カテゴリー: BIOLOGICS

[Bio-Edu] ウイルスの等電点(pI) – 組換えAAVでは，empty/fullの違いでpIは異なる – 分離精製は工業化の課題である[2021/02/23]

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はじめに

遺伝子治療用のウイルス・ベクターとしてAAVを使用した場合、目的通りに目的の遺伝子をAAVの殻にパッケージングできるとは限りません。導入する遺伝子の大きさが大きい程、その導入効率は低下してくると考えられます。実際に、動物細胞または昆虫細胞に対して、遺伝子導入試薬を使って目的の遺伝子を導入させ(トランスフェクション)、AAVベクターを作る時、目的遺伝が含まれないAAVも多数産生されます。

AAVはヒトにとって病原性が無く最もよく使われるウイルス・ベクターですが、ウイルスの殻は別です．殻を構成するたんぱく質などの抗原性が問題になるため、極力、目的遺伝子を含まないAAVベクター(Empty)については精製で除去すべきです。

目的遺伝子を含むAAVベクター(Full)との分離には、AAVベクターとしての等電点(pI)の違いを利用することが多く、陰イオン交換体を使用したカラムクロマトグラフィが使用できます。

なぜ、FullとEmptyとで、電荷が異なるかについては明確にはわかっていませんが、遺伝子であるDNAのパッケージの有無に関わることから、DNAのマイナス電荷の有無に関わるものと考えられます。完全にパッケージされているなら、その電荷がウイルスの殻の外に影響するとは考えにくいのですが、完全に否定することはできません。パッケージされることでウイルスの殻を構成していカプシドタンパク質のアミノ酸レベルで、プラスチャージのアミノ酸が殻の内側に向くこともあり得ます。その結果、殻の表面の電荷が変化することもあるでしょう。

また、完全にハッケージされる場合と全くされないという二極化をイメージしてはいけません。物理現象は、連続的なので、そのような短絡的なイメージではなく、途中の状態も存在することも考えてみましょう。例えば、殻が、完全な閉鎖形になっていなくて、例えば、映画「スターウォーズ」の「デススター」のように、表面が欠けている場合です。その欠け方も範囲の小さいものから大きいものまであると考えるべきです。そうすると、一部の遺伝子DNAが殻の隙間から飛び出ているAAV粒子もあることは想像できます

以上、多様な粒子としてAAVベクターが産生されており、その中からFullのみを分離精製することが、医薬品を作り上げていく上で、downstream; 精製工程における工業化の課題となる訳です。一方、upstream; 生産工程における工業化の課題は、パッケージング効率と産生量が工業化の課題となります。

ウイルスの等電点(pI or IEP)

以下，文献によるとウイルスの表面電荷は，およそ酸性から中性域にあります(2.1~8.3)．平均値は，5.0±1.3です．ウイルス精製では，陰イオン交換体クロマトグラフィ(AEX)による吸着/溶出で可能です．等電点とは，環境pHに応じて電気的に中性となるpHを等電点(pI or IEP: isoelectric point)と言います．今回紹介する文献では，公開されているウイルスのIEPを再度検証しています．1938年以降に行われた104のウィルスのIEPのデータがまとめられています．

