![[Trip] 大阪においでの際は、水上バスはいかが – [2019/10/06] ID2621](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/10/8D60A211-603F-4772-8094-BDA1D27185E3.jpeg)
水上バス水上バス
大阪城周辺を走って、川に入るコース。
大阪の京阪電鉄・天満橋駅の川の駅、水上バスのツアーがあります。この辺りの道でよく見かけるこの水上バス。どこから発着するのか疑問でしたが、灯台下暗し、見つけました。
川の駅の1Fは、お寿司の大輝水産があります。よろしければどうぞ。
編集履歴
2019/10/06, Mr. Harikiri
ブログ
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![[Bio-Edu] ゲノム編集/CRISPR-Cas9 [2023/10/20]](data:image/png;base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAABLAAAANGAQMAAADXg+UGAAAAA1BMVEUAAACnej3aAAAAAXRSTlMAQObYZgAAAAFiS0dEAIgFHUgAAACRSURBVBgZ7cExAQAAAMIg+6deDB9gAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAABwEe5ZAAGMJbmmAAAAAElFTkSuQmCC)
[Bio-Edu] ゲノム編集/CRISPR-Cas9 [2023/10/20]
CRISPR
CRISPRは，clustered regularly interspaced short palindromic repeatの略号です．
- 1987,大腸菌で確認される
- 最近のDNAに存在する繰り返し配列
- 大腸菌におけるファージなどの遺伝子に対する免疫システム
- CRISPRに関連する酵素には，Cas9があり，DNA配列を切断する．
- Cas9の原理を利用してゲノム編集技術が開発されている．ゲノム編集とは，生物の遺伝子を改変できる技術である．
- これをCRISPR-Cas9と総称する
- CRISPR-Cas9は，遺伝子の欠損にも，遺伝子の抑制・破壊にも使用できる．
- 2020年に，技術についてノーベルショーが与えられた
京都大学より
CRISPRとは
http://www.tmd.ac.jp/grad/bac/CRISPR.html
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeatsの略で、近年原核生物でファージやプラスミドに対する獲得免疫機構として機能していることが判明したDNA領域のことを指します。
リピート配列とスペーサー配列CRISPR – wikipedia.j
CRISPR – Wikipedia用いる材料
- 人工ヌクレアーゼ
- シンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN)
- テールフクレアーゼ (TALEN)
CRISPR/Cas9 (核酸分解酵素): 核酸を切断する遺伝子編集法に使用される
切断した時に元どおりに修復する機能と稀にエラーする機能を応用する。
https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/crispr-cas.asp?entry_id=14354
用語
- 遺伝子多型: 致命的な影響を与えない範囲の遺伝子配列の違い。原意は、1塩基が置き換わる置換。塩基が失われる欠失、新たな塩基が入り込む挿入、などの変異がある。
- 1塩基変異 (Single Nucleotide Polymorphism: SNP)は、1000塩基ごとに1つの割合の頻度で起こる。
編集履歴
2019/10/06, Mr.Harikiri
2023/10/20, 追記(簡単なまとめ) -
![[食]「かに道楽」- フルコース、今もキダ太郎が作詞作曲のテーマが流れていた – ID18542 [2019/10/05]](data:image/png;base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAwAAAAJAAQAAAAAS1Tz7AAAAAnRSTlMAAHaTzTgAAABNSURBVHja7cExAQAAAMKg9U9tDQ+gAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAvgzaQAABGr81nAAAAABJRU5ErkJggg==)
[食]「かに道楽」- フルコース、今もキダ太郎が作詞作曲のテーマが流れていた – ID18542 [2019/10/05]
・・♪獲れ獲れぴちぴちカニ料理♪
かに道楽の本店は、大阪の南・道とん堀にありますが、今回紹介する「かに道楽」は、東大阪店です。10年くらい前までは、布施にありましたが、移転して現在の長田にあります。贅沢したいときは、いつもお世話になっています。
かに 
かに kani 
編集履歴
2019/10/05 Mr.HARIKIRI
