[Bio-Edu] CHO細胞培養プロセス – スケールアップ – 温度シフトの検討は欠かせない [2020/10/30]

Bioreactorのスケールアップ

Sartoriusのバイオリアクター製品は、スケールアップを容易にするためにH/D比を合わせている。

• Bioreactorの高さ vs 直径 (H/D)の類似性は、パラメータを類似させる
• 攪拌における電力入力 (W/m³)

ambrを使用したスケールアップ・パラメータの設定

ambr15は、sartoriusのミニチュア・バイオリアクターです。スケールアップでの実験計画法 (Design of Experiments; DoE)による検討によく使われています。

• 15mLのミニチュアバイオリアクターであるため、複数の検討を同時に実施することが可能であり、DoEの実施に向いている
• DO、pHの測定、その他のKPIの測定(サードパーティ製の統合化可能モジュールで自動測定)も自動で測定可能
• ambrソフトウェア
  • データの自動集積
  • SIMC多変量解析(MVDA)
  • 重要プロセスパラメータ(CPP)の特定
  • 最適化範囲とロバストネスな範囲の特定

検討内容

15mLから2,000Lのバイオリアクターにおいて、Sartoriusが開発したscale-convert toolが、培養スケールの違いがあっても、同等な培養が可能で同等な品質のmAbを得られるかの検証内容。

• 細胞株
  • ヒトIgG1 mAb (Cellca CHO DG44 (Sartorius)
  • 工業的に使用(イギリス、アメリカ)されているホストセル
• ambr15と250mLから2,000L SUBへのスケーリング
• KPIとCQAへの影響を確認
• 攪拌の最適化
  • スケール変換ツール(by Sartorius)使用により15mLから2000LのSUBでの双方向なスケーラビリティを確保するアルゴリズム
  • 剪断力の最小化
  • 均一な細胞の混合
  • 電力入力(P/V)
  • 攪拌翼の速度
  • レイノルズ数(Re) : 攪拌速度を必要とする
• スケーラブルなガス処理戦略
  • k_La : DECHEMAガイドライン¹⁾に従い、ambr/UniVesselおよびBiostat STR Bioreactorにおいて決定されている
  • 特定のDO設定でのガス調整で81 L/hのスケーラブルなk_Laの算定
• スモールスケール・バイオリアクター
  • ambr15 (15mL) : 2L~7Lのベンチトップ・スケールを模倣
  • ambr250 (250mL) : スケールアップ開発に適する(H/D比)
    • 1000Lを模倣可能な結果が得られた
• ベンチトップ・バイオリアクター
  • UniVessel (5L)ガラス・バイオリアクター(Sartorius)
• 商業規模バイオリアタクー
  • BIOSTAT STR SUB (50L, 200Lおよび2,000L)
  • H/D比は同一 : 2/1
  • インペラーとbag直径の比は同一 : 0.38
  • bag : FlexSafe STR bag
    • Sartocheck 4 Plus : バッグのリークテスト
• スケーラビリティ研究デザイン
  • ambr15, ambr250, BIOSTAT STR 50L, 200L, 2,000L
  • 履歴データソース : Sartoriusの米国データ、インドのデータ、米国のデータ
  • 検討項目 : スケール全体で比較
    • パフォーマンス
    • KPI
    • mAb力価
    • CQA
  • 条件抽出
    • 播種前の条件
      • 生産用培地の温度平衡(~36.8℃/4時間)と供給時間(1日)
    • プロダクション段階
      • 播種直前
        • BioPAT ViaMassセンターのゼロ調整
      • 攪拌とガス処理関連パラメータk_La = 81/hを満たすパラメータ設定

• 続き(スケーラビリティ研究デザイン)
  • 続き(条件抽出)
    • 温度: 36.8℃
    • pH7.1
    • DO 60%
    • Re (>3,000)
    • Impeller 先端速度 : 0.6~1.25 m/s
    • 30~200 W/m³
  • 注(上記の表の説明)
    • 先端速度(Tip Speed)とReynolds Numberは、ambrの場合 < BIOSTAT STRの場合となります。そり理由は以下の通り
      • ambrのImpeller数は1枚
      • BIOSTAT STRのImpeller数は2枚はと比較して、低くなる
  • 培養は、Feedを使用した流加培養
  • 播種濃度 : 0.2e6 cells/mL (Seed stage), 0.3e6 cells/mL (Production Stage)
  • 種培養期間 : 3~4日間 (2.5e6 cells/mL)
  • プロダクション培養(9日間、流加培養)
    • Feed A
    • Feed B
    • 400 g/L Glucose to keep 3g/L for production
    • ambr15のFeedの方法 : workstation’s automated liquid-handling system
    • ambr25のFeedの方法 : syringe pumps built into the ambr workstation
    • 5Lベンチトップ/BIOSTAT STRのFeedの方法 : peristaltic pump
  • サンプリングと分析
    • 自動採取
    • ambr15/FlexSafe STRバッグ
      • 付属の光学シングルユースDO/pHセンサー
      • グルコース/乳酸 : BioProfile FLEX2自動細胞培養分析システム(Nova Biomedical)
      • 浸透圧 : Osmomat 030(Gonotec) or Cedex HiResアナライザー
    • ambr250
      • 光学式シングルユースDOセンサー、電気化学pHプローブ
      • グルコース/乳酸/浸透圧 : BioProfile FLEX2自動細胞培養分析システム(Nova Biomedical)
    • BIOSTAT/UniVesselバイオリアクタ
      • UniVesselバイオリアクターの電気化学センサー
      • グルコース/乳酸 : Radiometer ABL800基本システム(Radiometer,ドイツ)
      • VCC/細胞生存率/浸透圧 : BioPAT ViaMass or Cedex HiResアナライザー(Roche Diagnostics、ドイツ)
  • mAb生産性
    • 培養上清でmAb測定
    • N型グリカン・プロファイル分析(スコットランドのザルトリウすにある分析センター)
    • 最終的mAb力価は、12日目のサンプル(スコットランドのザルトリウすにある分析センター)
    • 補足分析 : LabChip GXII Touchタンパク質特性評価システム(Peerkin Elmer, Seer Green, UK)
• Reference standard
  • 30のデータセット(Commercial IgG achieved)
    • ambr250のデータセット
    • UniVessel
    • BIOSTAT STR
    • VCCs : >20e6 cells/mL, 80 cell viability at the day of harvest