図1. タンパク質上のカルボキシル基とアミノ基の電荷の変化

環境のpHに応じて，カルボキシル基とアミノ基の電荷が変化する．

ウイルスの等電点の検証結果の詳細

表1. ウイルスのIEP

Host kingdom	Virus species	Strain	IEP(s)	Method	Purity	Reference
Animalia	Adeno‐associated virus – 4	Adeno‐associated virus – 4	2·6	IEF‐DA	High	Salo and Mayor (1978)
Animalia	Alastrim	Butler	3·4	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Cowpox	Brighton	4·3	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Cowpox	Brighton (egg)	4·3	EM‐LM	High	Douglas et al. (1966)
Animalia	Cowpox	Brighton (rabit)	4·3	EM‐LM	High	Douglas et al. (1966)
Animalia	Cowpox	Kampen	5·4	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Cowpox	Leuwarden	5·2	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Encephalomyocarditis virus	Mengovirus L	8·1 and 4·6	IEF‐PA	High	Chlumecka et al. (1973)
Animalia	Encephalomyocarditis virus	Mengovirus M	4·4 and 6·3	IEF‐PA	High	Chlumecka et al. (1973)
Animalia	Encephalomyocarditis virus	Mengovirus M	8·4 and 4·6	IEF‐PA	High	Chlumecka et al. (1977)
Animalia	Encephalomyocarditis virus	Mengovirus S	4·6 and 6·8	IEF‐PA	High	Chlumecka et al. (1973)
Animalia	Feline panleukopenia virus	Canine parvovirus	5·0	IEF‐A	?	Weichert et al. (1998)
Animalia	Hepatitis A virus	Hepatitis A virus	2·8	IEF‐DA	?	Nasser et al. (1992)
Animalia	Human adenovirus C	Human adenovirus 5	4·5	EM‐LS	?	Trilisky and Lenhoff (2007)
Animalia	Human enterovirus B	Human coxsackievirus B 5	4·75 and 6·75	IEF‐DA	Low	Butler et al. 1985
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1	5·6 and 5·1	IEF	?	Murray and Parks 1980
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1	4·0	IEF‐DA	Low	Butler et al. (1985)
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1 (4CH‐1)	5·5	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1 (R115)	6·2	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1 (V212)	6·4	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1 (V239)	5·3	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Human enterovirus B	Human echovirus 1 (V248)	5·0	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Human enterovirus C	Human coxsackievirus A 21	6·1 and 4·8	IEF	?	Murray and Parks (1980)
Animalia	Human rhinovirus A	Human rhinovirus 2	6·8	CIEF	Low	Schnabel et al. (1996)
Animalia	Human rhinovirus A	Human rhinovirus 2	6·4	IEF‐DA	Low	Korant et al. (1975)
Animalia	Influenza A virus	H1N1 (Leningrad)	4·5, 4·35, 4·25, 4·0*	EM‐LM	High	Molodkina et al. (1986)
Animalia	Influenza A virus	H3N1	6·5–6·8	IEF‐PA	Low	Brydak (1993)
Animalia	Influenza A virus	H3N2 (Leningrad)	5·0	EM‐LM	High	Molodkina et al. (1986)
Animalia	Influenza A virus	PR8	5·3	EM‐LM	Low	Miller et al. (1944)
Animalia	Influenza A virus	Influenza A virus	6·5–7·0	EDN‐FET	?	Patolsky et al. (2004)
Animalia	Mammalian orthoreovirus	Serotype 3 (Dearing)	3·8	EM‐LM	Low	Taylor and Bosmann (1981b)
Animalia	Mammalian orthoreovirus	Serotype 3 (Dearing)	3·9	IEF‐DA	Low	Floyd and Sharp (1978)
Animalia	Monkeypox	Chimpanzee Paris	6·2	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Monkeypox	Copenhague	6·5	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Monkeypox	Denmark	3·4	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Neuro‐Vaccinia	Levaditi	4·2	EM‐LM	High	Douglas et al. 1969
Animalia	Norwalk virus	Funabashi	5·9	CIEF	?	Goodridge et al. (2004)
Animalia	Norwalk virus	Hawaii virus	6·0	CIEF	?	Goodridge et al. (2004)
Animalia	Norwalk virus	Kashiwa	5·5	CIEF	?	Goodridge et al. (2004)
Animalia	Norwalk virus	Narita	5·5	CIEF	?	Goodridge et al. (2004)
Animalia	Norwalk virus	Norwalk virus	5·9	CIEF	?	Goodridge et al. (2004)
Animalia	Norwalk virus	Seto	6·0	CIEF	?	Goodridge et al. (2004)
Animalia	Papillomavirus	Papillomavirus	5·0	Aggregation	High	Beard and Wyckoff (1938)
Animalia	Poliovirus	PV‐1	7·4 and 4·0	IEF‐DA	?	Nasser et al. (1992)
Animalia	Poliovirus	PV‐1	6·9	IEF	?	Brioen et al. (1985)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 Brunender	7·4 and 3·8	IEF‐DA	?	La Colla et al. (1972)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 Brunhilde	7·1	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 Brunhilde	7·1 and 4·5	IEF‐DA	High	Mandel (1971)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 Chat	7·5 and 4·5	IEF‐PA	?	Ward (1978)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 LSc2ab	6·6	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 LSc2ab	6·6	?	?	Murray and Parks (1980)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 LSc2ab	6·75 and 4·1	IEF‐DA	Low	Butler et al. (1985)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 LSc2ab	6·75 and 4·5	IEF‐DA	Low	Butler et al. (1985)
Animalia	Poliovirus	PV‐1 Mahoney	8·3	IEF‐DA	Low	Floyd and Sharp (1978)
Animalia	Poliovirus	PV‐2 Sabin T2	6·5 and 4·5	IEF	?	Murray and Parks (1980)
Animalia	Rotavirus A	Simian rotavirus A/SA11	8·0	IEF‐DA	Low	Butler et al. (1985)
Animalia	Smallpox	Butler	5·7	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Smallpox	Djibouti	5·6	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Smallpox	Harvey	5·9	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Smallpox	Harvey	3·4	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Smallpox	Moloya	5·6	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Smallpox	Sidi Amock	5·9	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Smallpox	Teheran	5·6	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Smallpox	Vannes	5·6	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Vaccinia	Chaumier	5·0	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Vaccinia	Connaught	4·9	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Vaccinia	Lister	5·1	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Vaccinia	Lister	3·9	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Vaccinia	Lister (egg)	3·7	EM‐LM	High	Douglas et al. (1966)
Animalia	Vaccinia	Lister (rabit)	3·0	EM‐LM	High	Douglas et al. (1966)
Animalia	Vaccinia	Rabbitpox (Utrecht)	2·3	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Vaccinia	WR	4·8	EM‐LM	Low	Taylor and Bosmann (1981b)
Animalia	White cowpox	Brighton	2·8	EM‐LM	High	Douglas et al. (1969)
Animalia	Whitepocks	64.72.55	5·1	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Whitepocks	64.72.75	4·9	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Whitepocks	Chimp 9	4·8	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Whitepocks	MK7.73	5·3	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Whitepocks	RZ.10.71	5·1	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Animalia	Whitepocks	RZ.38.75	5·2	IEF‐DA	Low	Mouillot and Netter (1977)
Bacteria	Acholeplasma phage O1	Acholeplasma phage O1	4·0	?	?	Pawlitschek et al. (1962)
Bacteria	Actinomycetes phage MSP8	Actinomycetes phage MSP8	3·5	IEF‐A	High	Kolstad and Bradley (1966)
Bacteria	Bacillus phage φ29	Bacillus phage φ29	4·2	Moving boundary	Low	Rubio et al. (1974)
Bacteria	Enterobacteria phage BZ13	Enterobacteria phage GA	2·1, 2·3*	EM‐LS	High	Langlet et al. (2008b)
Bacteria	Enterobacteria phage F1	Enterobacteria phage SP	2·1, 2·6*	EM‐LS	High	Langlet et al. (2008b)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage f2	4·0	IEF‐DA	Low	Butler et al. (1985)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage MS2	3·9	IEF‐A	?	Zerda and Gerba (1984)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage MS2	3·5	EM‐LS	High	Penrod et al. (1995)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage MS2	3·1, 3·9*	EM‐LS	High	Langlet et al. (2008b)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage MS2	3·9	Moving boundary	High	Overby et al. (1966)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage MS2	3·9	IEF‐DA	?	Nasser et al. (1992)
Bacteria	Enterobacteria phage MS2	Enterobacteria phage MS2	2·2, 3·3, 3·5*	EM‐LS	Low	Yuan et al. (2008)
Bacteria	Enterobacteria phage PRD1	Enterobacteria phage PR722	3·8–4·2	Chromatofocusing	Low	Brorson et al. (2008)
Bacteria	Enterobacteria phage Qβ	Enterobacteria phage Qβ	2·7, 1·9*	EM‐LS	High	Langlet et al. (2008b)
Bacteria	Enterobacteria phage Qβ	Enterobacteria phage Qβ	5·3	Moving boundary	High	Overby et al. (1966)
Bacteria	Enterobacteria phage T4	Enterobacteria phage T2	4·2	Aggregation	?	Sharp et al. (1946)
Bacteria	Enterobacteria phage T4	Enterobacteria phage T4	2·0	EM‐LS	?	Aronino et al. (2009)
Bacteria	Enterobacteria phage T4	Enterobacteria phage T4	4·0–5·0	IEF‐PA	Low	Childs and Birnboim (1975)
Bacteria	Enterobacteria phage λ	CI47	3·8	EM‐LS	High	Penrod et al. (1995)
Bacteria	Enterobacteria phage μ2	Enterobacteria phage μ2	4·0	IEF‐PA	Low	Piffaretti and Pitton (1976)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Enterobacteria phage S13	7·0	?	High	Aach (1963)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Mutants	7·4	?	High	Aach (1963)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Wild type	6·6	?	High	Aach (1963)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Enterobacteria phage ϕX174	6·0–7·0	Chromatofocusing	Low	Brorson et al. (2008)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Enterobacteria phage ϕX174	2·6	EM‐LS	?	Aronino et al. (2009)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Enterobacteria phage ϕX174	6·6	CIEF	Low	Horkáet al. (2007)
Bacteria	Enterobacteria phage ϕX174	Enterobacteria phage ϕX174	6·6	Aggregation	High	Sinsheimer (1959)
Bacteria	PM 2	PM 2	7·3	IEF	?	Schaefer et al. (1974)
Bacteria	Pseudomonas phage PP7	Pseudomonas phage PP7	4·3–4·9	Chromatofocusing	Low	Brorson et al. (2008)
Plantae	Belladonna mottle virus	Belladonna mottle virus	6·3	IEF‐A	Low	Petrzik (1993)
Plantae	Cowpea chlorotic mottle virus	Cowpea chlorotic mottle virus	3·8	EM‐LS	High	Suci et al. (2005)
Plantae	Erysimum latent virus	Erysimum latent virus	4·7	IEF‐A	Low	Petrzik (1993)
Plantae	Red clover necrotic mosaic virus	Serotype A	5·0	IEF‐A	Low	Gallo and Musil (1984)
Plantae	Red clover necrotic mosaic virus	Serotype B	4·8	IEF‐A	Low	Gallo and Musil (1984)
Plantae	Red clover necrotic mosaic virus	Serotype C	4·6	IEF‐A	Low	Gallo and Musil (1984)
Plantae	Scrophularia mottle virus	Anagyris	4·4	IEF‐A	Low	Honetslegrova et al. (1994)
Plantae	Scrophularia mottle virus	Czech isolate	3·9	IEF‐A	Low	Honetslegrova et al. (1994)
Plantae	Scrophularia mottle virus	Scrophularia mottle virus	4·0	IEF‐A	Low	Petrzik (1993)
Plantae	Southern bean mosaic virus	Variant 1	6·0	IEF‐DA	High	Magdoff‐Fairchild (1967)
Plantae	Southern bean mosaic virus	Variant 2	5·6	IEF‐DA	High	Magdoff‐Fairchild (1967)
Plantae	Southern bean mosaic virus	Variant 3	5·0	IEF‐DA	High	Magdoff‐Fairchild (1967)
Plantae	Southern bean mosaic virus	Variant 4	4·0	IEF‐DA	High	Magdoff‐Fairchild (1967)
Plantae	Tobacco mosaic virus	Cucumber virus 4	4·9	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Tobacco mosaic virus	Green aucuba	4·5	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Tobacco mosaic virus	Holmes’ masked	3·9	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Tobacco mosaic virus	Holmes’ rip‐gras	4·5	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Tobacco mosaic virus	J14D1	4·2	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Tobacco mosaic virus	Ordinary	3·9	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Tobacco mosaic virus	Yellow aucuba	4·6	Aggregation	Low	Oster (1951)
Plantae	Turnip yellow mosaic virus	Turnip yellow mosaic virus	3·6	IEF‐A	Low	Petrzik (1993)

