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![気になる企業 – VIROVEK (バイロベック) – AAV-toxin Vector技術 – ID12859 [2020/03/31]](data:image/png;base64,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)
気になる企業 – VIROVEK (バイロベック) – AAV-toxin Vector技術 – ID12859 [2020/03/31]
ID12859
VIROVEK
VirovekはSf9/vaculovirusをベースに独自のAAV-toxin技術を持つCMOである。
- Hayward, CA, US
- Sf9/BaculovirusによるAAV vectorの製造
- 研究用のAAV, Plasmidも販売
- 独自技術
- 毒素遺伝子を持つウイルスベクター
- Cell Ablation Technology
- in vitro検証済み
- AAV-toxin vectorが作られた時のみ毒素が活性化される技術
- バキュロウイルス
- 無血清培養
- 毒素遺伝子を持つウイルスベクター
- AAV製造プロセスsourc
- Cloning GOI into AAV shuttle plasmid : 1-2 wk
- Generation of Bacmid and purification of Bacmid DNA : 4 d
- Transfection of Sf9 cells to generate baculovirus : 4 d
- Amplification of baculovirus and titration : 3d
- Production of AAV and CsCl purification : 1w
- Desalting, filter sterilization, and AAV titration : 2d
- カスタムメイドAAV
- 1e13 vg scale to 3e16 vg
- カセット
- Single promoter expression cassettes
- Dual promoter expression cassettes
- (toxin genes added)
- shRNA (with reporter gene)
- microRNA (with reporter gene)
- IRES expression cassettes
- P2A expression cassettes
- Cre-LoxP cassettes
- Double-floxed inverted orientation (DIO)
- Flip excision (FLEX) cassettes
- BSL-1
- AAV1
- AAV2
- AAVr
- AAV5.2
- AAV6
- AAV8
- AAV8.2
- AAV9
- more
- Productivity
- 2e13 vg/mL
- 価格表 : 1e13 vg/$3,500 ~ 1e15 vg/$119,900
TransfectionとPlasmid
Rep-Cap Vectorと目的遺伝子のVectorをBaculovirusにinfectionさせる方法を採用してしている
VIROVEK 編集履歴 2020/03/31 Mr.HARIKIRI
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[Bio] 細胞の同一性試験 – DNA Finger Printing Test (Random amplified polymorphic DNA; RAPD) – ID12852 [2020/03/31]
細胞の同一性
アイソエンザイム解析
細胞株の同一性試験としては、規制当局の要件としてアイソエンザイム解析がある。
RAPD
同様に同一性試験としてDNAを対象にしたRandom amplified polymorphic DNA (RAPD)試験がある。
具体例として、参考文献1が参考になる。
STR
その他にも、Short Tandem Repeat (STR)分析がある。
参考
文献1
RAPD-PCR法によるトラフグ、ハコフグ、うまづらはぎおよびアンコウの肝臓の判定
http://www.city.fukuoka.lg.jp/data/open/cnt/3/25273/1/35-p086.pdf関連記事
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[rAAV-Production] – 治療用AAV Vector製造 – 考慮事項 – SM-ID12844 [2020/10/14]
ウイルス・ベクターと宿主細胞の準備
- ベクターに適合した宿主細胞(master cell bank, working cell bank)
- ベクター
- construction
- generation
- premaster seed
- master seed
- working seed
- PCLとは
- Packaging or Producer Cell Line
- Three Plasmid Transfectionに代わる生産系である
- 目的遺伝子以外のAAVベタクー産生に必要な遺伝子を既に組み入れた生産細胞、または、目的遺伝子さえも組み入れた生産細胞