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![[rAAV] rAAVのUSP/DSP – 製造方法 – emptyとfullの比重, 2015 – SM[2019/10/05]](data:image/png;base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAB4AAAAPgAQAAAAD7YlwiAAAAAnRSTlMAAHaTzTgAAAD/SURBVHja7cExAQAAAMKg9U9tDQ+gAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA4N8Apg0AAdbPunMAAAAASUVORK5CYII=)
[rAAV] rAAVのUSP/DSP – 製造方法 – emptyとfullの比重, 2015 – SM[2019/10/05]
rAAVの製造
2015年時点のrAAV製造(Upstream, Downstream)に関するReview文献をもとに解説します．
基本情報
目的の遺伝子をAAVに包含させて作ったAAVベクターが、遺伝子治療薬になります。ここで、目的の遺伝子がAAVの殻に含まれていれば良いのですが、何も含まれない空の粒子も確率的には作られてしまいます。空の粒子をEmptyと言います。一途方の粒子をFullと言います。
ウイルスを精製するには、従来から遠心、特に超遠心を使われてきました。精製目的のウイルスでも、中に何も入っていない殻と目的遺伝を含む粒子を分別精製するためにも、超遠心が使われます。手技も固まっており簡単なので、よく使われます。
粒子の比重
参考文献から、AAVの比重 (密度) の情報を抽出しました。
- Full : 1.40 g/cm3
- Empty ; 1.32 g/cm3
- 可溶性タンパク質 : 1.3 g/cm3
- 核酸 : 1.7 ~ 2.0 g/cm3 (24, 48)
参考文献
- Overview of current scalable methods for purification of viral vectors – PubMed (nih.gov)
- Qu G., Bahr-Davidson J., Prado J., Tai., Cataniag F., McDonnell J., Zhou J., Hauck B., Luna J., Sommer J.M., Smith P., Zhou S., Colosi P., High K.A., Perce G.F., Wright J.F.
Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography – PubMed (nih.gov). J. Viol. Methods. 2007; 140(1-2): 183-192. [PubMed]
パーツの分子量
rAAVの殻の部分は3種類のタンパク質でVP1, VP2およびVP3でできていますが、これらの総分子量は、600kDaです。そして、その空の中に収められるベクター遺伝子は、4.7kbpの長さで、その分子量は、170kDaです。前述の比重の差は、この分子量の差になります。
- rAAV capsid protein (VP1~VP3): over 600kDa
- rAAV vector (4.7kbp): over 170kDa
超遠心以外の精製方法
AAVは、負に荷電しています。したがって、陰イオン交換体 (AEX)に吸着性を示します。AEX resinとして、以下のものが使えそうです。ただし、最近の遺伝子治療薬としてAAVの精製方法に関する文献や特許を見ていると、その精製条件は、一般的な方法では、精製度をあげることは難しく、少し特異な条件を使用していることに目が惹かれます。例えば，pH10を超えるような条件で吸着させます。
- Poros HQレジンによるクロマト精製
- Poros PIレジンによるクロマト精製
- Source 15Q レジンによるクロマト精製
- Q-Sepharose レジンによるクロマト精製
- HiTrap Q レジンによるrAAV1,2,4,5,6 and 8の精製
文献
- Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties (2015)
- WO2010148143A1 – Improved methods for purification of recombinant aav vectors – Google Patents
- PEG-modulated column chromatography for purification of recombinant adeno-associated virus serotype 9 – PubMed (nih.gov)
超遠心分析
AAVサンプルを超遠心分析により、Emptyを含めた不純物を除くFullの純度分析が可能となります。
- 1波長、干渉
- サンプル量 : 260nmで0.2以上、1~2E12 vg/mL, 0.5mL以上
[ignore]
- 4サンプル ¥90万円
[/ignore]
- 2波長、干渉
- サンプル量 : 同要件で1mL
[ignore]
- 4サンプル ブラス40万円
[/ignore]
- 別途
- 宿主ウイルス
- AAV Vector Plasmid
- その他、情報
編集履歴
2019/10/15 Mr.Harikiri
2020/10/01 追記 (文言整備)
2020/11/10 超遠心分析
2024/08/12 文言整備，引用文献の整備 -
