
編集履歴
2020/05/22 はりきり(Mr) 参考文献1)を基に解説
FcγIIIaの対立遺伝子*)には、Val(V158)とPhe (F158)が知られていますが、FcγIIIa-V158では、より高いIgG1結合親和性(10倍)を持っています。anti-epidermal growth factor receptor (EGFR)、anti-CD20で、その観察結果が出ています。
関連する抗体医薬 (ADCCによる癌細胞の破壊)
Fucose (6-deoxycholate-L-galactose)は、哺乳動物細胞におけるN及びO型グリカンの共通成分です。
Fucose付加反応を担う酵素は、ヒトでは13種類のフコシルトランスフェラーゼ : FUT (fucosyltransferase)が知られています。
FUTは、fucose residue (フコース残基)をGDPフコース (GDP-β-L-フコース: 細胞室内(cytoplasm)で合成、フコシル化反応の基質)からアクセプター基 (acceptor substrate)に転移します。
細胞室内のGDP-fucoseの合成には、de novo経路が大半を担い、salvage pathway (生体でのフコースの再利用)はその一部を担っています。
de novoは更に、GDP-mannoseからGDP-fucoseに変換する反応も担っています。
| FUT | 機能 |
| 1 | fucose residue →(転移)→ terminal galactose α1,2 linkageの形成 |
| 2 | 同上( same as above) |
| 3 | α1,3/α1,4 – fucosyltrasferase (Lewisa, Lewisb合成と関連構造に関わる)反応 |
| 4 – 7 | α1,3 – fucosyltransferase (ABHとLewis抗原の合成) |
| 8 | α1, 6 – fucosyltransferase (fucose – innermost(最も内側) N-acetylglucosamin on N-glycans) 肝臓以外の組織で広く発現しているが、肝細胞癌 (HCC)でアップレギュレーとされる |
| 9 – 11 | α1,3 – fucosyltransferase (ABHとLewis抗原の合成) |
| (POFUT1) | O-fucosyltransferase Ser/Thr残基にfucoseを直接付加 (ER内) |
| (POFUT2) | O-fucosyltransferase Ser/Thr残基にfucoseを直接付加 (ER内) |
Lewis抗原は、癌細胞が血管内皮 (vascular endothelium)へ接着する際に機能します(血行性移転)
Lewis関連の3糖または4糖 (ルイス抗原)は、炎症反応におけるリンパ球のホーミング中に白血球の接着に重要な役割を果たします。
CHO Lec13細胞は、内因性(endogenous)のGDP-mannose 4, 6 – dehydratase (GMD) 遺伝子を欠乏しています。GMDは、de novo GDP-2 fucose生合成3経路 (biosynthesis pathway)の最初のステップの触媒を担っています。
GMD遺伝子を欠乏しているにも関わらず、フラスコ培養で培養した結果、フコシル化抗体の比率は、50~70%になったという研究があります。
mRNAレベルでGMDが少なからず発現しており、別の発現パスウェイがあると考えられます。
GDP-keto-6-deoxymannose 3,5-epimerase/4 reductive (FX) – ノックアウト CHO細胞を用いて、完全にフコシル化を抑えたという研究もあります。
Fut8遺伝子の発現レベルが低いYB2/0細胞を使用した研究 (CHO細胞との比較, Arakawa er al.)
FUT8遺伝子の不活化(Yamane er al.)
siRNAを使用したCHO DG44細胞の培養
CHO細胞のGDP-fucose transporter (GFT)を除去
β-1, 4-mannosyl-glycoprotein 4-β-N-acetylglucosaminyltransferase (GnT-III)は、普通CHO細胞では発現されません。
以下の2つの過剰発現のCHO細胞株は、抗CD20抗体GA101の宿主株として成功しています。最高レベルの(1) bisecting、(2) afucosylated glycansを、IgGで実現しました
GnT-IIIは、以下を触媒します。
[GDP-fucose de novo(advice)経路]では、GDP-mannoseは、GKDMに変換される。
[バクテリア]では、GKDMはGDP-rhamnose形態に還元できます。GDP-rhamnoseは、細菌の一般的な細胞膜表面グリカンの1種です。
[CHO細胞]の細胞質内に、このRMDを異種発現することで、[GDP-Fucose de novo経路]がバイパスされるため、afucosylated IgGが作られます。最終産物であるGDP-rhamnoseは、GMDの阻害剤である可能性があります。
遺伝子改変ではないアプローチとして、Okeley et al.による阻害剤研究があります。
その作用機序は、以下のことが考えられます
植物細胞では、以下の糖鎖が欠落します。
植物細胞では、通常、N-glycanは、(1)以下の糖鎖が付加されますが、(2)大きな糖鎖(哺乳動物でも稀に見られる)が付加されることもあります。
植物由来の糖鎖の免疫原性を克服するには、以下戦略があります。
水草のLemna minorで作ったafucosylated anti-CD30 monolclonal antibody
Anti-HIV 2G12 from XylT/FucT – knockdown N.benthamiana
2018年現在で、3つのafucosylated mAbsが市場に、20以上が臨床試験にあります。
| name and company | Target andformat | comment |
| obinutuzumab/GA101/Gazyva Roche | CD20 Humanized IgG1 with low fucose content | Marketed first glycoengineered therapeutic anti-CD20, in 2013 by FDA 3 x Phase 1~3 |
| mogamulizumab/POTELIGEO/KM0761 Kyowa Hakko Kirin | CD chemokine receptor 4(CCR4) Humanized afucosylated IgG1 | Marketed in lymphoma first approved in 2013 in Japan for hematologic malignancies in 2014 for cutneous T-cell lymphoma (CTCL) in 2017, FDA granted itbreakthrough, FUT8-knockout CHO 10 x Phase1~3 |
| Benralizumab/MDEI-563/Fasenra AstraZeneca | IL-5Rα Humanized afucosylated IgG1 | Marketed in Asthma approved by FDA in 2017 for severe eosinophil asthma, FUT8-knockout CHO (Biowa Poteligent Technology), IL-5R 9 x Phase1~3 |
| Inebilizumab/MEDI-551 Medlmmune | CD19 Humanized afucosylated IgG1 | 10 x Phase1,2 and 3 (lymphoma,myeloma) |
| Ublituximab/TG1101/LFB-R603 TG Therapeutics Inc | CD20 Chimeric IgG1, low fucose content | 10 x Phase 1,2 and 3 in lymphoma, leukemia |
| TrasGEX/GT-MAB7.3-GEX/Glycooptimized Trastuzumab-GEX | HER2 Mumanized glyco-optimized (reduced fucosylated IgG1) | Solid Tumors in Phase 1 (completed) |
| SEA-CD40/Seattle Genetics | humanized afucosylated anti-CD40 IgG1 | Cancer and carcinomas in Phase 1 |
以上
The “less-is-more” in therapeutic antibodies: Afucosylated anti-cancer antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity, 2018
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6150623/
Glycosilation engineering of therapeutic IgG antibodies: challenges for the safety, functionality and efficacy
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5777974/#!po=7.60870
Improved in vitro and in vivo activity against CD303-expressing targets of the chimeric 122A2 antibody selected for specific glycosylation pattern, 2018
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5973763/
細胞性免疫・エフェクター細胞 – 日本ガン免疫学会
http://jaci.jp/patient/immune-cell/immune-cell-04/
対立遺伝子
https://mycode.jp/glossary/allele.html
2020/02/22, by Mr.Harikiri
![[用語] CDC ; Centers for Disease Control and Prevention; アメリカ疾病予防センター](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/09/0E1A8FDA-ABDA-4D42-811D-BE0041CBB6CB.jpeg)