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[Bio-Process] 原薬の超低温保管 ID9640 [2020/02/02]
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原薬の保管

バイオロジクス精製原薬を長期保存するには、除菌ろ過フィルターでろ過、ガス透過性が低いHDPE製のプラスチックボトルに小分け分注(aliquot)し、長期保存も考慮して超低温冷凍庫にて凍結保管する。

ロジスティック戦略

従来のバイオロジクスとシンモダリティのAAV Vectorについて個別に解説する。
- 従来のバイオロジクス
- AAV Vector
従来のバイオロジクスのケース

従来のバイオロジクスである抗体医薬などでは、超低温冷凍庫による保管の期間として3年程度を設定される。

保管されている原薬は、その期間内で製剤化され製品化される。製品化された製剤は、病院での使用前保管を前提に、一般的に液状での保管となり、3年程度の期間の保証がされる。

AAV Vectorのケース (私案)

新モダリティのAAV Vectorに関しては、市販されている製品が一桁と少ないため、そのベストプラクティスのロジスティック戦略を実績を含め示すことは難しい。

ここでは、私が考えるロジスティック戦略について思案を示す。

前提
- 遺伝子治療は、即時的な治療が必要な疾患でない場合がほとんどであること
- 投与する薬剤の実行ボリュームは、従来のバイオロジクスと比較して少ないこと
- 患者数が少ないこと
- 1回に原薬製造で、数百人の治療に使用可能な原薬が取得可能であること
AAV Vectorのロジスティック戦略
- AAV Vectorの製造で得られる原薬と製剤はサイト移動がない一貫製造とする
- 原薬の保存期間は最長でも半年とすることで、開発期間の効率化を図る
- 製剤の保存期間を数十年、少なくとも10年を目標にデータを取得し、AAV Vectorの製造数を最大限抑える
その結果、達成できること
- 一回製造すれば、数十年少なくとも10年は、得られた原薬を廃棄することなく有効に治療へ供給できる
- 遺伝子治療は、その患者数が少なく必要な製品数は多くを必要としない。製造メーカーの損益分岐点を低くすることができる
GORE(R) STA-PURE(TM) Flexible Freeze Container
https://www.gore.com/products/gore-sta-pure-flexible-freeze-container

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2020年2月2日
[Bio-Process] Sterile Filtration – ID8462
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Bio-Equipment
- 精製ステップ毎のbioburden管理
- 原薬の除菌ろ過
- sarlorius sterile
- sarlorius sterile
- sarlorius sterile
Sartorius Stedium
Pioneering Sterile Filtration
2020年2月2日
[Bio-Process] UF/DF for buffer exchange – タンパク質溶液の緩衝液組成の変更 – ID8458 [2020/02/02]
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抗体

抗体の精製の場合、バッファ組成を調整しないで次工程に進むことも多い

rAAV

次工程のAffinityクロマトグラフィにロードするために緩衝液の組成を調整すると共に、溶液体積の縮小化を行う

rAAVは、分子量~1,000kDaと想定される。したがってTFF膜のサイズは、それ以下で良いが、製品ラインナップとしては、分子量カット100kDa若しくは300kDaがあるので、状況に合わせて使用する。

平膜のTFFではなく、フォローファイバーのTFFでは、分子量カットのラインナップは、平膜より多いため、合わせて使用を検討する。

最終工程の緩衝液置換では、以下の要件に合う組成に置換する
- 安定な最大濃度
- 安定なpH
- 安定な電気伝導度
- 安定になる最小限度の添加物
TFF Systemは、PallのAllegro System (3/8インチ)
Allegro, Pall
https://biotech.pall.jp/jp/ja/tangential-flow-filtration.html
```
編集履歴
2020/02/02 Mr.HARIKIRI
```
2020年2月2日
[Bio-Process] Virus Reduction Filtration – ウイルス除去膜 – ID8631 [2020/02/02]
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Bio-Process

Virus Reduction Filtration
- planova 20n
(ウイルス除去膜)

ウイルス除去をフィルターろ過で実現できることを最初に実用化したのは、AsahiKASEIです。

その先駆者として、現在もなおバイオCMOで使用されている。

ステップ

ウイルス除去膜工程は、殆どの場合、下流工程じ実施される。

抗体医薬の場合、通常実施される工程である。

rAAV

rAAV製造において、その必要性があるかは不明であるが、小さいrAAV(20nmφ)より大きないウイルスを除去する目的で、実施する意義はあると思われる。

運転

80L/m2

Planova™ 15N、20N、35N ウイルス除去フィルター
https://planova.ak-bio.com/jp/products_services/virus-removal/planova-n/

