![[用語] Transfection ; トランスフェクション – 遺伝子を細胞内に入れる](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/07/52A14BA1-7FA5-4C9E-BA19-8AB55D61952D.jpeg)
transfection
transfection ; トランスフェクションは、遺伝子組換え技術の基本である目的遺伝子(plasmid)を細胞 (Host Cell)の中に入れる操作です。使用する薬剤として強カチオンを使用したり、薬剤ではなく電気パルスで細胞膜を緩め小さな穴を作って挿入したりする方法があります。
編集履歴 2020/08/24 Mr.はりきり 2021/10/14,追記(電子パルスについて)
カテゴリー: BIOLOGICS
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![[用語] PCL – Packaging Cell Line/Producer Cell Line [2020/08/23]](data:image/png;base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAABVEAAAL9AQAAAAAK4htlAAAAAnRSTlMAAHaTzTgAAACVSURBVHja7cEBAQAAAIIg/69uSEABAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA8G4CGgABH7C88gAAAABJRU5ErkJggg==)
[用語] PCL – Packaging Cell Line/Producer Cell Line [2020/08/23]
Producer Cell LineとPackaging Cell Lineの違い
- Packaging Cell Lineは、キャプシドまたは空のウイルス量子を生産します。遺伝子治療用のウイルス・ベクターを生産するには、GOI Plasmidをトランスフェクションします
- Producer Cell Lineは、GOIの安定生産細胞株であり、長期にウイルス・ベクターを生産します source
プロデューサー細胞株は、遺伝子治療ベクターの製造コンポーネントの1つです。選択した細胞株の特性（起源/派生、倍加時間、ウイルス感染と複製の許容度）はウイルス生産性の効率を決定し、増殖条件は必要な下流の処理方法と最終製剤のリリーステストに影響します。この様式の細胞は、臨床目的によっては、患者に直接投与される可能性もあります。source
FDAガイドライン
遺伝子治療ベクターの遺伝子解析
2018年のFDAドラフトガイドラインの概要です source
- 「40kb以下のすべてのベクターを完全にシーケンスすることを推奨する」
- 「ウイルスベクターを統合するには、統合されたベクターでDNAシーケンスを実行することを推奨する。シーケンシング用の材料は、プロデューサー細胞株から収集できる。」
- 「安定したベクタープロデューサー細胞株(PLC)については、生産終了（EOP）細胞における遺伝子インサートの遺伝的安定性をテストすることを推奨する
対応できる企業
- Ultragenyx
- Vigene Biosciences
- HEK293-s, HEK293T-s, etc
- Suspension Cell culture
- Creative Biogene
- Oxgene™️
PCL関連文献リンク
- Gene Therapy Vector Production – Solentim.com –
- 92. Evaluation of Producer Cell Line Platform for Production of Oversized AAV-FVIII Vectors. , 2016, PlumX Metrics
- Characteristics of Minimally Oversized Adeno-Associated Virus Vectors Encoding Human Factor VIII Generated Using Producer Cell Lines and Triple Transfection , 2017
- Construction of stable packaging cell lines for clinical lentiviral vector production, 2015
- Generation and Characterization of AAV Producer Cell LInes for Research and Preclinical Vector Production. , 2013
- A Stable Producer Cell Line for the manufacture of a Lentiviral Vector for Gene Therapy of Parkinson’s Disease , 2010