Isoelectric points of viruses – B. MichenT. GrauleFirst published: 09 July 2010 https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2010.04663.xCitations: 63 –
https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1365-2672.2010.04663.x

AAV1~AAV10のpI計算

以下の文献には，表面構成タンパク質について個別にpIを算出されていますが，ウイルス粒子を構成する天然の状態でのpIは，表面に出ているアミノ酸の分布割合に依存します。そのため、正確なpIが算出されているとは考えにくと考えられます．やはり，実際にAEXなどのクロマト法などで検定されている結果の方が信頼できると思われます．

しかし，組換えAAVでは，以下の「AAV8, AAV9のpI」で示したようにEmpty/Fullの違いでpIが異なることが知られています．すなわち，GOIの配列によってもpIは異なると考えられます．単純計算ではいかないようですね．

Calculated pI values for AAV1 to AAV12.
https://www.researchgate.net/figure/Calculated-pI-values-for-AAV1-to-AAV12-The-histogram-of-the-pI-values-for-the-AAV_fig1_235682725

AAV8, AAV9のpI

AAV8とAAV9のpIを分析カラムメーカーSCIEX社が報告しています．

AAV8 : 約pI9
AAV9 : pI7.1~7.6

Determination of Full, Partial and Empty Capsid Ratios

for Adeno-Associated Virus (AAV) Analysis

Tingting Li, Tie Gao, Hongxu Chen, Zuzana Demianova, Fang Wang, Mukesh Malik, Jane Luo,

Handy Yowanto, Sahana Mollah

SCIEX, Brea, CA
https://sciex.com/Documents/tech%20notes/2019/AAV-Full-Partial-Empty.pdf

AAV tree

参考まで，AAV系統樹について示しておきます．pIの関連があるかも知れません．今後調査するかもです．

Expanded Repertoire of AAV Vector Serotypes Mediate Unique Patterns of Transduction in Mouse Brain
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616320755

編集履歴

2020/11/04 Mr.Harikiri
2021/02/08 文言整備
2021/02/23 追記 (「はじめに」を追加し、工業化の課題について言及)

2020年11月4日

[Bio-Edu] Plasmid DNA (pDNA)のデザイン及び、その製造方法に関する調査 [2020/12/24]
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plasmid DNAの物性

2本鎖DNAを輪っか状にデザインした物をPlasmid DNA (pDNA)と言います。完全なpDNAでは、輪ゴムをよじった状態(super coil)となり輪っか状ではなくなります。そのことで、見かけ上の分子量は小さくなります。もしも、2本の内1本に切断箇所(ニック)が存在すると、super coilではなくなり、輪っか状になります。さらに、もう一方の鎖に切断箇所があると、輪っか状も崩れて、直鎖のDNAの形態になります。完全体であるsuper coilのpDNAは、以上の状態の変化による性質の違いを利用して精製されます。

ベクター・デザイン

既存のベクターをデザインするには、既存の知られた遺伝子部品を組み合わせることが基本です。リンクした以下のサイトは、標準のプラスミド・ベクターや、AAVベクター、レンチウイルス・ベクターなど、数十種類のベクターをバックボーンにして、好みのベクターをデザインすることができます。

ベクター・ビルダー
https://www.vectorbuilder.jp/design.html

plasmid DNAの抽出方法

plasmid DNA (pDNA)の製造で最もクリティカルな工程は、その抽出です。pDNAを生産する細胞にE.coliを用いた場合、E.coliのgenomeと目的のpDNAを効率よく分離抽出することが重要です。pDNAは、スーパーコイル(輪ゴムが更によじれている物をイメージするとわかりやすい)となっており、E.coliのgenomeとは物理的強度が異なることを利用して、アルカリ抽出やガラスピーズのミル抽出が一般的に行われます。
- pDNAには耐性があると言って、アルカリ抽出でもガラスビーズ・ミル抽出でも分解されない訳ではないため、pDNAを効率よく抽出するためには、その処理条件の最適化が必要となる
- pDNAは負電荷であるため、その精製は、AEXが基本となるが ¹²⁾、疎水クロマト(HIC)も適応できる。
- silica単体にも塩基性アミノ酸バッファで結合させることが可能である
- 工業的な生産では、沈殿化工程は、遠心機を使用するよりフィルター処理する方法が好まれる。フィルター工程の最適化も重要な検討項目である
生産フロー

ベーリンガー社が、CDMOとしてpDNAの効率的な製造方法を考案している。参考文献 3)、その主たる内容は、1~200L規模のcGMPに適用できるpDNAの製造において、高い効率で抽出できるアルカリ抽出およびビーズを用いた方法である。
1. Vectorのデザイン
  - copy数
  - plasmidサイズ　(不要な配列の除去)、可能な限り小さく
  - 耐性遺伝子から栄養要求遺伝子への変更
2. Cell Bankの作成
3. 拡大培養
4. 生産培養
5. ハーベスト
6. アルカリ溶解 (Alkaline Lysis)
  - pH12
    
    ガラスビーズ in Tubeによる破砕(マイルドに!)
    
    supercoiled plasmidは、機械的ストレスに弱い
  - 中和(上清にplasmid、沈殿にタンパク質やゲノムDNA)
7. ろ過システムによる濾過
  - 清澄システムにもガラスビースが充填されている
8. クロマトグラフィー
  - HIC
    
    Capturing step for pDNA
    
    binding and elution condition
    
    removing of endotoxin RNA, genome DNA
  - AEX
    
    binding for pDNA
    
    removing of entoxine
  - SEC
    
    recovery : 1mg/mL
9. UF/DF
  - concentration : 10mg/mL, but higher viscocity
10. Bulk Fill
plasmidの培養方法

参考文献 1)より。大腸菌を使って生産させるのが一般的です。工業的には生産性が高いためです。

Item pVGXI1, pVGXI2
Size 4.2kb, 4.6kb
bad case OD < 15, 0.6g plasmid/10L fermentor
optimization OD >40, 2.4 g ~ 3.0 g plasmid/10L fermentor
考慮事項 pVGXI2は、高いpoly A, 低いGC比率

その他の精製方法として、以下のフローも参考の一つとして示します。特記する点は、ろ過助剤により細胞を効率的に回収している点である。
1. 培養条件 : 詳細は参考文献1)を参照
2. 流下培養、生産性 0.24g/L
3. ハーベストには、ろ過膜、ろ過助剤(珪藻土+ミネラル;ベントナイト)を使用。
4. 抽出・溶解工程
5. pDNAの選択的沈殿化
6. 再溶解/ろ過
参考文献 1)

1) Large Scale Production and Scale Up of DNA Plasmid Vectors With Complex Gene Inserts (2014)

プラスミドベクターを大腸菌で大規模に生産するために、(1)細胞株の最適化と (2)配列の最適化を実施した。

プラスミドpVGXI1（4.2kb）は、最初は10L発酵スケールで増殖は不良（OD <15、プラスミド収量：0.6g / 10L）であった。細胞株の最適化により改善することができたOD> 40、プラスミド収量2.4g / 10L）。このプロセスは、100Lおよび400Lスケールまで効果的にスケールアップ可能であった。

プラスミド、pVGXI2（4.6kb）は、その配列の高いA残基の繰り返しと低いGC％で構成されていたが、 3つの異なる大腸菌細胞株で10Lスケールで検討した結果、各細胞株では、増殖は不良(OD <10）であり、プラスミドがほとんど生成されなかった（プラスミド収量：0.7g / 10L）。

配列の最適化を行うことにより、pVGXI2は、標準的な大腸菌株で高い増殖性（OD> 50）およびプラスミド収量（3g / 10L）を10Lスケールで確認できた。

さらに、プロセス最適化により、これらの2つのプラスミドは、発酵収率が4倍に改善し、スケールアップも達成できた。さらに、これらのプラスミドの精製により、臨床使用に適した高品質のDNA産物を得ることができた。
https://www.cell.com/molecular-therapy-family/molecular-therapy/fulltext/S1525-0016(16)35244-3

参考文献 2)