- Oxgene™️、Vigeneなどが持っている
目標のAAVベタクー発現量
15cm ディッシュ1枚から 1-2×1011 genome copies (GC)、または、1011-1012 GC/mL（各細胞あたり 2×104 – 1×105 ウイルス粒子）
Material
Plasmid DNA Batch
[ignore]
- non-GMP製造(14.0千万円/3 x Plasmid/200L/3m)
- GMP製造(16.0千万円/3xPlasmid/200L/3m)
- 分析(0.5千万円/3 x Plasmid/3m)
- カルタヘナ申請 (0.5千万円/3m)
[/ignore]
ITRに組換えが少ないプラスミドを得る。
プラスミドの品質: 形質転換後の ITRs による組換えは、プラスミドのサイズを減少させるので、これを抑制させる。Life Technologies社の Stbl3 コンピテントセルをプラスミドの増幅に用いる。
Plasmidの精製
- プラスミドDNAをE.coliに形質転換
- シングルコロニー
- 拡大培養
- アルカリSDS法による粗精製
- アルカリ-SDSは、大腸菌染色体ＤＮＡを細胞壁とともに除去するため、プラスミドDNAのみを得るのに信頼性の高い方法 (Lab向き)
- クロマト精製
- 脱塩
- 濃縮
- Sterile Filtration
- 分注
- 凍結保存(-30℃)
- 二種カルタヘナ法対応(GMP製造開始前)
pDNA培養特許
大腸菌中でプラスミドｄｎａを製造規模で生産するための流加発酵法及び培地 (特許, 2011), link
pDNA精製特許
プラスミド精製 (2007), link
Cytivaによる精製ストラテジー
ヒトおよび動物の遺伝子治療用プラスミドの精製プラスミドDNA (2007), link
アルカリSDS法レジメ
ラボでの調製のレジメを以下に示した。
- 大腸菌の培養
- 遠心/E.coli
- 添加・懸濁(25mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 50mM Glucose), 100μL
- 穏やかに添加・撹拌(0.2M NaOH, 1% SDS), 200μL
- Incubation 4℃ for 5min
- 添加・懸濁 (7.5M 酢酸アンモニウム、pH7.6、氷冷)、150μL
- Incubation 4℃ for 5min
- 遠心(15,000rpm x 10min)/sup回収
- Sup/(100+200+150=450μL)
- 添加・懸濁(イソプロパノール), 270μL
- Incubation R/T for 10min
- 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
- 添加・懸濁(2M酢酸アンモニウム、pH7.6)、50μL
- Incubation 4℃ for 5min
- 遠心(15,000rpm x 10min)/sup回収 (pptにはタンパク質)
- 添加・懸濁(イソプロパノール)、50μL
- Incubation R/T for 10min
- 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
- 添加・懸濁(70% EtOH)、
- 遠心pptを乾燥
- 添加・懸濁; TE(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA pH8.0), 25μL
- RNA分解: 添加(リポヌクレアーゼA)、1μL
- Incubation 37℃ for 30min
- 反応停止: 添加・懸濁(2M酢酸アンモニウム、pH7.6)、12.5μL
- 添加・懸濁(イソプロパノール)、37.5μL
- Incubation R/T for 10min
- 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
- 添加・懸濁(70% EtOH)、適量
- 遠心pptを乾燥
- 溶解: TE(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA pH8.0), 25μL
GMPグレード/pDNAの調達
- タカラバイオ – GMPグレードでのブラスミドDNA製造受託 – サイト
- 和研薬 – プラスミドベクター製造 – サイト
- WAKO – GMP準拠設備での高品質なプラスミド生産 – サイト
- メディリッジ – 高品質 プラスミドDNA製造 – サイト
- 徳島大学医学部 – 【学外受託サービス】 プラスミドDNA精製受託 – サイト
種類
- pAAV
- pRC
- pHelper
品質試験
- 無菌試験 (JP 4.06, USP71, Ph Eur 2.6.1)
- Endotoxin (JP 4.01, USP 85, Ph Eur 2.6.14)
- 純度 (紫外線分光)
- 制限酵素地図試験(アガロース電気泳動)
- 塩基配列 (サンガー法)
- CCC含量試験(アガロース電気泳動)
- 宿主DNA (qPCR)
- pH (JP 2.54)
日本薬局方
https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/0000066530.html薬局方の国際調和
https://www.pmda.go.jp/rs-std-jp/standards-development/jp/0005.htmlE.coli 産生株