- Generation of Retroviral Packaging and Producer Cell Lines for Large-Scale Vector Production and Clinical Application: Improved Safety and High Titer, 2000
編集履歴 2020/09/03 Mr.HARIKIRI 2020/09/17 追加(対応できる企業の追加;Oxgene™️)
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![[用語] エクソン; exon [2020/08/23]](data:image/png;base64,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)
[用語] エクソン; exon [2020/08/23]
エクソン
エクソン; exon, DNAまたはRNAがタンパク質に転写されるまでに、スプライシングを受けて実質的に必要な(タンパク質をコードするという意味での)遺伝子配列まで残る部分。
除去される部分をイントロンと呼ぶ。エクソンは、更にタンパク質に翻訳されるコーディング領域(CDS)と、されない領域(UTR; 非翻訳領域)に区別される。開始コドンより上流を5’UTR、終始コドンりより下流を3’UTRという。tRNAにも同様の機構が存在する。
- 5’ UTR
- エクソン
- CDS
- UTR
- イントロン
- 3’ UTR
エクソン – wikipedia –
https://ja.wikipedia.org/wiki/エクソン編集履歴 2020/08/18 Mr.HARIKIRI
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[用語] DNA; Deoxyribonucleic acid – Histoneを介した染色体の折り畳みまでを順を追って解説 [2020/09/23]
DNA
DNA; Deoxyribonucleic acid; デオキシリボ核酸。DNAは塩基の相補的結合によって2本が結合し二重螺旋 (DNA double helix)を形成します。人の23本の染色体に収められているDNAの長さは、総長30億塩基対です。卵子と精子を除く細胞は、2倍体なので、染色体は、46本(うち性染色体が2つ、DNAの総長は60億塩基対になります。
機能の有無で分けた場合、DNAには、イントロンとエクソンのそれぞれの領域が存在する。
昔々のバイオロジクス生産細胞株の品質管理
もう40年も前のことですが、IFNをリンパ芽球で生産していた頃、細胞の染色体数を先輩がカウントしていたことを思い出します。当時は、それくらいしか検査する項目が無かったからです。
1) DNAから染色体までのパッケージングについて、わかり易い図があります。クロマチン構造のDNAの巻き数は1.65回とありましたが、また、以下の2)の文献では、1.75回とありました。どちらが正しいのかは不明です。
DNA Packaging: Nucleosomes and Chromatin – Scitable by nature EDUCATION
https://www.nature.com/scitable/topicpage/dna-packaging-nucleosomes-and-chromatin-310/2)DNA-Histone結合体の分かり易い図があります。
クロマチン構造 – 分子遺伝学研究所 広島大学 –
http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/chromatin/chromatin1.html塩基対の幅は、2nmです。塩基対の長さは、約0.34nmです。60億を掛ける (0.34nm x 6e9 = 約2m)と、2倍体の細胞には、2mのDNAを含んていることになります。
人体には、約50兆個の細胞があると推定されるているので、人には、100兆メートルのDNAが含まれている計算です。
1. Nucleosomeの形成
DNAは、8 x Histone protein (2 x (H2A-H2B二量体) + (2 x H3, 2 x H4, オセロのチップのような平たな円柱構造の円周にDNAが巻きつく)の円周に1.65回巻かれます。
この1つのDNA-タンパク質結合体の単位を「Nucleosome」といい、DNAの長さ分だけ形成されます。この紐状のものを「Chromatin」と言います。実は、Chromatin線維は、細胞周期の間期に観察可能です source
すなわち、
- 二重螺旋の紐状のDNAは、以下の流れで最初の太い紐になります
- 8 x Histone (Histone Octamer) および1 x H1 histone proteinの球体に、糸巻きのように巻かれて、多数の基本単位であるDNA-Histone 結合体であるNucleosomeを作ります、