2) 医薬品グレードの大規模プラスミドDNA製造プロセス(2015)

プラスミドDNAの製薬用途には、直接的または間接的に、特定の品質基準が必要です。ヒトの「適正製造基準」（GMP）グレードへの直接遺伝子導入は必須ですが、ウイルスベクター（AAVなど）などのGMP生産では、使用するプラスミドDNAを必ずしもGMPで生産する必要はないとの記載があります。このような規制の側面に加えて、研究室規模（最大数ミリグラム）から工業規模（ミリグラムからグラム規模）へのプラスミドDNA生産プロセスの拡大がここで扱われる問題です。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24715291/

参考文献 3)

3) プラスミドDNAの工業生産 (2008)

ベーリンガーの新しいcGMP生産システムに関する。pDNAの抽出方法は、アルカリ抽出法とビーズミル抽出法の併用であると理解しました。本当のところ、詳細については不明なのでわかりません。

プラスミドDNAを製造する場合、適正製造基準は慎重なベクター設計から始まります（図1）。真核生物のプロモーター、遺伝子配列、およびポリA部位は主に治療効果に影響を与えますが、ベクターの残りの部分は製造にとって重要です。

ベクターバックボーンのすべての要素、機能、および特性は、プロセスの堅牢性と製品の品質に関して評価する必要があります。

ベーリンガーインゲルハイムオーストリアは、天然のColE1 / pUCoriに基づいた抗生物質を含まないプラスミド選択のためのホストベクターシステムを開発しました。

生産性は、2.4g/L

supercoiled plasmidについての記載あり。培養終了時には、90% supercoiled plasmidであるpDNA均一性を目標とする。
https://www.genengnews.com/magazine/86/industrial-manufacturing-of-plasmid-dna/

pDNAはスーバーコイル

参考文献 4)

4) Efficient Disruption of Escherichia coli for Plasmid DNA Recovery in a Bead Mill (2017)

概要 – 要約：ビーズミルによるpDNAの抽出に関する研究。総pDNA（pDNA（t））およびスーパーコイル状pDNA（pDNA（sc））について、抽出に関するモデルを開発を目的に、ミル頻度、セル濃度、およびビーズサイズの2つのレベル23要因を検討。

その結果は、応答曲面法によって分析した。

pDNA（t）の最適化抽出条件として、13.26 mg / g dcw（93.41％の回収率）、30 Hzのミル周波数、0.10〜0.25 mmのビーズサイズ、および20 g wcw / Lのセル濃度を決定。

pDNA（sc）の最適化抽出条件として、7.65 mg / g dcw（92.05％の回収率）、15 Hzのミル周波数、0.10〜0.25 mmのビーズサイズ、10 g wcw / Lのセル濃度を決定。

考察 – ビーズミルでの細胞破壊は、アルカリ処理と比較して、pDNA（t）およびpDNA（sc）の放出に効率的であることが証明された。
https://res.mdpi.com/d_attachment/applsci/applsci-08-00030/article_deploy/applsci-08-00030.pdf

アルカリ抽出

参考文献 5)

5) Hot-Alkaline DNA Extraction Method for Deep-Subseafloor Archaeal Communities (2014)

アルカリ処理と加熱を使用した新しいDNA抽出方法をの検討。 1 M NaOHで98°Cで20分間処理すると、さまざまな深さで収集された海底下の堆積物サンプル中の微生物細胞の98％以上が破壊されました。しかし、DNAの完全性試験では、このような強アルカリ性および熱処理により、DNA分子がPCRでは増幅できない短い断片に切断されることが示されました。

その後、アルカリ条件と温度条件を最適化して、DNAの断片化を最小限に抑え、高い細胞破壊効率を維持しました。最良の条件は、さまざまな深さからの海底下の堆積物サンプルで50〜80％の細胞破壊率を生み出し、完全な16S rRNA遺伝子（すなわち、約1,500 bp）の増幅に十分なDNAの完全性を保持しました。最適化された方法では、従来のキットベースのアプローチを使用した抽出と比較して、テストしたすべてのサンプルでより高いDNA濃度も得られました。リアルタイムPCRと細菌および古細菌の16SrRNA遺伝子のパイロシーケンスを使用した比較分子分析は、新しい方法が古細菌DNAとその多様性の増加をもたらしたことを示し、従来の方法よりも海底下の微生物群集のより良い分析範囲を提供することを示唆しています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3957647/

参考文献 6)

6) A continuous process to extract plasmid DNA based o Alkaline Lysis (2007)

ここで紹介するプロトコルは、アルカリ溶解プロトコルに基づくスケーラブルな連続プロセスでプラスミドDNAを抽出します。このプロセスでは、採取した細菌を2つの混合チャンバーに制御された速度で通過させて、溶解を行い、アルカリ度を制御します。得られた溶液は、一連のフィルターで汚染物質を除去し、エタノールで沈殿させます。このプロセスは、粗プラスミドを取得する前にすべての遠心分離ステップを置き換え、より多くの量の需要を満たすために簡単にスケールアップできます。この手順を使用して、プラスミドを抽出し、50分から90分で、4リットルの大腸菌培養物から精製することができます。プラスミドの収量は80〜90mg/L 培養です。

細胞の形質転換→細胞増殖→プラスミドの抽出と精製。最も一般的な抽出方法はアルカリ抽出。連続プロセスに適用するには、pDNAの大規模な調製のためのアルカリ溶解法のスケールアップです。細胞破壊の代替方法は沸騰溶解です。しかし、このアプローチでは、pDNA収量と純度に一貫性がなく、メソッドも複雑です。最近、熱溶解プロトコルに基づく連続プロセスの開発と最適化の成功を報告しましたが、溶解後も遠心分離ステップが必要でした。アルカリ溶解手順によるpDNAの大規模抽出は、特に次の理由により、問題があると認識されています。プロセスで使用される3つの溶液、それぞれ0.4M NaOH/C2コンテナ、2% SDS/C3コンテナ、3 M potassium acetate, 5 M acetic acid, and pH 4.8/C4コントなに地蔵しておく。Bacteria懸濁液(100 OD/TE buffer)とC2+C3のミックス液を混和してアルカリ溶解させ、その後、C3の溶液と混和することで、不純タンパク質とGenomeを沈殿化させる。濾液を回収し、70%EtOHで沈殿化させて濾過膜で沈殿を回収する。

Flow rate : 3cm/sec

遠心分離ステップを排除するために、0.2 μmの中空糸カートリッジを使用して細胞を回収。1）細胞溶解後の破片を除去し、プラスミドがエタノールで沈殿した後のRNA汚染を除去するための70μmナイロンフィルター。中空糸カートリッジはさまざまなサイズで製造できるため、適切なカートリッジを選択して、必要な最終容量を回収できます。発酵細菌。溶液IIIと混合した後、溶解したバクテリアを孔径が徐々に小さくなる4層のナイロンフィルター（375、186、122、70 μm）に通して、このサイズ範囲の破片やその他の不純物を除去します. 70μmのナイロンフィルターは、エタノール沈殿後のプラスミドとRNAの分離に最も効果的。

スペルミジン圧縮18、CTAB沈殿19、20、ゲルろ過12、磁気ビーズ精製21などのさまざまな後続の下流精製プロトコルに容易に採用できます。このプロセスは、従来のアルカリ溶解の問題を回避し、DNAワクチン接種、非ウイルスベクターベースの遺伝子治療、RNAi発現コンストラクトおよびその他の関連する臨床および研究アプリケーションのニーズを満たすプラスミドDNAの自動生成のためのプラットフォームを提供します。この連続システムは操作が簡単ですが、システムのセットアップと最適化には、接続、チューブサイズ、同期ポンプの調整を含む最初のステップが必要です。流速、混合セルのサイズ、および振とう頻度は、新しい実験条件に合わせて最適化する必要があります。発酵プロセスとバクテリアの収穫は、収穫されたバクテリアのアルカリ溶解から始まる以下の手順では説明されていません。発酵は参考文献に記載されているように実施する必要があります。 15、および細菌は、参考文献に記載されているように、このプロトコルで使用するために収穫する必要があります。 15、TEの代わりにソリューションIを使用
https://www.researchgate.net/publication/5576598_A_continuous_process_to_extract_plasmid_DNA_based_on_alkaline_lysis