治療用rAAV Vectorの調製には、3種類のPlasmid DNAが消耗品として必要である。
Plasmid DNAの調製にもGMP製造で行う必要があるため、Plasmid DNAを増やすための産生株(E.coli)の構築が必要となる。
[ignore]
- 製造(1.0千万円/3m)
- 分析(0.5千万円/3m)
[/ignore]
試験項目
- ファージ否定試験(寒天培養)
- 生菌数(コロニー)
- コロニー形成能(目視)
- 栄養要求試験(チアミン要求性、寒天培養)
- 生化学反応(菌種同定試験)
- 表現型試験(UV感受性、寒天培養)
- プラスミド保持率試験(コロニー形成)
- プラスミドコピー数(qPCR)
- 制限酵素地図試験(アガロース電気泳動)
- 塩基配列試験(サンガー法)
Master Cell Bank
継代数の少ない、健康な 293 細胞を使用する
[ignore]
- 製造(1.5千万円/1y)
- 分析(2.5千万円/1y)
[/ignore]
製造に関しての考慮事項
Transfection
以前は、以下のリン酸カルシウムが使用されたりしていたが、最近は、ポリエチレンイミン (PEI)を使用するが、よりグレードの高いPEIが開発されている。
- コストを抑えるためにリン酸カルシウムを使用できるが、pHにセンシティブ(0.05の変動でも影響を受ける)であるため、HBSバッファの使用を推奨する
阻害要因
トランスフェクションの阻害要因には、以下のDNAセンサーに関わるものが考えられるsource: invivogen.com。
いずれも、多少なりとも細胞死に関わっている。
- 細胞質の核酸センサー : dsDNAの感知
- AIM2
- AIM2は、パターン認識受容体 (その他にNLRP3)
- dsDNAに強く反応、カスパーゼ1の活性化、炎症性サイトカイン誘導(IL-1β、IL-18)[1]
- サイクリックGMP-AMPシンセターゼ(cGAS)
- STING / TBK1 / IRF3シグナル伝達、１型IFN刺激因子(ISG)の発現誘導
- AIM2
Post Transfection Culture
プラスミドの濃度や比率、PEIの比率、加えて、培養条件によっては、発現効率は異なってくると考えられる。DoE手法による詳細な検討の実施が必要である。
- 培地の血清の有無によって、発現量が異なる。Serotypeによっても異なる
- トランスフぇクション後、72時間後まで引っ張れば、効率的であったとの報告もあるが、5日後で効率的であったとの報告もある(44)
44)
Lock M., Alvira M., et al.
Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum. Gene Ther. 2010;21(10):1259-1271. [PubMed]Harvest & Clarification
目的rAAV以外の不純物は、ヒトへの投与では炎症の元となる
- 細胞由来たんバク質
- 細胞由来DNA
- 血清タンパク質
- 培地成分
- ヘルパーDNA または、ヘルパーウイルス
References:[1]. Patrick, K.L. et al. 2016. For Better or Worse: Cytosolic DNA Sensing during Intracellular Bacterial Infection Induces Potent Innate Immune Responses. J Mol Biol 428, 3372-3386.
発現タイターの検討
GFP コントロールウイルスでトランスフェクション効率条件を検討する。
Process Development
- USP/DSP
[ignore]
(2.0千万円/50L/6m)
[/ignore]
2015年現在、AAVの精製の報告
- rAAV1
- Poros 50HQ→Poros 10HQ→Sephacryl S-300 HR (AEX/AEX/SEC)
- Iodixanol→HiTrap (UC/AEX)
- AVB sepharose HP (IAC)
- CsCl→Mustan S→Mustang Q (UC/DIAM)
- CHT→AEX→HIC/SEC (Apatite/AEX/HIC/SEC)
- BAP rAAV1
- Monomeric avidin agarose (IAC)
- rAAV2
- Poros 20PI (AEX)
- Poros 50HQ→Poros 50HQ (AEX/AEX)
- Poros 50hS→Poros 50HS (CEX/CEX)
- Poros 50HS→Q-Sepharose xl (CEX/AEX)
- SP Sepharose HP→HiTrap Q (CEX/AEX)
- SP Sepharose HP→Source 15Q (CEX/AEX)
- Poros 20 HE (HEAC)
- Iodixanol→HiTrap Q (UC/AEX)
- Iodixanol→Herain (UC/HEAC)
- Sulfonated cellulose (AC)
- Iodixanol Poros HE (HEAC)
- Poros HE (HEAC)
- Poros 20 HE→Poros 50 PI (HEAC/AEX)
- CHT→DEA Macroprep→Cellufine sulfate (Apatite/AEX/AC)