- 一つのNucleosomeには、146塩基対のDNAが含まれます
- DNA-Histon結合体の直径は11nmです
https://international.neb.com/products/epigenetics/histones/histones 1: Histone H1° (NEB #M2501) 1 μg; 2: Histone H2A (NEB #M2502) 1 μg; 3: Histone H2B (NEB #M2505) 1 μg; 4: Histone H3.1 (NEB #M2503) 1 μg; 5: Histone H3.2 (NEB #M2506) 1 μg; 6: Histone H3.3 (NEB #M2507) 1 μg; 7: Histone H4 (NEB #M2504) 1 μg; 8: Histone H2A/H2B Dimer (NEB #M2508) 2 μg; 9: Histone H3.1/H4 Tetramer (NEB #M2509) 2 μg; 10: NEB Protein Ladder (NEB #P7703)
図 Histoneの分子量 (SDS-PAGE)
2. Chromatosomeの形成
- Nucleosomeに1つのHistone 1 (H1) histone proteinが加わり
- Chromatosomeになります
2. Chromatinの形成
- おそらく、H1の追加により、Chromatosomeの12~13個を一周とする構造を形成するための方向性を持つようになると考えられます
- Chromatosomeが、12~13個を一周として配置されハッキングされた、この全体の構造体線維をChromatinと言います
- その一週の直径は、30nmです
3. Chromatinの螺旋・ループ形成
Chromatinは、「ねじれ」て、更に太い紐状になりパッケージングされます(便宜上、Chromatin螺旋、と称します)。Chromatin螺旋は、更に、ループ状に短縮されます(便宜上、Chromatin螺旋・ループ、と称します)。このループの長さは300nmです。
すなわち、
- Chromatinは、螺旋状にねじれて太い紐状に短縮され、
- さらに、その太い紐状は、ループに折り畳まれれてパッキングされます
- そのループの長さは300nmです。
- Chromatin螺旋・ループが完成します
4. Chromatin螺旋・ループの最後の螺旋形成
- Chromatin螺旋・ループは、更に螺旋を形成します(便宜上、Chromatin螺旋・ループ・螺旋、と称します)。
- 螺旋を形成することで、Chromatosome螺旋ループの幅は、コンプレスされて、300nmから250nmに縮小されます。
- Chromatin螺旋・ループ・螺旋の直径は、700nmです
5. 最後、染色体への形成
染色体 (chromosome) は、染色分体; chromatidを形成するために、Chromatin螺旋・ループ・螺旋は、最後の折り畳みが行われます。
分裂期の染色体は、一対の姉妹染色分体(それぞれを染色分体; chromatidという)からなるためXの形をしています。また、分裂期には、短腕と長腕の間にある「セントメア」に微小管のキネトコアにより姉妹染色分体は、両極に引き寄せられて分裂を完了します。source:wiki
編集履歴 2020/09/21 Mr.HARIKIRI 2020/09/23 追記 (Histone分子量)
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[Bio-Edu] 無菌医薬品の製造区域の環境モニタリング (レジメ) [2020/08/20]
無菌医薬品製造区域の環境モニタリング
参考サイト: Beckman courlter
パーティクルカウンターで浮遊する粒子を測定する。
製造区域
- 培養室
- ハーベスト室
- 精製室
- 容器の洗浄・乾燥室
- バッファ調製室
- 原料秤量室
- 滅菌室
- 充填室(bulk Fill finish)
- 包装
- 更衣室
製造区域のグレード分類
- グレードA
- 汚染リスクを高いレベルで防ぐ
- 局所的な区域
- 無菌医薬品、容器、栓の無菌性維持
- 無菌接続
- 無菌充填
- 容器閉塞
- グレードB
- 比較的高いレベルで防ぐ
- 多目的な区域
- 滅菌後の容器や原材料及び中間体の搬入場所
- グレードAであるアイソレータ、ブローフィルシールの周りの環境はグレードBで良い
- グレードC, D
- 滅菌前の作業場所
- 洗浄室
- アイソレータの周辺環境として使用される
粒子数
許容空中浮遊微粒子数（個/m3)
非作業時 非作業時 作業時 作業時 推奨モニタリング頻度 グレード 0.5 µm以上 5.0 µm以上 0.5 µm以上 5.0 µm以上 n/a A 3520 20 3520 20 作業中 B 3520 29 352000 2900 作業中 C 352000 2900 3520000 29000 月一 D 3520000 29000 —-※2 —-※2 月一 ※1 非作業時の値は、作業終了後、一般に15~20分後に達成されるべき値である。