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[Bio-Equi] Viresolve – ウイルス除去フィルター – Merck Millipore [2020/09/19]

2020年9月19日

BIOLOGICS
[Bio-Process] Virus Reduction Filtration – ウイルス除去膜 – ID8631 [2020/02/02]

2020年2月2日
2020年2月2日
[Bio-Process] Affinity & Polishing chromatography – 抗体の精製 [2021/10/30]
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ID8453

Bio-Process-Chromatography

タンパク質精製の基本であるクロマトグラフィーには、以下のモードがある。

抗体の精製では、長い歴史があり精製プラットフォームが完成しているため、使用するカラムの種類とその順序は検討する必要は通常ない。それぞれのクロマトの条件についても、検討範囲はある程度狭く限定するとが可能である。
- Affinity chromatography
  抗体のどの部位に結合するかで、以下の3種類のタンパク質が知られている。フルレングスのIgGの場合は、Protein Aが使用される。Fc領域と親和性が高く結合する。
  Fc領域を持たないデザインの抗体ではProtein Aは使用できない。Fc領域ではない領域と結合するProtein GやProtein Lが使用できる。
  Protein A
  Protein G
  Protein L
- IEX (Ion Exchange Chromatography)
  抗体の精製には、一般的な精製用の担体を用いたクロマトです。Anionは、Endotoxinやウイルスなどの吸着除去の機能を期待して使用されます。Cationは、抗体の分解物や重合体の分離を期待して使用されます。
  Anion Exchange Chromatography
  Cation Exchange Chromatography
- HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography)
  HICは、疎水性の強弱で分離するクロマトに使用します。イオン交換クロマトで十分な精製ができない場合に使用を検討します。
  Phenyl
  Butyl
- HA (Hydroxyapatite)
  HAはマルチモーダルな特性があり、イオン交換クロマトで十分な精製ができない場合に使用を検討します。塩濃度、pH、リン酸濃度などの条件を詳細に設定することができれば、効果的な精製を可能にします。
Protein A Column chromatography

抗体を産生株した培養液は、清澄ろ過してから、Protein AカラムによるBinding/Elutionモードで抗体のアフィニティ精製を行う。

注意しなければならないこと
- 電気泳動では、抗体の染色バンドのみが確認できるので、精製度は高いと思われがちであるが注意が必要
- HCP、HCDは多量に含まれている。そのような理由から、精製とは呼びにくく、キャプチャリング(capturing)工程と呼ばれる
- 次工程として、少なくとも、ハイドロキシアパタイトやAEXを実施すべきである。
AAV (rAAV)の精製においても、抗体の精製プラットフォームに従うように、レジンの開発が勧められており、Affinity resinの市販品も既に存在する。
- Anti AAV antibody
  - Cytiva製
  - ThermoFisher製
- Mobius® FlexReady Solutions
- GE Healthcare
Mobius® FlexReady Solutions
https://www.merckmillipore.com/JP/ja/Mobius-Single-Use-Manufacturing/Mobius-FlexReady-Solutions/EcGb.qB.e04AAAFZUuNiYtcV,nav

Single-use for Downstream, GE Healthcare –
https://www.gelifesciences.com/en/us/solutions/bioprocessing/products-and-solutions/downstream-bioprocessing/single-use-for-downstream

編集履歴

2020/02/02, Mr. Harikiri
2021/10/30, 追記(レジンに期待する機能など)
2020年2月2日
[Bio-Process] UF/DF for chromatography – 溶液組成の置換と目的物の濃縮/膜の選定に関する考慮点 – [2021/01/05]
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ID8446

UF/DF工程

UF/DF工程は、Ultrafilterを用いたUltrafiltration/Diafiltration工程です。具体的には、目的物質の濃縮と緩衝液組成の置換です。UltrafilterすなわちUF膜は、分子量の差を利用して分子集団を分画することを目的としており、そのためには、目的のタンパク質の分子量に応じたサイズを選択できる。しかし、厳密には、分子量のみでUF膜を選択できることは稀れです。UF膜の素材の物理的特性と目的タンパク質や不純物などのタンパク質の物理特性に影響をうけるためです。その物理特性に影響できるのが緩衝液のpH, 伝導度などです。

UF/DF工程の組込み目的は、次工程の目的によって異なります。例えば、次の工程がクロマトグラフィーである場合は、ロードに適する組成に置換することが、UF/DF工程の処理目的となる。最終的なサンプル組成を目的としている場合は、組成の置換と目的タンパク質の濃度調整も処理目的となる。