プラスミド抽出の原理

参考文献 7)

7) いまさら聞けないプラスミド抽出法の原理 (2011) – 生物工学第89巻 –

アルカリ変性の進み具合は、分子量の大きな染色体と、plasmid DNA(pDNA, スーパーコイルになっているものは特に安定的)とでは異なる。アルカリ抽出の原理を知ることができる。

1. covalently closed circular : ccc (物理的に最も安定)
2. open circular : oc
3. liner : l

ブラスミドベクターによってコピー数が1桁も違う
1. pUC, pBluescript, pGEM, pTZ, pBR322, pACYC, pSC101
https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/8909/8909_yomoyama_1.pdf

プラスミド抽出の特許

参考文献 8)

8) US Patent for Plasmid DNA extraction process Patent – Justia Patents – プラスミドDNA抽出プロセス – FujifilmDiosynth Biotechnolgies UK Limited特許 (2010/07/29出願、US特許8889852)

フロースルー装置を用いて、95℃~120℃、10秒未満、5秒を超えて120℃超えないこと。pDNAは通常3kbp~4kbpの範囲。pH4~pH10,好ましくはpH7~9(0~100mM Tris-HCl)。カルシウムなどの細胞壁のカチオンを可溶化するEDATなどのキレート剤を含み得る。ボリオール(スクロースなど)によるpDNAの放出促進として、5%~10%を含み得る。界面活性剤X-100を1~10%を含み得る。カオトロープとして尿素を0.5~8M、好ましくは1~3M。細胞溶解剤リゾチームなどを必要としないが、必要に応じて使用し得る。
https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/8909/8909_yomoyama_1.pdf

What is DNA?

参考文献 9)

9) What is DNA? – QIAGEN –

ウイルス、細菌のgenomeの長さ(bp)と分子量。

pDNAのAEX、Silica-membraneおよびマグネットSilicaによる精製。
https://www.qiagen.com/jp/service-and-support/learning-hub/molecular-biology-methods/dna/

プラスミド抽出

参考文献 10)

10) Plasmid vs. Genomic DNA Extraction: The Difference (2014)

ゲノムDNA抽出 (gDNA)は、最大限の抽出方法で行います。まず、酵母、植物、細菌の場合、溶解には、原形質膜を機械的に破壊する前に、強くて硬い細胞壁を酵素的に破壊することが含まれます。細胞壁は通常、細胞壁ペプチドグリカンを加水分解するリゾチームとセリンプロテアーゼプロテイナーゼKで消化されます。特定のグラム陽性種の場合、リゾスタフィンは酵素消化をさらに促進します。細胞壁の組成が異なる外来種には、異なる酵素を使用する必要がある場合があります。

その後、機械的な細胞壁破壊は、gDNA抽出のためのより普遍的な溶解方法として、ビーズビートがあります。0.1mmのガラスビーズまたは0.15mmの細かいガーネットビーズを使用して、ミル装置で行います。丈夫な糸状菌（例えば、アスペルギルスおよびフザリウム属）の場合、細胞材料は液体窒素で急速冷凍され、乳棒と乳鉢で粉砕された後、適切な溶解バッファーを含む溶液中で急速にボルテックスされます。

精製は、シリカへの結合を促進するグアニジン塩を添加したフェノール-クロロホルムまたはスピンフィルター膜技術を使用して行うことができます。

大腸菌の染色体は、細胞当たり約0.005ピコグラムにのぼる、サイズはわずか4.5メガバイトです。単一の開始コロニーからの典型的な一晩培養物は、約1-2× ¹⁰⁹細胞/ mlを含みます。理論的には、これは、1mlの培養物が109個の細菌細胞あたり約5µgのgDNAを生成することを意味します。選択したアプリケーションに必要なDNAの量を計算するときは、これを考慮に入れてください。

プラスミドDNA(pDNA)はgDNAから分離しておく必要があるため、プラスミドDNAの抽出は少し注意が必要です。この分離はサイズに基づいており、適切な分離は適切な溶解方法の使用に依存します。

pDNA抽出の場合、細胞壁を酵素でかみ砕いたり、ガラスビーズで叩いたりするよりも、溶解をはるかに微妙にする必要があります。BirnboimとDolyは、1979年にアルカリ溶解によるプラスミドDNA抽出のための（事実上）普遍的な方法を発明しました。

溶解バッファーには水酸化ナトリウムとSDSが含まれており、プラスミドとgDNAを完全に変性させます（つまり、DNAを一本鎖に分離します）。過度の変性は不可逆的にプラスミドを変性させる可能性があるため、このステップを迅速に実行することが重要です。次に、サンプルを酢酸カリウム溶液で中和してプラスミドを再生します。これは、プラスミドとgDNAを分離するための鍵です。プラスミドは小さいため、簡単に再アニーリングしてdsDNAを形成できます。ただし、ゲノムDNAは長すぎて完全に再アニーリングできず、代わりに絡み合って相補鎖が分離されたままになる傾向があります。遠心分離中、gDNA（タンパク質に結合）はペレットを形成しますが、プラスミドDNAは可溶性のままです。このステップでは、gDNAが壊れやすいため、サンプルを激しくボルテックスしたり混合したりしないことが重要です。壊れたgDNAは、再アニーリングしてプラスミドと溶解するのに十分小さい場合があります。

pDNAの精製、次に、上清中のプラスミドDNAをエタノール沈殿するか、フェノール-クロロホルムまたはスピンフィルターを使用して精製します。スピンフィルターテクノロジーを使用している場合、中和バッファーにはグアニジン塩が含まれているため、ライセートはシリカに直接結合してさらに洗浄および溶出できます。得られたDNAは、ほとんどの下流の分子生物学アプリケーションにとって十分に純粋です。

トランスフェクションにプラスミドが必要な場合は、陰イオン交換精製が汚染エンドトキシンを除去するためのより良い選択です。より高速なシリカベースの精製セットアップを使用して、エンドトキシンの除去も可能です。高収量のプラスミドDNAを単離するには、対数増殖期後期または定常期初期の培養物を使用します。プラスミド維持のために適切な濃度の新鮮な単一コロニーと新鮮な選択抗生物質を使用して培養物を準備します。プラスミド抽出物にgDNAが混入する可能性があるため、細菌培養物を増殖させないことが重要です。
https://bitesizebio.com/1660/plasmid-v-genomic-dna-extractionthe-difference/

プラスミドのシリカゲルによる精製

参考文献 11)

11) DNA Adsorption to and Elution from Silica Surfaces: Influence of Amino Acid Buffers (2014)

正に帯電した（アルギニン（ARG）とヒスチジン（HIS））、負に帯電した（アスパラギン酸（ASP）とグルタミン酸（GLU））、極性中性（GLU）に分類されるアミノ酸を含む溶液からシリカへのDNA吸着への影響を測定しました。アスパラギン（ASN）、グルタミン（GLN）、セリン（SER））、および非極性疎水性（ロイシン（LEU）、プロリン（PRO）、およびグリシン（GLY））。さらに、DNA抽出の固相として2種類のシリカ粒子を選択しました。最初のタイプであるMagPrepシリカコーティング磁性粒子（Merck）は、核酸の固相抽出に一般的に使用されます。ただし、これらの粒子のシリカ表面は、核酸抽出用に最適化されている可能がある
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4097040/

プラスミド精製特許

参考文献 12)

12) プラスミド精製 JP2007500711A – 特許 –

多孔のポアサイズを持つ陰イオン交換レジンによる精製。大きいサイズのプラスミドは、外表面に結合、プラスミドより小さいサイズの負電荷物は、プラスミドがアクセスできないボア内に結合させる。

背景情報には、>80%飽和硫酸アンモニウムによりpDNAを可溶性、ゲノムDNAを不溶性に分離できる特許情報の記載がある(米国特許第６２１４５８６号（ＧｅｎｚｙｍｅＣｏｒｐ.)
https://patents.google.com/patent/JP2007525222A/ja

pDNAのCTAB精製

参考文献 13)