![[特許調査] – ネット検索で得られた特許文献はオリジナルですか? / やっぱり原典にあたらないとね! – ID2577 [2023/10/21]](data:image/png;base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAwAAAAIYAQMAAADgvRmPAAAAA1BMVEUAAACnej3aAAAAAXRSTlMAQObYZgAAAElJREFUeNrtwTEBAAAAwiD7p7bGDmAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACQcyxgAAYPQWc4AAAAASUVORK5CYII=)
[特許調査] – ネット検索で得られた特許文献はオリジナルですか? / やっぱり原典にあたらないとね! – ID2577 [2023/10/21]
あじめに
ネット検索で，特許を検索すればすぐに目当ての特許の内容を探すことはできます．例えば，Googleがまとめた特許などです．しかし，引っかかってきた特許文書は，オリジナルでなかったり，オリジナルの翻訳であったりして，図が無かったり，翻訳ミスなどがあったりするので注意が必要です．
例えば，特許検索するときは，知りたい技術があったとして，その主たる目的は技術内容が大きな目的であり，その権利関係については不随的なことも多いと思います．それでもネット検索して得られた特許の内容を根拠にすると誤解した理解をしてしまう可能性があります．是非，原文に当たるようにしましょう．
以下には，特許の原文の得るためのサイトをリストアップしましたが，先ずは，特許制度につい理解するために参考となるサイトへのリンクを張っておきました．
特許出願制度の概要についての解説
- 特許手続きに関するガイドラインと概要
- 特許出願の願書の作成方法や出願日の認定、補正や審査請求の手続きなど、特許出願に関する基本的な手続き．
- 実用新案登録出願や意匠登録出願、商標登録出願など、特許以外の産業財産権に関する出願の手続き．
- 出願書類等の閲覧や交付、証明や謄本の請求など、出願の補助的な手続き．
- 出願手続きに関するよくある質問と回答のQ&A．
PCT国際出願の流れ（フロー）
- PCT国際特許の権利発生までのフローが記載されている．
- PCT国際出願の提出：優先日から12ヶ月以内に、自国の特許庁に対して国際出願願書を提出する．この出願願書は、PCT加盟国であるすべての国に対して同時に出願したことと同じ効果を与える．
- 国際調査：PCT国際出願に対して、国際調査機関が発明の特許性に関する調査と見解を作成する．出願人は、出願から約4ヶ月後にその結果を受け取る．
- 国際公開：PCT国際出願は、優先日から18ヶ月後に公開されます。公開された出願書類は、WIPOのウェブサイトで閲覧できる．
- 補充国際調査：出願人が希望すれば、別の国際調査機関が補充的な調査を行うことができる．これは、国際調査機関がカバーしない文献や特許庁のデータベースを調査するため．
- 国際予備審査：出願人が希望すれば、国際予備審査機関が発明の特許性に関する予備的な審査を行うことができる．これは、各国で行われる特許付与のための審査ではなく、出願人が自分の発明の評価をするため．
- 国内移行手続：PCT手続の最終段階で、出願人は特許を取得したい国を選択し、その国の特許庁に対してPCT国際出願を移行させる手続きを行うこの手続きは、通常優先日から30ヶ月以内に行われる．移行先の各国では、その国の法令や手続に従ってPCT国際出願が処理される．
PTC国際特許の権利発生までのフロー
http://www.yakupat.jp/ip_information_pct_application_procedure.html米国特許商標局(USPTO)データベース
米国特許商標局(USPTO)が提供している無料デー タ ベ ー ス
Patent Fulltext Database (PatFT/AppFT)日本の特許検索サイト
日本の特許検索
J-Plat Pat国際特許検索サイト
このサイトでは，WOから始まる管理番号でる国際特許出願を検索できます．
国際特許検索サイト、使用方法は、このリンクを参照．
https://patentscope2.wipo.int/search/ja/search.jsf欧州特許庁(EPO)サイト
欧州特許庁(EPO)
ESPACENT編集履歴
2019/10/05, Mr.Harikiri
2020/10/01,文言整備
2023/10/21,追記(はじめに，特許出願制度の概要，PTC国際出願フローの概要) -
![[rAAV-Edu] rAAV9の精製方法 – 特許, 2017 – ID2566 [2023/10/23]](data:image/png;base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAABLAAAAJkAQAAAAApJeVhAAAAAnRSTlMAAHaTzTgAAABwSURBVHja7cExAQAAAMKg9U9tBn+gAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAADgM2kLAAHgdgaiAAAAAElFTkSuQmCC)
[rAAV-Edu] rAAV9の精製方法 – 特許, 2017 – ID2566 [2023/10/23]
概要
リコンビナントAAV(rAAV)の大規模精製方法に関する方法特許(Method Patent)です．
精製のためのスタート原材料は，rAAVを発現した細胞培養上清です．
精製ステップは，2段のクロマトグラフィーになっています．1段目には，高い塩濃度で吸着が可能な疎水クロマト，2段目には，低塩濃度で吸着が可能な陰イオンクロマトです．
以上のステップにより，目的遺伝子を包含していな不要なウイルス粒子を効率的に除去可能であるとしています．