※2 この区域の許容微粒子数は、作業形態により異なる。モニタリングポイント
- 製造区域の空気
- 床
- 壁
- 設備表面
- 手袋
- 作業衣など
- 考慮事項 : 重要作業箇所、汚染されやすい箇所、製造区域の清浄度を代表する箇所などを考慮
微粒子測定にあたっての注意点
- 測定数値は、平均値として評価を行う。過小評価しないこと
- 校正済みの装置を用いること。装置本体、サンプリングチューブの長さ、直径及び曲がり部分の直径などに注意すること
- 5.0 μm以上の大サイズ微粒子は、比較的速く落下するので、長いチューブ使用は避ける
- グレードA区域は、連続モニタリングが推奨される。サンプリング量は1m3当たりに正確に換算できる量であること
（参考：第十六改正 日本薬局方 第一追補 参考情報）
編集履歴 2020/08/20 Mr.HARIKIRI
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[用語] IL-17; interleukin-17 [2020/08/18]
IL-17
IL-17; interleukin-17; IL-17A, そのたIL-17BからIL-17Fまで知られている。
IL-17は、CD4陽性T細胞が産生する(これをTh1細胞, Th2細胞の対比としてTh17細胞という)。IL-17受容体(IL-17R)を発現する細胞は、マクロファージなどの免疫細胞、角化細胞を含む上皮細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、滑膜細胞などがある。IL-17Rを介して炎症性サイトカイン、ケモカインが産生され、好中球の遊走し、組織障害、血管新生が誘導される。治療ターゲットは、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病が挙げられている。経路開始 → (CD4+ T Cell (Th17 cell) )→ IL-17 → IL-17R (= Mφ/上皮細胞/血管内皮細胞/線維芽細胞/滑膜細胞) → 炎症性サイトカイン・ケモカイン → 好中球(遊走:血管を通り抜ける能力) → 組織障害・血管新生 (自己免疫疾患)
参考
IL-17
https://www.jstage.jst.go.jp/article/arerugi/64/7/64_971/_pdf/-char/ja編集履歴 2020/08/18 Mr.HARIKIRI
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気になる企業 – ファーマフーズ – あの育毛剤「ニューモ」を開発・販売しているバイオ技術を持つ中小企業が頑張っている [2021/08/07]
ファーマフーズ
株式会社ファーマフーズ(PFI)は、京都を拠点とする医薬品と食品を融合するという理念のもと事業活動を行っているバイオ技術を有している活発な会社です。今年初めには、田辺三菱製薬との抗体医薬に関する独占的ライセンス契約を締結するなど活発な活動をしており、基礎固めとして自社製品の製造工場・販路拡大の一手にも抜かりは無いようです。
買収
- 2021/08/06, 明治薬品(資本金0.98億円)の株式2/3以上(目標: >90%)を取得し子会社化することを発表(本契約の効力発生日:2021/08/31)source
- ホームページ
- 株式会社ファーマフーズ
- 日本、京都市
- 1997/09/12設立
- 2006年に東京証券取引所に上場
- 資本金 20億円
- 従業員数 168名(連結)
- 業態
- 研究開発・販売、通信販売、バイオメディカル
- 子会社
- ファーマフーズコミニュケーション (H28/08設立)
- フューチャーラボ (H28/11子会社化)
- メディラボ
- ブルーオーシャンの戦略 (競争が激しいレッドオーシャンではなく、競争の少ないブルーオーシャンを探し、その領域で事業を行う事)
製品・開発品
GABAとストレス軽減というコンセプトで製品を開発して事業基盤を構築して株式上場を果たしています(2006)
最近では、知る人は知っているあの育毛剤、HGP(ヘアーグロースペプチド)を配合した「ニューモ」を開発・販売しています。
医薬品においても、図1に示すように3つの抗体と1つのペプチド、および抗体試薬製品を含めてパイプラインを持っています。
医薬品の開発パイプライン 編集履歴
2020/08/17 by Mr.HARIKIRI 2021/08/07, 追記(明示薬品の子会社化)
![[用語] エクソン; exon [2020/08/23]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/08/891E4ECC-0853-4F4C-842B-7BDB74B7182D.jpeg)
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