13) Milligram scale parallel purification of plasmid DNA using anion-exchange membrane capsules and
a multi-channel peristaltic pump (2007)

低濃度CTAB (0.1-4g/L) 沈殿法によるpDNAとRNA/Endotoxinの分離 : 2g/L or 10g/L CTAB/50mM NaCl溶液を添加し、Incubation20分, cfg(38,000xg 20min, 20℃)/pptを70% EtOHで洗浄し、0.6M NaCl, 25mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.4で氷冷下で溶解。
https://www.researchgate.net/profile/Stefan-Schmidt-27/publication/6232344_Milligram_scale_parallel_purification_of_plasmid_DNA_using_anion-exchange_membrane_capsules_and_a_multi-channel_peristaltic_pump/links/59de01f545851557bde325bd/Milligram-scale-parallel-purification-of-plasmid-DNA-using-anion-exchange-membrane-capsules-and-a-multi-channel-peristaltic-pump.pdf

pDNAのHIC精製

参考文献 14)

14) Purification of plasmid (pVaxLacZ) by hydrophobic interaction chromatography (2005)

2.5M AmSO4(硫酸アンモニウム)で沈殿化した後、HICでBindingさせ、1.5M AmSO4でElutionする。
https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-89132005000400014

参考文献 15)

Using a single hydrophobic-interaction chromatography to purify pharmaceutical-grade supercoiled plasmid DNA from other isoforms (2012)

1.　HICカラムにより抽出したpDNAを不純物であるタンパク質、RNA、エンドトキシンなどの宿主汚染物質から分離精製する

2. scpDNAとocpDNAを分離可能。

3. 3 M硫酸アンモニウムの存在下では、scpDNAはocpDNAよりも疎水性が高くなり、ocpDNAは最初にHICから溶出できることで、一部のocpDNAをscpDNAから除去可能

4. 効果的な免疫応答と感染性チャレンジからの保護を引き出すために高いスーパーコイルレベルが必要であることを示されている（Cupillard et al。、2005; Pillai et al。、2008）

5. 製品には細菌ゲノムDNA、RNA、タンパク質、エンドトキシンが含まれていない必要

6. 第二に、pDNA産物は高い均質性でなければなりません。つまり、ほとんどのプラスミドはスーパーコイルアイソフォーム

7. プラスミドの品質分析（アガロースゲル電気泳動、HPLCなど）は、最終pDNAが98±1.2％のスーパーコイル率と検出限外以下の不純物であった。

8. リポソームトランスフェクション実験は、ここで説明する精製pDNAがコントロールpDNAよりも高いトランスフェクション効率を持っていることを示しました。したがって、この研究で提示された方法は、医薬品グレードのpDNAを製造するための主な要件を満たしている。ラボ規模の準備から大規模な生産への移行は簡単です。

Figure 3. Plasmid purity analysis by HPLC. Plasmid purity was determined by anion-exchange HPLC on a MONO Q^TM 5/50 GL column. A linear gradient was performed at 0.5 mL/min by increasing the NaCl 0–1 M in 40 mM Tris/HCl, pH 8.0 for 10 CV at a flow rate of 0.5 mL/min. (A) plasmid sample purified by 2 M ammonium sulfate, (B) plasmid sample purified by 2.5 M ammonium sulfate, (C) plasmid sample purified by 3 M ammonium sulfate.
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.3109/13880209.2012.703678

参考文献 16)

Improved downstream process for the production of plasmid DNA for gene therapy (2005)

HICにより、OCは最初のピークに、RNAは後のピークに、スーパーコイルであるpDNAは、その間に溶出される。

Figure 4. Performance of the HIC step.

Top: Elution profile of the HIC step (pRZ-hMCP1, 4.9 kbp). Main fractions are indicated by dashed lines. Bottom: Analyti- cal HPLC chromatograms of the HIC fractions; a) the first HIC peak contains impurities and open circular (oc) pDNA; b) the second HIC peak contains mainly supercoiled (ccc) pDNA; c) residual RNA and further im- purities elute when conductivity is suddenly strongly decreased. More strongly bound material is washed out of the column dur- ing regeneration (peak at the end of the HIC chromatogram

分析は、AEC。
http://www.actabp.pl/pdf/3_2005/703.pdf

プラスミドバックボーン

参考文献 17)

プラスミドバックボーン – Plasmid backbones –

日本語訳:

https://translate.google.co.jp/translate?hl=ja&sl=en&u=https://parts.igem.org/Plasmid_backbones&prev=search&pto=aue
https://parts.igem.org/Plasmid_backbones

プラスミドバックボーン・キット

参考文献 18)

蛍光レポーターまたはカスタム配列をターゲット部位に挿入するために用いるドナープラスミド構築キットEdit-R HDR Plasmid Donor Kit – FUNAKOSHI –
https://www.funakoshi.co.jp/contents/63964

核酸デリバリー

参考文献 19)

遺伝子治療のための新規人工遺伝子デリバリーシステム : 多機能性エンベロープ型ナノ構造体の開発 (2007) – YAKUGAKU ZASSHI 127(10) 1685-1691 (2007) –
https://yakushi.pharm.or.jp/FULL_TEXT/127_10/pdf/1685.pdf

参考文献 20)

[GS02-1] 脾臓選択的遺伝子導入キャリアの開発とDNAワクチンへの応用 – 日本薬学会　第141年会

免疫細胞へ効率的に抗原遺伝子を送達し、発現させることが課題となる。脾臓は多くの免疫細胞が局在し、全身性免疫を司る臓器であり、DNAワクチンの有望な標的臓器と考えられる。我々が見出した LNPは、脾臓選択的な遺伝子発現を示し、脾臓内において抗原提示細胞に分布していた。
発表表紙はパスワード必要
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編集履歴
2020/10/22 Mr.HARIKIRI
2020/10/25 追記 (内容の充実化)
2020/11/19 追記 (ベクター・デザイン)
2020/12/24、追記　(pDNAの物性)
2021/01/05 誤字脱字訂正
2021/05/10 追記 (文献19,20)
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2020年10月22日
[用語] HEK293細胞 – その他派生種の概説 [2020/12/22]
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HEK293細胞

発音は、ヘックニキュサン。ATCCで管理されている。
- 1970年代初頭にオランダの生物学者Alex Van der Ebによって株化された細胞
- 同研究室のポスドクであったFrank Grahamが実施
- ヒト胚性腎臓細胞　(Human Embryonic Kidney cell)にアデノウイルス5（Ad5）DNAをトランスフェクション
- その実験が293回目であったことからこの名が付けられた
- 腎臓に多く存在する線維芽細胞、血管内皮細胞、上皮細胞に由来すると考えられが、厳密には神経細胞であったとの可能性が指摘されている
- 染色体数は、一般に64本であり、Y染色体はなく、X染色体は3本、17と22染色体は4本、など通常のdiploidではなくtriploid、特にhypotriploidである
- Ad5 ゲノム4.5kbaseが19番染色体に挿入されていることが判明している^wikipedia
- ダブリングタイム : 36時間
- ちなみに、ヒト由来の最初の株化細胞は、HeLa。
HEK293 – ATCC –
https://www.atcc.org/Products/All/CRL-1573.aspx

