ウイルス・ベクターと宿主細胞の準備
- ベクターに適合した宿主細胞(master cell bank, working cell bank)
- ベクター
- construction
- generation
- premaster seed
- master seed
- working seed
- PCLとは
- Packaging or Producer Cell Line
- Three Plasmid Transfectionに代わる生産系である
- 目的遺伝子以外のAAVベタクー産生に必要な遺伝子を既に組み入れた生産細胞、または、目的遺伝子さえも組み入れた生産細胞
- Oxgene™️、Vigeneなどが持っている
目標のAAVベタクー発現量
15cm ディッシュ1枚から 1-2×1011 genome copies (GC)、または、1011-1012 GC/mL（各細胞あたり 2×104 – 1×105 ウイルス粒子）
Material
Plasmid DNA Batch
[ignore]
- non-GMP製造(14.0千万円/3 x Plasmid/200L/3m)
- GMP製造(16.0千万円/3xPlasmid/200L/3m)
- 分析(0.5千万円/3 x Plasmid/3m)
- カルタヘナ申請 (0.5千万円/3m)
[/ignore]
ITRに組換えが少ないプラスミドを得る。
プラスミドの品質: 形質転換後の ITRs による組換えは、プラスミドのサイズを減少させるので、これを抑制させる。Life Technologies社の Stbl3 コンピテントセルをプラスミドの増幅に用いる。
Plasmidの精製
- プラスミドDNAをE.coliに形質転換
- シングルコロニー
- 拡大培養
- アルカリSDS法による粗精製
- アルカリ-SDSは、大腸菌染色体ＤＮＡを細胞壁とともに除去するため、プラスミドDNAのみを得るのに信頼性の高い方法 (Lab向き)
- クロマト精製
- 脱塩
- 濃縮
- Sterile Filtration
- 分注
- 凍結保存(-30℃)
- 二種カルタヘナ法対応(GMP製造開始前)
pDNA培養特許
大腸菌中でプラスミドｄｎａを製造規模で生産するための流加発酵法及び培地 (特許, 2011), link
pDNA精製特許
プラスミド精製 (2007), link
Cytivaによる精製ストラテジー
ヒトおよび動物の遺伝子治療用プラスミドの精製プラスミドDNA (2007), link
アルカリSDS法レジメ
ラボでの調製のレジメを以下に示した。
- 大腸菌の培養
- 遠心/E.coli
- 添加・懸濁(25mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 50mM Glucose), 100μL
- 穏やかに添加・撹拌(0.2M NaOH, 1% SDS), 200μL
- Incubation 4℃ for 5min
- 添加・懸濁 (7.5M 酢酸アンモニウム、pH7.6、氷冷)、150μL
- Incubation 4℃ for 5min
- 遠心(15,000rpm x 10min)/sup回収
- Sup/(100+200+150=450μL)
- 添加・懸濁(イソプロパノール), 270μL
- Incubation R/T for 10min
- 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
- 添加・懸濁(2M酢酸アンモニウム、pH7.6)、50μL
- Incubation 4℃ for 5min
- 遠心(15,000rpm x 10min)/sup回収 (pptにはタンパク質)
- 添加・懸濁(イソプロパノール)、50μL
- Incubation R/T for 10min
- 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
- 添加・懸濁(70% EtOH)、
- 遠心pptを乾燥
- 添加・懸濁; TE(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA pH8.0), 25μL
- RNA分解: 添加(リポヌクレアーゼA)、1μL
- Incubation 37℃ for 30min
- 反応停止: 添加・懸濁(2M酢酸アンモニウム、pH7.6)、12.5μL
- 添加・懸濁(イソプロパノール)、37.5μL
- Incubation R/T for 10min
- 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
- 添加・懸濁(70% EtOH)、適量
- 遠心pptを乾燥
- 溶解: TE(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA pH8.0), 25μL
GMPグレード/pDNAの調達
- タカラバイオ – GMPグレードでのブラスミドDNA製造受託 – サイト
- 和研薬 – プラスミドベクター製造 – サイト
- WAKO – GMP準拠設備での高品質なプラスミド生産 – サイト
- メディリッジ – 高品質 プラスミドDNA製造 – サイト
- 徳島大学医学部 – 【学外受託サービス】 プラスミドDNA精製受託 – サイト
種類
- pAAV
- pRC
- pHelper
品質試験
- 無菌試験 (JP 4.06, USP71, Ph Eur 2.6.1)
- Endotoxin (JP 4.01, USP 85, Ph Eur 2.6.14)
- 純度 (紫外線分光)
- 制限酵素地図試験(アガロース電気泳動)
- 塩基配列 (サンガー法)
- CCC含量試験(アガロース電気泳動)
- 宿主DNA (qPCR)
- pH (JP 2.54)
日本薬局方
https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/0000066530.html
薬局方の国際調和
https://www.pmda.go.jp/rs-std-jp/standards-development/jp/0005.html
E.coli 産生株
治療用rAAV Vectorの調製には、3種類のPlasmid DNAが消耗品として必要である。
Plasmid DNAの調製にもGMP製造で行う必要があるため、Plasmid DNAを増やすための産生株(E.coli)の構築が必要となる。
[ignore]
- 製造(1.0千万円/3m)
- 分析(0.5千万円/3m)
[/ignore]
試験項目
- ファージ否定試験(寒天培養)
- 生菌数(コロニー)
- コロニー形成能(目視)
- 栄養要求試験(チアミン要求性、寒天培養)
- 生化学反応(菌種同定試験)
- 表現型試験(UV感受性、寒天培養)
- プラスミド保持率試験(コロニー形成)
- プラスミドコピー数(qPCR)
- 制限酵素地図試験(アガロース電気泳動)
- 塩基配列試験(サンガー法)
Master Cell Bank
継代数の少ない、健康な 293 細胞を使用する
