免疫組織化学染色（IHC）の基礎：組織の中でタンパク質の局在を可視化する方法

はじめに

免疫組織化学染色、英語では Immunohistochemistry：IHC は、抗体を使って組織切片中の特定分子を検出し、その場所を顕微鏡で観察する方法です。

IHCの大きな特徴は、目的タンパク質が「あるかどうか」だけでなく、組織のどの細胞に、どの部位に、どの程度染色されているかを観察できる点です。

たとえば、がん組織で特定のマーカーが腫瘍細胞に発現しているか、免疫細胞がどこに集まっているか、タンパク質が細胞膜・細胞質・核のどこに局在しているかを調べることができます。

免疫組織化学染色（IHC）とは

IHCは、抗原抗体反応を利用して、組織切片中の目的抗原を可視化する技術です。

目的タンパク質を認識する一次抗体を組織切片に反応させ、その後、酵素や蛍光色素などを利用して検出します。病理標本では、酵素反応によって茶色などに発色させ、光学顕微鏡で観察する方法がよく使われます。

Thermo Fisher Scientificは、IHCを、解剖学的・免疫学的・生化学的技術を組み合わせ、標識抗体を用いて組織内の標的抗原をその場で可視化する方法として説明しています。

IHCで何がわかるのか

IHCでは、主に次のような情報を得ることができます。

Human Protein Atlasも、IHCは組織サンプル中のタンパク質などを可視化する顕微鏡ベースの技術であり、複雑な組織内で標的タンパク質の存在と局在を示せる点が強みであると説明しています。

IHCの基本原理

IHCの基本原理は、次のように整理できます。

1. 組織切片をスライドガラス上に準備する
2. 組織中の目的抗原に一次抗体を結合させる
3. 一次抗体を検出する二次抗体または検出試薬を反応させる
4. 酵素反応や蛍光によりシグナルを可視化する
5. 顕微鏡で染色部位を観察する

一般的な病理IHCでは、HRPなどの酵素を利用し、DABなどの発色基質を反応させます。目的抗原が存在する場所では発色沈着が起こり、顕微鏡下で茶色などのシグナルとして観察できます。

IHCと免疫蛍光染色（IF）の違い

IHCとIFはいずれも抗体を使って目的分子を可視化する方法ですが、検出方法が異なります。

臨床病理や組織診断では、光学顕微鏡で観察しやすい発色IHCが広く使われます。一方、複数タンパク質の共局在や細胞内局在を高感度に見たい場合には、IFが有用です。

IHCの代表的な検出方式

IHCには、直接法、間接法、ポリマー法など複数の検出方式があります。

現在の病理IHCでは、HRP標識ポリマー法のような検出システムがよく使われます。ビオチンを使わないポリマー法では、内因性ビオチンによる背景染色を避けやすい利点があります。

DAB発色とは

IHCでよく使われる発色基質の一つが DAB です。DABは、HRP、つまり西洋ワサビペルオキシダーゼの酵素反応により、不溶性の茶褐色沈着物を生じます。

この沈着物が、目的抗原の存在する場所に残るため、光学顕微鏡で「茶色に染まった場所」として観察できます。

一般的には、DAB発色後にヘマトキシリンで核を青紫色に染めることで、組織構造と陽性部位を同時に確認しやすくします。

IHCの基本的な流れ

パラフィン包埋組織切片を例にすると、IHCの一般的な流れは次のようになります。

AbcamのIHCガイドでは、固定、抗原賦活化、透過化、ブロッキングなどがIHCサンプル調製で重要な工程として説明されています。