派生種

HEK293T
- 元細胞 : HEK293細胞
- タンパク質生産性を改善できるSV40由来のplasmid vectorを使える様にした
- HEK293細胞にSV40 Large T抗原を発現させるように、CMVのプロモーターを使用
HEK293H
- 元細胞 : HEK293
- 限界希釈クローニング・セレクションにより、接着性を高めた樹立株
- 製品
  - Serum-Free media (SFM)に馴化したGibco 293-H
HEK293E
- 元細胞 : HEK293
- プラスミド導入 : EBV (Epstein-Barr Virus)のnuclear antigen 1 (EBNA-1)
  - origin of plasmid replication (oriP)を含むVector使用
  - タンパク質の高発現
HEK293S
- 元細胞 : HEK293細胞
- 培地馴化 : 改変 (E-MEM)modified minimum Eagle’s medium
- 類似細胞に、HEK293S11
HEK293F
- 元細胞 : HEK293細胞
- 培地馴化 : 市販品
HEK293FT
- 元細胞 : HEK293T
- クローニング : 高増殖株
- 培地馴化 : 市販品
HEK293FTM
- 末尾のMは、HEK293FTに修飾を意味するM(modify)
- FRT含有プラスミド、TetR発現プラスミドの発現
- タンパク質の相互作用研究用に樹立
HEK293SG
- 元細胞 : HEK293S
- 変異誘導 : エチルメタンスルホン (EMS)
- リシン毒性耐性でセレクション
- 欠損遺伝子 : MGAT1 (N-acetylglucosaminyltransferase I 活性)の欠損により、Man5GlcNAc2 N-glycan修飾を優勢にデザイン (N-グリコシル化)
HEK293SGGD
- 元細胞 : HEK293SG
- GDの意味 : Glyco Delete
- プラスミド導入 : エンドグリコシダーゼ (fungus Trichoderma reesei由来遺伝子、entoTによるGolgi body標的)
- 糖蛋白質研究用に樹立
HEK293MSR
- 元細胞 : HEK293細胞
- 遺伝子改変 : human macrophage scavenger receptor (MSR)を発現
- 強い接着性
Doubling Time

いずれの派生種でも<26時間のポテンシャルはあると考えられるが、培地によってそのポテンシャルは左右される^参考3)。

参考

参考1)

HEK293細胞とHEK293T細胞の違い
https://research-supporters.com/2020/01/19/hek293/

参考2)

HEK293T細胞
https://ja.wikipedia.org/wiki/HEK293細胞

参考3)

SMM 293-TI Expression Medium (Serum free, with Glutamine, complete medium)
https://jp.sinobiological.com/other-products/cell-culture-medium-m293ti

参考4)

The Scattered Twelve Tribes of HEK293
https://biomedpharmajournal.org/vol11no2/the-scattered-twelve-tribes-of-hek293/

編集履歴
```
2020/09/30 Mr.HARIKIRI
2020/10/21 文言整備
2020/12/22 追記 (参考)
2021/01/20 追記 (ATCC)
2021/03/05 追記 (参考4)
```
2020年10月21日

[Bio-Edu] ワクチンの製造 – Pallのソリューション [2020/10/14]

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はじめに

誰しもがインフルエンザウイルスでのパンデミックを予想していました。しかし、誰も予想していなかった普通の風邪ウイルスのパンデミックが今回起きたのでした。パンデミックは実在したのです。

COVID-19によって、従来のワクチン開発手法が一変したと断言します。核酸ワクチンが多数開発され臨床試験が実施されました。関連する技術革新がなされ開発期間の短さも更に進みます。今後は、不利な点は許容しそして克服しながら、優位性を更に高めてパンデミックに対応していくことで、核酸ワクチンは更に技術革新が進み、主要な技術となっていくものと思われます。

種類	抗原	典型的なプロセス
核酸ワクチン	プラスミドDNA（pDNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）、組換えベクターワクチン	発酵、化学合成、細胞培養
組換えワクチン	組換えタンパク質、組換えウイルス	細胞培養
サブユニットワクチン	組換えタンパク質、多糖類とペプチド結合体	細胞培養（哺乳類/昆虫）、発酵（バクテリア/酵母）
細菌性トキソイドワクチン	トキソイドタンパク質	発酵
全細胞ワクチン	弱毒生ウイルス、弱毒生細菌	哺乳類細胞培養、微生物細胞培養
	不活化細菌、不活化ウイルス	微生物細胞培養、卵/哺乳類細胞培養

Vaccine Production
Securing process quality with flexible manufacturing solutions for all vaccine platforms – Pall –
https://www.pall.com/en/biotech/vaccine-production.html?_ga=2.53595304.1803705756.1602653437-1800534053.1602653437

LNPは、ろ過における性能低下を伴うためSterile filterの選択は重要な課題である。以下のPallのWebinarでは、マイクロエマルジョンとその溶液のSterile Filtrationについて解説されている。

https://vimeo.com/408772789

ワクチン製造

Pallのソリューション・リンクです。参考になります。

Automated Systems

Featured Product: Single-Use Batch Chromatography Systems link

Biocontainers

Featured Product: Allegro (TM) 3D Standard Systems link

Hardware

Featured Prouct: Allegro Plastic Totes link

Mixers

Featured Product: Allegro 50L High Performance Mixer for Single Use Operations link

Powder Transfer Bags

Featured Product: Pall PD2 Powder Handling Bags link

Services

Featured Product: Helium Integrity Test (HIT™️) Technology for Allegro™️ 2D Single-Use Systems link

Valves

Featured Product: ARTTeSYN – Pinch Valves link

Sterile connector

KLEENPAK PRESTO STERILE CONNECTOR link

取扱ビデオ link

mRNAのLNP化は、今回のCOVID-19ワクチンにも使われていました。Precision NanoSystemsの技術がそれです。

編集履歴
2020/10/14 はりきり(Mr)

2020年10月14日

[Bio-Edu] DNAとRNAの違い – レジメ – [2020/10/11]
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ID24191

DNAとRNAの違い

DNAはRNAの設計図になります。RNAは、タンパク質の設計図になります。
- DNAを設計図にして、RNAポリメラーゼという酵素により、RNAが作られる
3つの部品単位

「糖」と「核酸塩基」の単位を含めて「ヌクレオシド」といい、更に「リン酸」を含めて「ヌクレオチド」という。リン酸を介して直鎖を形成する。核酸塩基には、水素結合親和性がある相補的結合が可能な5種類の塩基がある。AとTまたはU、GとCがそれぞれ結合できる。これにより2本鎖になることができる。以下に詳細を示す。
- リン酸 : リン酸を介して糖が数珠繋ぎされてDNA, RNAの直鎖構造が形成される(ホスホジエステル結合)
- 糖 (2種類)
  - リボース : RNA用
  - デオキシリボース : DNA用
- 核酸塩基 (5種類)
  - アデニン(A)
  - チミン(T) : DNA専用
  - グアニン(G)
  - シトシン(C)
  - ラウシル(U) : RNA専用(Tの代わり)
ヌクレオチドとは　— 受験のミカタ —
https://juken-mikata.net/how-to/biology/nucleotide.html
```
編集履歴
2020/10/11 Mr.HARIKIRI
```
[用語] UNA; unlocked nucleic acid [health] [2023/10/14]

2023年10月14日 [用語] UNA; unlocked nucleic acid [health] [2023/10/14] へのコメントはまだありません

[用語] RNA, tRNA, rRNA, etc. [Biotech] [2022/09/03]

2022年9月3日 [用語] RNA, tRNA, rRNA, etc. [Biotech] [2022/09/03] はコメントを受け付けていません

[Bio-Edu] DNAとRNAの違い – レジメ – [2020/10/11]

2020年10月11日 [Bio-Edu] DNAとRNAの違い – レジメ – [2020/10/11] はコメントを受け付けていません

[用語] DNA; Deoxyribonucleic acid – Histoneを介した染色体の折り畳みまでを順を追って解説 [2020/09/23]

2020年8月22日 [用語] DNA; Deoxyribonucleic acid – Histoneを介した染色体の折り畳みまでを順を追って解説 [2020/09/23] はコメントを受け付けていません
2020年10月11日
[Bio-Equipment] DNA/RNA合成装置 – ID24202 [2020/10/11]

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DNA/RNA合成装置

製品(1)

DNA/RNA合成装置
NTS M シリーズ、NTS M Series / 日本テクノサービス社製

http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/kiki/genome/nts_m_series/index.htm

富士フィルム/和光純薬のサイト
http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/kiki/genome/nts_m_series/index.htm

関連記事


2020年10月11日
[Bio-Guideline] 遺伝子治療におけるガイドライン・リスト
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はじめに