[ignore]
- 製造(1.5千万円/1y)
- 分析(2.5千万円/1y)
[/ignore]
製造に関しての考慮事項
Transfection
以前は、以下のリン酸カルシウムが使用されたりしていたが、最近は、ポリエチレンイミン (PEI)を使用するが、よりグレードの高いPEIが開発されている。
- コストを抑えるためにリン酸カルシウムを使用できるが、pHにセンシティブ(0.05の変動でも影響を受ける)であるため、HBSバッファの使用を推奨する
阻害要因
トランスフェクションの阻害要因には、以下のDNAセンサーに関わるものが考えられるsource: invivogen.com。
いずれも、多少なりとも細胞死に関わっている。
- 細胞質の核酸センサー : dsDNAの感知
- AIM2
- AIM2は、パターン認識受容体 (その他にNLRP3)
- dsDNAに強く反応、カスパーゼ1の活性化、炎症性サイトカイン誘導(IL-1β、IL-18)[1]
- サイクリックGMP-AMPシンセターゼ(cGAS)
- STING / TBK1 / IRF3シグナル伝達、１型IFN刺激因子(ISG)の発現誘導
Post Transfection Culture
プラスミドの濃度や比率、PEIの比率、加えて、培養条件によっては、発現効率は異なってくると考えられる。DoE手法による詳細な検討の実施が必要である。
- 培地の血清の有無によって、発現量が異なる。Serotypeによっても異なる
- トランスフぇクション後、72時間後まで引っ張れば、効率的であったとの報告もあるが、5日後で効率的であったとの報告もある(44)
44)
Lock M., Alvira M., et al.
Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum. Gene Ther. 2010;21(10):1259-1271. [PubMed]
Harvest & Clarification
目的rAAV以外の不純物は、ヒトへの投与では炎症の元となる
- 細胞由来たんバク質
- 細胞由来DNA
- 血清タンパク質
- 培地成分
- ヘルパーDNA または、ヘルパーウイルス
References:
[1]. Patrick, K.L. et al. 2016. For Better or Worse: Cytosolic DNA Sensing during Intracellular Bacterial Infection Induces Potent Innate Immune Responses. J Mol Biol 428, 3372-3386.
発現タイターの検討
GFP コントロールウイルスでトランスフェクション効率条件を検討する。
Process Development
[ignore]
(2.0千万円/50L/6m)
[/ignore]
2015年現在、AAVの精製の報告
- rAAV1
- Poros 50HQ→Poros 10HQ→Sephacryl S-300 HR (AEX/AEX/SEC)
- Iodixanol→HiTrap (UC/AEX)
- AVB sepharose HP (IAC)
- CsCl→Mustan S→Mustang Q (UC/DIAM)
- CHT→AEX→HIC/SEC (Apatite/AEX/HIC/SEC)
- BAP rAAV1
- Monomeric avidin agarose (IAC)
- rAAV2
- Poros 20PI (AEX)
- Poros 50HQ→Poros 50HQ (AEX/AEX)
- Poros 50hS→Poros 50HS (CEX/CEX)
- Poros 50HS→Q-Sepharose xl (CEX/AEX)
- SP Sepharose HP→HiTrap Q (CEX/AEX)
- SP Sepharose HP→Source 15Q (CEX/AEX)
- Poros 20 HE (HEAC)
- Iodixanol→HiTrap Q (UC/AEX)
- Iodixanol→Herain (UC/HEAC)
- Sulfonated cellulose (AC)
- Iodixanol Poros HE (HEAC)
- Poros HE (HEAC)
- Poros 20 HE→Poros 50 PI (HEAC/AEX)
- CHT→DEA Macroprep→Cellufine sulfate (Apatite/AEX/AC)
- Heparin (HEAC)
- Heparin→Phenyl-Sepharose→Heparin (HEAC/HIC/HEAC)
- AVB sepharose (IAC)
- Mono Q HR→Superdex 200 (AEX/SEC)
- His6rAAV2
- rAAV4
- Poros PI→Poros HQ (AEX/AEX)
- Poros HQ (AEX)
- rAAV5
- Mustang S→Mustang Q (DEAM
- Mono Q HR→Superdex 200 (AEX/SEC)
- Iodixanol→HiTrap Q (UC/AEX)
- SP Sepharose HP→Source 15 Q (CEX/AEX)
- Poros PI (AEX)
- mucin coupled Sepharose (AC)
- rAAV6
- Poros 50HQ→Poros 50HQ (AEX/AEX)
- rAAV8
- SP Sepharose HP→Source 15Q (CEX/AEX)
- CsCl→Mustang S→Mustang Q (UC/DIAM)
- Sephacryl S-300 HR→Poros 50HQ (SEC/AEX)
- Pep8-agarose→HiTrap ! (IAC/AEX)
- His6rAAV8
- rAAV9
- CHT→Poros 50HS→CsCl (Apatite/CEX/UC)
Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties. 2015, Curr Pharm Biotechnol. 2015 Aug; 16(8):684-695
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5388796/?report=classic
Analytical Development
- USP DevelopmentやDSP Developmentと同様に、その品目に特異的な分析法の開発が必要
AAV Vector drug substance batch
- non-GNP Batch
- GMP Batch
- Relase Test
- Characterization ( if needed)
- Stability Test
[ignore]
- non GMP Batch (13.0千万円/3m)
- GMP Batch (16.0千万円/3m)
- Release Test (2.0千万円/3m)
- Characterization (??)