UF/DF実施の考慮点
- 抗体では、30kDa~50kDaの分子量カットのものを使用する
- AAV Vectorの場合は、理論分子量が1,000kDaであるため、それより小さい500kDaで濃縮できるはずだが、メーカーや製品によるバラつきもあり、漏れる量に違いが生じる。できるだけ漏れを少なくするには、100kDaの膜サイズを使用する。また、バッファ組成によっては、「漏れ率」が変化するため、予備検討が必要である。以下に示したTMPやCross Flow Rateによっても、漏れ率は異なるため、条件設定には、十分に理解して検討を進める。
- TMPの設定
  - 膜システムの出と入の圧力差の設定
  - システムの配管口径に依存する
    高濃度のタンパク質では、極端に配管口径が小さい場合、TMPを標準に設定できたとしても、Cross Flow Rateが適切に設定できない場合がある
- Cross Flow Rateの設定
  - 膜付近で濃縮されたタンパク質を洗い流す効果を効率的に設定する必要がある
  - システムの配管口径に依存する
    高濃度のタンパク質では、システム口径は、出来る限り最大化を目指す
  - 膜面積当たりのポンプ流速 (L/m²)
- メーカーの違い
  - Pall
  - Merck Millipore
  - Cytiva
  - Nova
  - etc.
- 処理する目的物の組成の違い
  - pH
  - 伝導度 (塩濃度、塩の種類、etc)
- UF膜の材質の違い
  - PES
  - 再生セルロース
- 処理温度
  - 室温(18-24℃)
  - 15℃
  - 4℃
- 構造
  - 平膜
  - ホローファイバー
編集履歴
```
2020/02/02 Mr.Harikiri
2021/01/05 文言整備、追記(漏れ率、条件設定における考慮するポイントなど)
```
Pallの製品
日本ポール
https://www.pall.jp

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2020年2月2日

[Bio-Process] 清澄ろ過/Harvest – 必要な膜面積の求め方 – ID8347 [2020/06/25][update by 2025/03/23]

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Harvest (ハーベスト; 収穫)

ハーベスとは、細胞培養が終了して、次の工程であるクロマト工程にロードするために行う清澄化工程のことです。

昔は、フィルター性能が低くくフィルターによる成長ろ過は実用的ではなかったことから連続遠心機が使われていました．現在では、2,000L程度の培養スケールではフィルターろ過によるハーベストが主流になりました。培養スケールが小さくなってきたことも一因です。

処理目的の溶液に対して、ろ過に必要なフィルターの膜面積を求める方法には、3つあります。スモールスケールで実験を行い，その結果を基にして，実スケールの処理容量と処理時間を加味し，且つ，膜の運転圧以内で処理できる膜の総面積を求めます．

例えば:

0.1m²の膜面積で，1Lの培養液を1時間でろ過可能とのスモールスケールでデータが得られたとします．

4時間で処理完了したい場合の膜面積は，0.1 ÷ 4 = 0.025 m²/L/4h．
500 Lの培養液を処理する場の膜面積は，500 × 0.025 = 12.5 m²/500L/4h
以上の計算から，500 Lの培養液を4時間で処理するために必要な膜の総面積は，12.5 m²となります．

Vmax : 単位時間あたりの処理量で判断
Pmax : 膜の耐圧で判断
Tmax : 濁りの除去程度で判断

Method	Particle retention	measurement (X-Y dimension)	Constant	Endopoint
Pmax	Size Exclusion is primary method	Throughput – Pressure	Flow rate	Maximum Pressure
Tmax	Adsorption is general	Throughput – Tubidity	Flow rate	Filtrate Quality
Vmax	Size Exclusion is primary mechanism	Throughput – Flow rate	Pressure	Minimum Flow rate

Filter Sizing Methods
https://www.dcvmn.org/IMG/pdf/5.application_note-_filter_sizing_methods.pdf

Pall

日本ポール
https://www.pall.jp

抗体

スモールスケールでは、ろ過膜により実施される

rAAV

rAAVの精製の場合で、細胞を破砕する必要がある場合は、Extraction Processを実施した後、Harvest Processを実施する。

編集履歴

2020/06/25 Mrはりきり
2025/03/23 文言整備，計算例追記

2020年2月1日

[Bio-Process] バイオロジクスにおける本培養の概要/Production – [2021/10/30]
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-ID17487

Production Culture

抗体の場合、一般に2週間の本培養が実施される。ウイルスベクターの場合、培養スケールに応じた拡大培養期間と、その後の3日間程度のプラスミドトランスフェクションが実施される

重要なことは、生産量が最大になるように培養条件が設定されていることである。次に、培養の終了と判断できる条件も設定されており、産生されたプロダクトが分解などの劣化が無いように設定される。