以下は、遺伝子治療に関するガイドライン等のリスト情報を示していますが、個別の内容の確認まではできいません。

欧米で共通するガイドライン
- 遺伝子治療用製品の環境影響評価 (カルタヘナ第1種使用に相当)
FDA
- Determining the Need for and Content of Enviromental Sssessments for Gene Therapies, Vectored Vaccines, and Related Recombinant Viral or Microbial Products (2015)
EMA
- Scientific Requirements for the Enviromental Risk Assessment of Gene Therapy Medicinal Products (2006)
- 遺伝子治療用製品のFirst in Humanのまための非臨床試験
FDA
- Preclinical Assessment of Investigational Cellular and Gene Therapy Products (2013)
EMA
- Non-clinical studies required before first clinical use of gene therapy medicinal products (2008)
- 遺伝子治療用製品を投与した患者の長期フォローアップ
FDA
- Gene Therapy Clinical Trials – Observing Subjects for Delayed Adverse Events (2006)
EMA
- Follow-up of patients administered with gene therapy medicinal producrts (2009)
- 個別課題に関するガイドライン・リフレクションペーパー
FDA
- 蔵書を区政レトロウイルス試験(2006)
- 遺伝子/細胞治療薬の力価試験 (2011)
- 遺伝子治療役・細胞治療薬の早期臨床試験計画 (2015)
- ウイルスベクター、細菌ベクター及び腫瘍溶解性ウイルスの排出試験 (2015)
- 遺伝子治療用微生物ベクター(2015, Draft)
EMA
- LVベクターの開発と製造 (2005)
- AAVベクターの品質、非臨床及び臨床 (2010)
- 遺伝子改変細胞の品質、非臨床及び臨床(2012)
- 遺伝子治療役の開発途中の計画変更 (reflection paper) (2012)
- 挿入変異のリスク管理(reflection pager) (2013)
- ICH Gene Therapy Discussion Group
- 2016現在、中断しているがこれまでに議論された内容は以下の通り
- 生殖細胞へのベクターの組み込みリスク
- 腫瘍溶解性ウイルス(Oncolytic virus)
- 患者からのウイルス/ベクター排出
- ウイルス参照品作成(Adenovirus type5)
- 増殖生ウイルスの検出(RCAやRCR)
- 挿入変異とがん化
- 長期フォローアップ(FDA GL)
- レンチウイルスベクター(EMEA GL)
- フォースト・イン・ヒューマン
- 投与量の設定
FDAからの最新のガイダンス – ISPE –
https://www.ispe.gr.jp/ISPE/05_fda_issue/05_01.htm

EMEAからの最新Guideline – ISPE –
https://www.ispe.gr.jp/ISPE/05_fda_issue/05_08.htm

PMDAガイドライン – PMDA –
https://www.pmda.go.jp/int-activities/int-harmony/ich/0070.html
2020年10月8日
気になる企業 – Vaccibody – [2020/10/07]
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ID24078

Vaccibody

HomePage
- 新しい免疫療法の発見と開発に専念する臨床段階のバイオ医薬品会社
- 個別化癌新抗原ワクチンの急速に発展する分野のリーダーであり、Vaccibody技術を持つ
- 高いアンメットメディカルニーズを持つ癌を治療をターゲットとしている
- さらに、感染症に関する研究に注力
- 抗原提示細胞を標的とする標的DNAワクチンの開発
- デザインテクノロジーは、特定の免疫応答プロファイルを誘導するように調整する
- Vaccibodyワクチンプラットフォームは、がんや感染症などの医療ニーズが高い多くの疾患領域に対処する可能性を秘めている
- Rocheとネクタルセラピューティクスとコラボレーション
- 候補ワクチン
  - VB10.NEO: 個別化がん治療、Phase I/IIa
  - VB10.16: HPV16陽性の関連がん治療、Phase II
Vaccibody技術
- 患者活液の採取
- 腫瘍のDNA/RNAの特異的配列の特定
- NeoSELECT(TM) アルゴリズムによる最適抗原のデザインと遺伝子の合成(gene construct)
- クローニングとマスター・プラスミドの作成
- Personalized Cell Bankの作成とスモールスケール製造
- 遺伝子組み換え細菌培養にり原薬(plasmid)の製造
- 製剤化(plasmidと添加剤)
- VaccibodyをデザインしたPlasmidを筋肉細胞に注入することで、Vaccibodyタンパク質を、体内の細胞で発現させる
- 細胞から分泌されたVaccibodyには、ターゲティングユニットとしてMIP-1αがデザインされており、これがCD8 Killer T細胞応答を誘導するという特徴を持つ。
Vaccibodyは、ジェネンテックと世界規模の独占的ライセンスおよびコラボレーション契約($200m, $515m)を締結し、VB10.NEO、個別化された新抗原癌ワクチンを開発します, 2020/10/01
VACCIBODY ENTERS INTO WORLDWIDE LICENSE AND COLLABORATION AGREEMENT WITH GENENTECH, A MEMBER OF THE ROCHE GROUP, TO DEVELOP INDIVIDUALIZED NEOANTIGEN CANCER VACCINES
Vaccibody enters into worldwide, exclusive license and collaboration agreement with Genentech to develop VB10.NEO, individualized neoantigen cancer vaccines
https://www.vaccibody.com/vaccibody-enters-into-worldwide-license-and-collaboration-agreement-with-genentech-a-member-of-the-roche-group-to-develop-individualized-neoantigen-cancer-vaccines/
2020年10月7日
気になる企業 – Trans Chromosomics – 染色体工学ベンチャー [2020/10/04]
Post Views: 287

Trans Chromosomics
- HomePage
```
編集履歴
2020/09/27 Mr.Harikiri
```
2020年10月4日
気になる企業 – Coriolis Pharma – Virus Vector Formulation Development [2010/10/04]
Post Views: 243

Coriolis Pharma
- HomePage
- LinkedIn
- 2009年 Founding
- Employee : 100
- バイオロジクスのcGMP 分析、Formulationサービス
- 論文発表も多数している
- Webinar “nanoparticle impurities” source
```
編集履歴
2020/10/04 Mr.Harikiri
```
2020年10月4日

Item	pVGXI1, pVGXI2
Size	4.2kb, 4.6kb
bad case	OD < 15, 0.6g plasmid/10L fermentor
optimization	OD >40, 2.4 g ~ 3.0 g plasmid/10L fermentor
考慮事項	pVGXI2は、高いpoly A, 低いGC比率

カテゴリー: BIOLOGICS

はじめに

ウイルスの等電点(pI or IEP)

図1. タンパク質上のカルボキシル基とアミノ基の電荷の変化

ウイルスの等電点の検証結果の詳細

表1. ウイルスのIEP

AAV1~AAV10のpI計算

AAV8, AAV9のpI

AAV tree

編集履歴

plasmid DNAの物性

ベクター・デザイン

plasmid DNAの抽出方法

生産フロー

plasmidの培養方法

参考文献 1)

参考文献 2)

参考文献 3)

pDNAはスーバーコイル

参考文献 4)

アルカリ抽出

参考文献 5)

参考文献 6)

プラスミド抽出の原理

参考文献 7)

プラスミド抽出の特許

参考文献 8)

What is DNA?

参考文献 9)

プラスミド抽出

参考文献 10)

プラスミドのシリカゲルによる精製

参考文献 11)

プラスミド精製特許

参考文献 12)

pDNAのCTAB精製

参考文献 13)

pDNAのHIC精製

参考文献 14)

参考文献 15)

参考文献 16)

プラスミドバックボーン

参考文献 17)

プラスミドバックボーン・キット

参考文献 18)

核酸デリバリー

参考文献 19)

参考文献 20)

HEK293細胞

派生種

HEK293T

HEK293H

HEK293E

HEK293S

HEK293F

HEK293FT

HEK293FTM

HEK293SG

HEK293SGGD

HEK293MSR

Doubling Time

参考

参考1)

参考2)

参考3)

参考4)

編集履歴

はじめに

ワクチン製造

Automated Systems

Biocontainers

Hardware

Mixers

Powder Transfer Bags

Services

Valves

Sterile connector

DNAとRNAの違い

3つの部品単位

DNA/RNA合成装置