rAAV9の精製条件
当該特許は、現時点では「国際調査報告公開」です。
特徴的なのは、pH10.2を採用していることです。タンパク質にとってpH8以上のアルカリ性は、タンパク質に良い条件ではありません。それと、システイン残基のSS結合が緩むのが、pH8から上のpHです。それをpH10.2を使っているのは、それでしか精製できないからでしょう。ある程度のタンパク質の劣化を許容しているということですが，劣化も精製度もコントロールできるのであれば，品質上問題ではありません．ただし，その結果が効力や副作用などに影響する場合は，投与の仕方を工夫する必要性が生じるでしょうか，それも臨床試験で確認していけばいよのです(Mr.Harikir, 2020/10/01)
- Buffer A: 20mM Bis-Tris propane (BTP), pH10.2
- washing: 10mM NaCl, 20mM BTP, pH10.2
- gradient: 10mM to 190mM NaCl
- correct rAAV9 by A260/A280 ratio monitoring
クレーム
- AAV9の分離方法．pH10.2条件下の陰イオン交換クロマトグラフィーに吸着し、塩濃度勾配で溶出させA260とA280でモニタリングし、A280/A280の比率でAAV9 full capsideを回収
- A260/A280比が1未満から1以上になる
- 溶出ピークにおける伝導度が20mMから190mN NaCl相当となる
- AAV9中間体は50nM(50mMばはないのか、typo? 各所み見られる) NaCl相当で溶出する
- 不純物が10%未満
- 純度は少なくとも95%
- many more
国際特許の権利発生までのフローは、このリンクを参照のこと。
国際特許検索は、このリンクを参照のこと。使用方法は、このリンクを参照．
特許庁 実務者向け説明資料は、このリンクを参照のこと．
文献
特許
WO 2017/160360 A9, SCALABLE PURIFICATION METHOD FOR AAV9
https://patents.google.com/patent/WO2017160360A9/en編集履歴
2019/10/15 Mr.HARIKIRI 2020/10/01 追記(pH10.2について) 2023/10/23 追記(pH10でウイルスの品質に影響はあるだろうが，開発段階では問題にせずに，先に進むのが良い) 2023/10/24 追記(概要)
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![[rAAV-Edu] rAAV9の精製方法 (ウイルスの一般的な精製方法を理解できる) – 特許,2018 – ID2559 [2023/10/23]](data:image/png;base64,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)
[rAAV-Edu] rAAV9の精製方法 (ウイルスの一般的な精製方法を理解できる) – 特許,2018 – ID2559 [2023/10/23]
rAAV9 vectorの精製方法
培養液のバッファ組成をTFF処理で調整、硫安(AmSo4)沈殿処理と第4級アンモニウム陰イオン交換クロマトグラフィー(HiPrep Q XL)によるFlow through mode、最後にSECによる精製でrAAV9を得る
rAAV9 vectorの調製方法
- Transfection by 3 plasmid (with PEI, FBS-free)
- 遺伝子治療用としてウイルス・ベクターを使用するはに，目的遺伝子，ウイルスの殻，それてHelper因子，など必要なコンポーネントとしてそれぞれの遺伝子をウイルス増殖用の細胞内に挿入させる．
- Post culture
- 遺伝子を挿入した生産用細胞を培養する．
- Harvest supernatant
- 培養上清からウイルスを取得する場合は，遠心上清を回収する．細胞内に存在するウイルスを取得する場合は，遠心の沈殿画分を回収する．
- TFF process
- バッファ組成を整えたり，ウイルス濃度を高めたり，更に，ろ過液に不純物を透過させて不純物除去したりする．
- 1/3 sut. concentration AmSO4 precipitation
- 疎水性を高くして不純物の沈殿化させる工程(塩析)
- centrifuge
- 33%飽和濃度の硫酸アンモニウム処理して遠心により沈殿化した不純物を沈殿へ分離し上清を回収する．
- 1/2 sut. concentration AmSO4 precipitation
- 更に，硫酸アンモニウムを添加して50%飽和濃度にすることで，更に分割沈殿化させる．
- 急な塩濃度の上昇は，共沈するのでそれを避けるために分割操作を行う．
- centrifuge
- 遠心して上清を回収する．
- Dilution to 7.3 mS/cm
- カラムクロマトで処理できる条件に整えるために，上清を水(でよい)で希釈して伝導度を下げる
- AEX
- HiPress Q XL 16/10 column chromatograph with flow through mode
- TFF process
- 30kDa : ウイルスの濃縮
- SEC column chromatography
- HiLoad 16/60 Superdex 200, MNH pH6.5, 300mM NaCl, 0.01% F-68