抗体医薬の場合
- 抗体産生細胞のプロダクション培養
- 殆どの抗体の場合、CHO細胞が使用される
- 仕込み培地
- フィード培地
- エアー、酸素、窒素、二酸化炭素
- 微小金属 (Trace Metal)
- アミノ酸
- グロースホルモン
- 温度
- pH
- 攪拌
- 消泡剤
- Plutonic F-68 (細胞保護剤)
- プロダクション培養(本培養)の期間は最長でも15日
- 抗体産生量の測定(Protein Aカラム-HPLC)
rAAVの場合
- 原材料としてのプラスミド製造 (宿主細胞: E.coli)
- rAAV製造 (宿主細胞: 昆虫細胞、HEK細胞、CHO細胞などの培養
- 仕込み培地
- フィード培地
- 酸素
- 温度 (37℃)
- pH
- 攪拌
- 消泡剤
- プラスミドのトランスフェクション(24~72時間)
  - ポリエチレンイミン
  - カルシウム
- rAAV産生量の測定 (better : droplet digital PCR(ddPCR) > qPCR
カルタヘナ対応 (当局対応)

微生物 (E.coliなど)を使用する場合、カルタヘナ議定書に調印している国では(日本など)は、カルタヘナ法に関わる当局への申請が必要となる。

二種申請

申請には、以下の2つのタイミングがある
- Plasmid産生株E.coliバンクの製造開始前
- PlasmidのGMP製造開始前
Xcellarex, data sheet –
https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/pdf/xdr-datasheet.pdf

GILSP対応

具体的には作業する部屋の拡散防止措置に関する物理的・運用的な対応です。ヘパフィルター設置などの排気処理、不活化処理、など。

（参考）GILSPとは
GILSPとは、Good Industrial Large-Scale Practice（優良工業製造規範）の略で、1986年のOECD理事会勧告「組換えＤＮＡ技術の安全性の考察」に示された概念に基づいています(経済産業省より)。

GILSPリスト – 経済産業省 –
遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たっては、主務省令で執るべき拡散防止措置が定められている場合には当該拡散防止措置を執り（法第十二条）、そうでない場合は、あらかじめ主務大臣の確認を受けた拡散防止措置を執らなければならない（法第１３条第１項）旨定められています。
https://www.meti.go.jp/policy/mono_info_service/mono/bio/cartagena/detailed_info/gilsp-list.html

編集履歴
```
2020/02/01, Mr.HARIKIRI
2021/01/02,追記(GILSPについて)
```
2020年2月1日
[Bio-Process] 拡大培養/Subculture – ID9342 [2020/02/01]
Post Views: 541
拡大培養に使用する機器、装置

WAVE BIOREACTOR

Waveシリーズは、ロッキング方式で撹拌する培養装置です。細胞のセルバンクの融解からフラスコの拡大培養を開始して、プロダクション培養に入るまでの拡大培養に用いられる500L程度までの培養スケールが可能です。

Cytiva社のプロモーション・ビデオ

https://youtu.be/4MoWDUTa_XU

スモール・スケールから実製造業スケールまで

https://youtu.be/LiYT5b3CsLk

WAVE BIOREACTOR, GE
https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/1278.html
```
編集履歴
2020/02/01 Mr.Harikiri
```
2020年2月1日
[Bio-Process] 細胞の凍結融解から拡大培養の開始 – フラスコ培養/Inoculum – △ID9636 [2020/02/01]
Post Views: 588
Bio-Process-Inoculum
- 凍結保管セルバンクの融解とフラスコ培養
液体窒素から取り出し融解したCell bankを、スモールスケールのフラスコ培養により培養を開始するステージです。

フラスコ

Sci-Tech
回転方向、スピードとインターバルをプログラム制御
- WAVE BIOREACORによる拡大培養
フラスコ培養の次のスケールは、WAVE BIOREACTORで拡大培養を続けます。

[Bio-Equip] Flexsafe RM – Wave Bioreactor シングルユースバッグ – Sartorius – ID11421 ID11421

[Bio-Process] 拡大培養/Subculture – ID9342 [2020/02/01] ID9342
- Production Culture
その後、Production Cultureを2週間行われ、Harvest工程へ続きます。

[Bio-Process] バイオロジクスにおける本培養の概要/Production – [2021/10/30] ID17487
2020年2月1日

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原薬の保管

ロジスティック戦略

従来のバイオロジクスのケース

AAV Vectorのケース (私案)

前提

AAV Vectorのロジスティック戦略

その結果、達成できること

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抗体

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ステップ

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注意しなければならないこと

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UF/DF工程

UF/DF実施の考慮点

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Pall

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Production Culture

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GILSP対応

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拡大培養に使用する機器、装置

WAVE BIOREACTOR

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