免疫蛍光染色（IF）の基礎：細胞や組織の中でタンパク質の位置を可視化する方法

はじめに

目次

1. はじめに
2. 免疫蛍光染色とは
3. 免疫蛍光染色で何がわかるのか
4. 免疫蛍光染色の基本原理
5. 直接法と間接法
6. 直接法のイメージ
7. 間接法のイメージ
8. 基本的な実験手順
9. 固定とは
10. 透過化とは（2ページ）
11. ブロッキングとは（2ページ）
12. 核染色と多重染色（2ページ）
13. 免疫蛍光染色で重要なコントロール（2ページ）
14. よくあるトラブルと原因（2ページ）
15. ELISAやWBとの違い（2ページ）
16. 免疫蛍光染色の長所（2ページ）
17. 免疫蛍光染色の限界（2ページ）
18. まとめ（2ページ）
19. 参考文献・出典（3ページ）

免疫蛍光染色、英語では Immunofluorescence：IF は、抗体を使って細胞や組織中の特定分子を検出し、蛍光顕微鏡で観察する方法です。

ELISAやウェスタンブロッティング（WB）が「目的タンパク質がどれくらいあるか」を調べるのに向いている一方、免疫蛍光染色は、目的タンパク質が細胞のどこに存在するかを調べるのに適しています。

たとえば、あるタンパク質が核にあるのか、細胞質にあるのか、細胞膜に局在しているのか、あるいは刺激によって細胞内の位置が変わるのかを調べることができます。

免疫蛍光染色とは

免疫蛍光染色は、抗原抗体反応と蛍光色素を組み合わせた観察法です。

目的タンパク質を「抗原」として認識する抗体を使い、その抗体または二次抗体に蛍光色素を結合させます。蛍光色素は特定の波長の光で励起され、別の波長の光を放出します。その蛍光を顕微鏡で観察することで、目的タンパク質の位置を可視化します。

Thermo Fisher Scientificは、免疫蛍光を、抗体を用いて細胞や組織内の特定抗原を蛍光標識し、顕微鏡で可視化する方法として説明しています。

免疫蛍光染色で何がわかるのか

免疫蛍光染色では、主に次のような情報が得られます。

ただし、免疫蛍光染色は画像解析によって定量的に扱うこともできますが、条件設定や撮影条件の影響を受けやすいため、絶対定量よりも局在観察や相対比較に向いた方法と考えるのが基本です。

免疫蛍光染色の基本原理

免疫蛍光染色の流れは、次のように理解できます。

1. 細胞や組織を固定する
2. 必要に応じて細胞膜を透過化する
3. 非特異的結合を防ぐためにブロッキングする
4. 目的タンパク質に結合する一次抗体を反応させる
5. 蛍光標識された二次抗体を反応させる
6. 核染色などを追加する
7. 蛍光顕微鏡で観察する

抗体が目的タンパク質に特異的に結合し、その位置に蛍光シグナルが現れます。Abcamの免疫蛍光染色解説でも、固定、ブロッキング、抗体反応、洗浄、蛍光標識抗体による検出という流れが示されています。

直接法と間接法

免疫蛍光染色には、大きく分けて直接法と間接法があります。

一般的な研究用途では、間接法がよく使われます。一次抗体に対して複数の二次抗体が結合できるため、蛍光シグナルが増幅されやすいからです。文献でも、直接法は迅速である一方、間接法は感度やシグナル増幅の点で広く用いられると説明されています。

直接法のイメージ

直接法では、目的タンパク質に結合する一次抗体に、あらかじめ蛍光色素が結合しています。

目的タンパク質 － 蛍光標識一次抗体

手順が少なく、二次抗体を使わないためシンプルです。一方で、使用したい一次抗体が蛍光標識済みでなければ使えないことや、シグナル増幅が少ないことが欠点です。

間接法のイメージ

間接法では、まず一次抗体が目的タンパク質に結合し、その一次抗体を蛍光標識二次抗体が認識します。

目的タンパク質 － 一次抗体 － 蛍光標識二次抗体

二次抗体を使うことで、同じ動物種由来の一次抗体に共通して使えるため、実験設計の柔軟性が高くなります。また、複数の二次抗体が一次抗体に結合することで、蛍光シグナルが強くなりやすいという利点があります。

基本的な実験手順

培養細胞を対象にした免疫蛍光染色を例にすると、基本的な流れは次のようになります。

CSTやThermo Fisher Scientificのプロトコールでも、固定、透過化、ブロッキング、一次抗体、二次抗体、洗浄、封入、画像取得という流れが基本として示されています。

固定とは

固定は、細胞や組織の構造をできるだけ保ったまま、目的タンパク質の位置を保存する工程です。

よく使われる固定方法には、次のようなものがあります。

固定条件は、抗原性と形態保持のバランスが重要です。固定が強すぎると抗体が抗原に結合しにくくなり、固定が弱すぎると構造が崩れたり、目的タンパク質が失われたりする可能性があります。

CSTは、多くの抗体では4%ホルムアルデヒド固定が使われる一方で、標的や抗体ごとに適した条件確認が必要であると説明しています。