Highly Efficient Ultracentrifugation-free
https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/pdfExtended/S2329-0501(18)30111-6
Chromatographic Purification of Recombinant
AAV Serotype 9Improved methods for purification of recombinant aav vectors, EP2443233A1, 2009
https://patents.google.com/patent/EP2443233A1/en編集履歴
2019/10/15, Mr. Harikiri
2023/10/23, 追記(永木の精製ステップについて日本語でコメント追加) - Transfection by 3 plasmid (with PEI, FBS-free)
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[血液凝固因子] Fibrinogen – ID2549 [2023/10/23]
はじめに
Fibrinogen (フィブリノゲン)は，巨大分子であること，タンパク分解酵素に分解されやすいこと，などから遺伝子組換え技術による医薬品レベルの製造がコストを度外視しても難しいタンパク質である．
Fibrinogen
フィブリノゲンは、血液中にある血液凝固因子である。血液の凝固の最終段階に関与している．フィブリノゲンは血液中では溶けているが，出血時にトロンビンと言う酵素からある部位に切断を受ける事で巨大な部分分子同士が絡むことが可能となり、不溶性のFibrin (フィブリン)線維となり物理的に出血を止める．
検査
フィブリノゲンの検査は、血液凝固の異常や出血傾向を調べるために行われる．フィブリノゲンの正常値は、約150～400mg/dL．フィブリノゲンの値が高いと、血栓ができやすくなり、心筋梗塞や脳卒中などの動脈硬化性疾患のリスクが高まる．フィブリノゲンの値が低いと、出血が止まりにくくなり、貧血や出血性ショックなどの危険が高まる．
高値になる原因
- 炎症性疾患（感染症、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎など）
- 妊娠
- 喫煙
- 高コレステロール血症
- 糖尿病
- 肥満
- 避妊薬やホルモン補充療法の使用
低値になる原因
- 先天性低フィブリノゲン血症（遺伝的にフィブリノゲンが少ない状態）
- 後天性低フィブリノゲン血症（出血や消費性凝固障害（DIC）などでフィブリノゲンが減少する状態）
- 肝機能障害（肝臓でフィブリノゲンが合成されるため）
- フィブリノゲン製剤や抗凝固剤の使用
フィブリノゲン製剤
フィブリノゲン製剤とは、先天性低フィブリノゲン血症や産科危機的出血に伴う後天性低フィブリノゲン血症に対する治療薬．人の血液のプラズマ成分から精製されたフィブリノゲンを医薬品としたもの．点滴静注で投与される．
立体構造
下図に示すようにAα鎖，Bβ鎖およびγ鎖の3本のタンパク質が絡まった構造で真ん中にEドメインと呼ばれる球状部分と，両端にDドメインと呼ばれる小球状部分で，コイルドコイルという棒状部分で連結された構造を取っている．
Aα鎖とBβ鎖のN末端には、それぞれフィブリノペプチドAとフィブリノペプチドBという小さなペプチドが付いいる．これらのペプチドはトロンビンによって切断されると、フィブリノゲンはフィブリンに変化し、重合反応を起こす．
- Fibrinogen 3D structur : PDB
文献
Fibrinogen:
https://www.jstage.jst.go.jp/article/jat1973/23/9/23_9_505/_pdf/-char/ja低フィブリノゲン血症の患者数:
https://www.shouman.jp/disease/details/09_22_037/フィブリノゲン – QLIFE –
フィブリノゲンとは｜病気の検査法を調べる – 医療総合QLife3. 血液凝固因子の分子進化 – フィブリノーゲンとvon Willebrand因子を中心に – 2008, 決戦止血誌
日本血栓止血学会誌 第19巻 第2号 (jst.go.jp)編集履歴
2019/10/14, Mr.Harikiri
2023/10/23, 追記 -
[rAAV] rAAVの精製方法 – 澄明ろ過及び膜による – ID2532 [2019/11/05]
rAAVの精製方法
2016年の文献よりAAVの精製について解説する。また、Pall製品による精製についても解説する。
文献によれば、最終的には超遠心によりAAVベクターを濃縮精製するが、その超遠心では、CsCl濃度勾配を使用しない方法を提供する。遠心操作を多用したAAVベクター精製は、遠心機があれば簡単に行える。
- Transfection of HEK293, and post culture
- 20 Flasks of T-150, Three (3) Plasmid PEI
- (説明: フラスコでHEK293細胞を培養した後，ポリエイレンイミンでプラスミドを細胞内にトランスフェクションスル)
- Centrifugation
- 3,000 xg 10 min
- (説明: 遠心で細胞画分を回収する)
- (A) Lysis by Freeze-thaw, and (B) Nuclease, (C) sodium deoxycholate
