はじめに
日本薬局方における 「微生物限度試験」 と 「無菌試験」 は、いずれも医薬品の品質・安全性を確保するための微生物学的試験法ですが、それぞれ目的・対象・方法に違いがあります。
特に，微生物限度試験は，英語で「バイオバーデン試験」といい海外CDMOなでの管理をしていると頻繁に出てくるキーワードです．バイオバーデン試験は2段階があり，(1) 定量的試験(微生物計数)では好気性微生物の総数を酵母菌とカビで決定する試験と(2)定性的試験(特定の微生物に関する試験)ではその存否を決定します．バイオバーデン試験は，USP<61>および<62>，EP第2.6.12章，及び日本薬局方で規定されています(参考文献1)．
微生物限度試験（収載番号：4.05）
試験目的
- 医薬品中の**一般生菌数（TAMC）や真菌数（TYMC）**を定量
- 特定微生物の有無を確認（健康リスクのある菌）
- TAMC（一般生菌数）やTYMC（真菌数）の試験は、基本的には「嫌気性細菌を検出することを目的とはしていません」。
- 無菌製剤ではない一般製剤（例：経口薬、外用薬、漢方薬など）について、「一定以下の微生物数であるか？」，「有害な特定微生物が含まれていないか？」 を確認する．
TAMC・TYMCと嫌気性細菌の関係について・・・
| 試験名 | 主な対象微生物 | 培養条件 | 嫌気性菌は対象か？ |
|---|---|---|---|
| TAMC | 好気性または通性嫌気性の細菌 | 約30～35℃で好気培養（空気あり） | ❌ 原則含まない（嫌気性菌は育たない） |
| TYMC | 酵母・カビ（真菌） | 約20～25℃で好気培養 | ❌ 対象外 |
→ TAMC/TYMCの環境では、偏性嫌気性細菌（例：Clostridium属など）は発育できないため、検出されません。
嫌気性細菌を検出するには？・・・
嫌気性細菌（特に毒素産生性の菌）を検出するには、以下の試験が適しています：
| 試験名 | 対象微生物 | 特徴 |
|---|---|---|
| 無菌試験（4.06） | 好気性・嫌気性すべて | 嫌気性菌も発育できる培地（FTM）使用 |
| 特定微生物試験（4.05内） | Clostridium属など | 嫌気培養・熱処理で芽胞菌を検出 |
| エンドトキシン試験（4.01） | グラム陰性菌由来の毒素 | 生菌ではなく毒素そのものを検出 |
まとめ
特定微生物試験（4.05内）：嫌気条件で選択的に培養する
TAMC/TYMCは好気性微生物が対象で、嫌気性菌の検出には適していない。
嫌気性菌を評価するなら：
無菌試験（4.06）：培地性能試験にClostridium sporogenesなど使用
適用対象
- 経口剤、外用剤、原料など 非無菌製剤
試験法の特徴
- 培養法（平板培養・液体培養）を用いて微生物数を測定。
- 一定の菌数以下であること（限度）を確認。
- 特定微生物は有無を調べるのみ（定量ではない）。
主な測定内容
- 一般生菌数 (好気性性微生物)
- 真菌数(カビ・酵母)
- 特定微生物の有無(例 : 大腸菌，サルモネラ属菌，黄色ブドウ球菌，緑膿菌，クロストリジウム属菌など)
主な手順概要
一般生菌数・真菌数の測定
- 試料の前処理（希釈・溶解）
- 寒天平板法または膜ろ過法により培養
- 培養期間：
- 一般生菌数：30～35℃で3～5日間
- 真菌数：20～25℃で5～7日間
- コロニー数をカウント（限度値以下なら合格）
特定微生物の検出（例）
| 微生物名 | 判定基準 | 使用培地・条件例 |
|---|---|---|
| 大腸菌 (E. coli) | 検出されないこと | マッコンキー培地、選択増菌 → 確認試験（発酵等） |
| サルモネラ属菌 | 検出されないこと | RVS培地などで選択増菌 → SS寒天で確認 |
| 黄色ブドウ球菌 (S. aureus) | 検出されないこと | マンニット食塩寒天培地 |
| 緑膿菌 (P. aeruginosa) | 検出されないこと | シュードモナス寒天 |
| クロストリジウム属菌 | 検出されないこと | 嫌気性条件、加熱処理（芽胞強調） → 培養 |
無菌試験（収載番号：4.06）
試験目的
- 無菌製剤に微生物がまったく存在しないことを確認
- 無菌性が要求される製剤（例：注射剤、点眼剤、輸液など）に対し，「1個でも微生物が存在していないこと（無菌性）」 を確認するための試験．
適用対象
- 注射剤・眼科用剤・生物学的製剤・無菌処理済製剤
試験法の特徴
- 試料を直接またはろ過により培養液に接種し、14日間培養して微生物の発育を確認。
- 好気性・嫌気性両方の培地を用いる。
- 微生物が1つでも存在すれば「不合格」。
試験法の種類
| 方法 | 概要 |
|---|---|
| 膜ろ過法 | 液体をフィルターでろ過 → 培地に浸して培養。濾過できる製剤に適用。 |
| 直接接種法 | 製剤を直接、培地に加えて培養。濾過困難な製剤（油性、軟膏等）に使用。 |
使用培地
| 培地名 | 用途 |
|---|---|
| 大豆-カゼイン消化物液体培地（TSB） | 好気性菌用（35 ± 2℃、14日間） |
| 流加チオグリコール酸液体培地（FTM） | 嫌気性菌用（30 ± 2℃、14日間） |
試験菌（陽性対照）に用いられる代表株
| 微生物 | 用途 |
|---|---|
| Bacillus subtilis（枯草菌） | 芽胞形成好気性菌 |
| Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌） | グラム陽性球菌 |
| Pseudomonas aeruginosa（緑膿菌） | グラム陰性桿菌 |
| Candida albicans（カンジダ） | 酵母（真菌） |
| Aspergillus brasiliensis（アスペルギルス） | 糸状菌（カビ） |
| Clostridium sporogenes（クロストリジウム） | 芽胞形成嫌気性菌 |
試験の判定
- 培養終了後、濁りや沈殿などの微生物の発育兆候がなければ「無菌」と判定
- 発育があれば不合格（＝無菌性なし）