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[rAAV-Production] – 治療用AAV Vector製造 – 考慮事項 – SM-ID12844 [2020/10/14]

執筆者:

harikiri

カテゴリ:

製造に関しての考慮事項

Transfection

以前は、以下のリン酸カルシウムが使用されたりしていたが、最近は、ポリエチレンイミン (PEI)を使用するが、よりグレードの高いPEIが開発されている。

  • コストを抑えるためにリン酸カルシウムを使用できるが、pHにセンシティブ(0.05の変動でも影響を受ける)であるため、HBSバッファの使用を推奨する

阻害要因

トランスフェクションの阻害要因には、以下のDNAセンサーに関わるものが考えられるsource: invivogen.com。

いずれも、多少なりとも細胞死に関わっている。

  • 細胞質の核酸センサー : dsDNAの感知
    • AIM2
      • AIM2は、パターン認識受容体 (その他にNLRP3)
      • dsDNAに強く反応、カスパーゼ1の活性化、炎症性サイトカイン誘導(IL-1β、IL-18)[1]
    • サイクリックGMP-AMPシンセターゼ(cGAS)
      • STING / TBK1 / IRF3シグナル伝達、１型IFN刺激因子(ISG)の発現誘導

Post Transfection Culture

プラスミドの濃度や比率、PEIの比率、加えて、培養条件によっては、発現効率は異なってくると考えられる。DoE手法による詳細な検討の実施が必要である。

  • 培地の血清の有無によって、発現量が異なる。Serotypeによっても異なる
  • トランスフぇクション後、72時間後まで引っ張れば、効率的であったとの報告もあるが、5日後で効率的であったとの報告もある(44)

44)
Lock M., Alvira M., et al.
Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum. Gene Ther. 2010;21(10):1259-1271. [PubMed]

Harvest & Clarification

目的rAAV以外の不純物は、ヒトへの投与では炎症の元となる

  • 細胞由来たんバク質
  • 細胞由来DNA
  • 血清タンパク質
  • 培地成分
  • ヘルパーDNA または、ヘルパーウイルス


References:

[1]. Patrick, K.L. et al. 2016. For Better or Worse: Cytosolic DNA Sensing during Intracellular Bacterial Infection Induces Potent Innate Immune Responses. J Mol Biol 428, 3372-3386.

発現タイターの検討

GFP コントロールウイルスでトランスフェクション効率条件を検討する。

Process Development

  • USP/DSP

[ignore]

(2.0千万円/50L/6m)

[/ignore]

2015年現在、AAVの精製の報告

  • rAAV1
    • Poros 50HQ→Poros 10HQ→Sephacryl S-300 HR (AEX/AEX/SEC)
    • Iodixanol→HiTrap (UC/AEX)
    • AVB sepharose HP (IAC)
    • CsCl→Mustan S→Mustang Q (UC/DIAM)
    • CHT→AEX→HIC/SEC (Apatite/AEX/HIC/SEC)
  • BAP rAAV1
    • Monomeric avidin agarose (IAC)
  • rAAV2
    • Poros 20PI (AEX)
    • Poros 50HQ→Poros 50HQ (AEX/AEX)
    • Poros 50hS→Poros 50HS (CEX/CEX)
    • Poros 50HS→Q-Sepharose xl (CEX/AEX)
    • SP Sepharose HP→HiTrap Q (CEX/AEX)
    • SP Sepharose HP→Source 15Q (CEX/AEX)
    • Poros 20 HE (HEAC)
    • Iodixanol→HiTrap Q (UC/AEX)
    • Iodixanol→Herain (UC/HEAC)
    • Sulfonated cellulose (AC)
    • Iodixanol Poros HE (HEAC)
    • Poros HE (HEAC)
    • Poros 20 HE→Poros 50 PI (HEAC/AEX)
    • CHT→DEA Macroprep→Cellufine sulfate (Apatite/AEX/AC)
    • Heparin (HEAC)
    • Heparin→Phenyl-Sepharose→Heparin (HEAC/HIC/HEAC)
    • AVB sepharose (IAC)
    • Mono Q HR→Superdex 200 (AEX/SEC)
  • His6rAAV2
    • Ni-NTA agarose (IMAC)
  • rAAV4
    • Poros PI→Poros HQ (AEX/AEX)
    • Poros HQ (AEX)
  • rAAV5
    • Mustang S→Mustang Q (DEAM
    • Mono Q HR→Superdex 200 (AEX/SEC)
    • Iodixanol→HiTrap Q (UC/AEX)
    • SP Sepharose HP→Source 15 Q (CEX/AEX)
    • Poros PI (AEX)
    • mucin coupled Sepharose (AC)
  • rAAV6
    • Poros 50HQ→Poros 50HQ (AEX/AEX)
  • rAAV8
    • SP Sepharose HP→Source 15Q (CEX/AEX)
    • CsCl→Mustang S→Mustang Q (UC/DIAM)
    • Sephacryl S-300 HR→Poros 50HQ (SEC/AEX)
    • Pep8-agarose→HiTrap ! (IAC/AEX)
  • His6rAAV8
    • Ni-NTA agarose (IMAC)
  • rAAV9
    • CHT→Poros 50HS→CsCl (Apatite/CEX/UC)

Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties. 2015, Curr Pharm Biotechnol. 2015 Aug; 16(8):684-695

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5388796/?report=classic

Analytical Development

  • USP DevelopmentやDSP Developmentと同様に、その品目に特異的な分析法の開発が必要

AAV Vector drug substance batch

  • non-GNP Batch
  • GMP Batch
  • Relase Test
  • Characterization ( if needed)
  • Stability Test

[ignore]

  • non GMP Batch (13.0千万円/3m)
  • GMP Batch (16.0千万円/3m)
  • Release Test (2.0千万円/3m)
  • Characterization (??)
  • Stability Test (2.0千万円/0,1,3,6,12,24,30,36)

[/ignore]

AAV Vector drug product Batch

  • non-GMP Batch
  • GMP Batch
  • Release Test
  • Stability Test

[ignore]

  • non-GMP Batch (0.4千万円/3m)
  • GMP Batch (0.6千万円/3m)
  • Release Test (2.0千万円/3m)
  • Stability Test (2.0千万円/0,1,3,6,12,24,30,36)

[/ignore]

編集履歴
2020/03/31 Mr.HARIKIRI
2020/10/14 追記(pDNAの精製、GMPグレード受託情報)

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