- (A) 50mM Tris-HCl, 0.15M NaCl, 2mM MgCl2, pH8, Dry ice – ethanol ←→ 37℃ 交互に細胞破砕
- (B) Benzonase: 50 u/mL, RNase: 10U/mL, 37℃、30min
- (C) 0.5% sodium deoxycholate, 37℃, 30min
- (説明: 回収した細胞を凍結融解して破砕，Nucleaseで核酸を切断，Sodium deoxycholate処理する)
- Centrifugation
- 2,500 g x 10min/sup
- Pooling with cell culture supernatant
- (説明: 遠心して上清を回収する)
- PEG 8000, NaCl Treatment / ppt
- 8% PEG 8000, 0.5M NaCl by 40% PEG 8000, 2.5M NaCl
- Incubation 1h , RT
- (説明: 最終8% PEG, 0.5M NaClに調整し1時間室温で静置して沈殿化)
- Centrifugation 2,000 g x 30min
- Re-suspend with HEPES buffer
- (説明: 遠心して沈殿を回収しHEPES バッファで沈殿を懸濁および融解する)
- Chloroform Extraction / cfg-sup / Evaporate
- Add equal volume of chroroform
- Vortex going , 2min, RT
- cfg (370 g x 5min)/supernatnat
- Evaporate 30min, RT
- (説明: HEPESバッファで懸濁・融解した液に対して，クロロホルム添加により，(おそらく)水相にAAVを抽出する)
- PEG 8000, AmSO4 Treatment / AAV in sup
- 10% PEG 8000, 13.2% AmSO4 pH8.0 adjusted by stocked solution
- Incubation at RT
- (Impurity salt out ppt), HEPES buffer pH has to be kept at pH8.0, AAV stable is Alkaline that acid
- (説明: PEG8000と硫酸アンモニウムで不純物を沈殿化し，AAVを上清に回収する)
- Dialysis using 50kDa
- diluent: PBS or MEMEM media with 0.001% puluronic F68 for preventing the aggregation
- (説明: 分画分子量50kDaのUF膜を用いてPBSまたはMEMEMにバッファ置換する．プルロニックF68は凝集抑制に効果がある)
清澄ろ過
Pall製品による清朝濾過。
- PHD11 : cellulose based capsule
- PDP8 + Bio 10 : Bio 10のみではろ過量が少ないが、PDP8の組み合わせで良好にろ過が可能
AEX Membrane
Pall 製品とこれらを用いたPallとのCo-Developingがサービスとして可能です。
- Mustang Q membrane chromatography for enriched full capsids
- Labの超遠心の代替
- Mustang Membrane: 8000A pores vs polymer matrix:Packed 40-90μm beads 300-1000A pores
- AAV5 gradient Elution by Mustang Q XT Membrane in Acrodisc Capsule
- Step elution : Empty in 1st elution, full in 2nd elution
- Peak 1 : 10 mS/cm, 13E11
- Peak 2 : 14 mS/cm, 7E11
- TFF
- 100kDa for AAV, 300kDa for LV
- TMP : 0.5 ~ 0.8 bar
- Shear rate : <4,000 second-1 for hollow fibers; <4 L/min/m2 for cassettes.
- J=K*ln(Cbulk/Cconc)
文献
Inexpensive, serotype-independent protocol for native and bioengineered recombinant adeno-associated virus purification
http://www.jbmethods.org/jbm/article/download/102/90編集履歴
2019/10/04 Mr.Harikiri 2020/10/01 文言整備 2020/11/05 追記 (Pall膜製品による精製 Pall Webinarより) 2023/10/24 追記 (説明を追加)
- Transfection of HEK293, and post culture
![[Bio-Edu] ゲノム編集/CRISPR-Cas9 [2023/10/20]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/11/9D67DDF1-3236-4D82-A7F7-93246B82BFC3-1200x838.jpeg)
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