- Stability Test (2.0千万円/0,1,3,6,12,24,30,36)
[/ignore]
AAV Vector drug product Batch
- non-GMP Batch
- GMP Batch
- Release Test
- Stability Test
[ignore]
- non-GMP Batch (0.4千万円/3m)
- GMP Batch (0.6千万円/3m)
- Release Test (2.0千万円/3m)
- Stability Test (2.0千万円/0,1,3,6,12,24,30,36)
[/ignore]
編集履歴
2020/03/31 Mr.HARIKIRI
2020/10/14 追記(pDNAの精製、GMPグレード受託情報)
バイオ医薬品とは バイオ医薬品は、英語でバイオロジクスと言います。バイオロジクスには、ヒトの体内に存在するタンパク性物質をターゲット(狭義)にしているため、よく知られている「抗体」以外のタンパク質も含まれます。 バイオロ…
もとの設計図 天然のアデノ随伴ウイルス(AAV)のゲノムは、1本鎖DNA (single stranded DNA; ssDNA)です。両端に遺伝子複製に関わるITRがあり、その間にAAVが複製に必要な構成タンパク質や機…
細胞の同一性 アイソエンザイム解析 細胞株の同一性試験としては、規制当局の要件としてアイソエンザイム解析がある。 RAPD 同様に同一性試験としてDNAを対象にしたRandom amplified polymorphic…
生産細胞株 通常、Cell Bankの保管は、劣化を極力抑えるために液体窒素蒸気下の極超低温で行われます． 保管容器 Nunc™ Press Out Tool for Cryobank and Bank-It™ Vial…
参考文献
セルバイオラボ（Cell Biolabs）社 アデノ随伴ウイルス（AAV）発現／パッケージングシステム (コスモバイオ)
アデノ随伴ウイルス（AAV）とは (コスモバイオ)
STRATAGENEカタログ (コンピテントセル、トランスフェクション試薬
Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties, 2015
各SerotypeのrAAVの精製方法の文献からreviewした文献
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5388796/?report=classic
![[Bio-Equipment] 遺伝子導入装置 ; Transfection for Plasmid to cells](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/09/CC6C21C3-04DC-4068-885A-D26CA73FDD99.jpg)
![[用語] Transfection ; トランスフェクション – 遺伝子を細胞内に入れる](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/07/52A14BA1-7FA5-4C9E-BA19-8AB55D61952D.jpeg)
![[rAAV-Design] – 治療用AAV Vectorの設計 – 考慮事項 – ID12947 [2020/06/24]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/12/7B119BAB-E5A8-468F-AD69-15D899D1DF2C-1200x290.jpeg)
![[rAAV-Production] – 治療用AAV Vector製造 – 考慮事項 – SM-ID12844 [2020/10/14]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/10/249B4F20-3B70-444D-B8EB-E94C4F05E4D8.jpeg)
![[Bio-Edu] バイオ医薬品における生産細胞株の構築の方法 – ID5029 △[2020/08/19]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/05/5754D002-C57A-4FC9-8992-BA71D66B5952.jpeg)
![[Data Link] ウイルスベクターによる遺伝子導入と発現(4) – ID4158 [2019/12/09]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/12/BA5BE843-EA13-4085-8B1C-B7A45E451609-1200x838.jpeg)
![[Bio-rAAV] rAAV vector製造でplasmidを細胞に導入するトランスフェクション試薬 – ID3336 [2020/07/21]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2021/02/02EFCDFA-2F1F-4542-819B-78B1FA05C140.jpeg)