- Heparin (HEAC)
- Heparin→Phenyl-Sepharose→Heparin (HEAC/HIC/HEAC)
- AVB sepharose (IAC)
- Mono Q HR→Superdex 200 (AEX/SEC)
- His6rAAV2
- Ni-NTA agarose (IMAC)
- rAAV4
- Poros PI→Poros HQ (AEX/AEX)
- Poros HQ (AEX)
- rAAV5
- Mustang S→Mustang Q (DEAM
- Mono Q HR→Superdex 200 (AEX/SEC)
- Iodixanol→HiTrap Q (UC/AEX)
- SP Sepharose HP→Source 15 Q (CEX/AEX)
- Poros PI (AEX)
- mucin coupled Sepharose (AC)
- rAAV6
- Poros 50HQ→Poros 50HQ (AEX/AEX)
- rAAV8
- SP Sepharose HP→Source 15Q (CEX/AEX)
- CsCl→Mustang S→Mustang Q (UC/DIAM)
- Sephacryl S-300 HR→Poros 50HQ (SEC/AEX)
- Pep8-agarose→HiTrap ! (IAC/AEX)
- His6rAAV8
- Ni-NTA agarose (IMAC)
- rAAV9
- CHT→Poros 50HS→CsCl (Apatite/CEX/UC)
Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties. 2015, Curr Pharm Biotechnol. 2015 Aug; 16(8):684-695
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5388796/?report=classicAnalytical Development
- USP DevelopmentやDSP Developmentと同様に、その品目に特異的な分析法の開発が必要
AAV Vector drug substance batch
- non-GNP Batch
- GMP Batch
- Relase Test
- Characterization ( if needed)
- Stability Test
[ignore]
- non GMP Batch (13.0千万円/3m)
- GMP Batch (16.0千万円/3m)
- Release Test (2.0千万円/3m)
- Characterization (??)
- Stability Test (2.0千万円/0,1,3,6,12,24,30,36)
[/ignore]
AAV Vector drug product Batch
- non-GMP Batch
- GMP Batch
- Release Test
- Stability Test
[ignore]
- non-GMP Batch (0.4千万円/3m)
- GMP Batch (0.6千万円/3m)
- Release Test (2.0千万円/3m)
- Stability Test (2.0千万円/0,1,3,6,12,24,30,36)
[/ignore]
編集履歴 2020/03/31 Mr.HARIKIRI 2020/10/14 追記(pDNAの精製、GMPグレード受託情報)
参考文献
セルバイオラボ（Cell Biolabs）社 アデノ随伴ウイルス（AAV）発現／パッケージングシステム (コスモバイオ)
アデノ随伴ウイルス（AAV）とは (コスモバイオ)
STRATAGENEカタログ (コンピテントセル、トランスフェクション試薬
Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties, 2015
各SerotypeのrAAVの精製方法の文献からreviewした文献
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5388796/?report=classic -
[Bio-Edu] 細胞・細菌・ファージ・ウイルスを増やす 簡単な解説 – ID20721 [2020/10/06]
はじめに
初学者を対象にして、バイオを研究するために必要な知識を提供する[Bio-Edu]です。この記事では、バイオ、すなわち組換え体として使用する細胞や細菌、さらに関連知識として必要な更に小さな生物であるファージとウイルスについて解説します。
生物
生物界での病気やバイオにおける基礎知識として、「宿主 (しゅくしゅ)」という概念があります。
ウイルスは生物ではないと考えられていましたが、最近では、生物であるともいわれます。
この定義は、自分で自分を複製できないものは、生物ではないとする定義です。
閑話休題 – 遺伝子の数 –
ヒトの遺伝子は3万、大腸菌は4千、ウイルスは10個程度であり、これら、動物細胞、細菌、ウイルスのそれぞれの粒子としての大きさは、遺伝子の数に依存しています。ウイルスと細菌
http://www2.nupals.ac.jp/~fmfsc/Topics/uirusuto_xi_jun.html生物と呼びにくい面々
細胞、細菌は、適切な条件のもとで栄養分さえ与えてやれば、自分自身で複製できます。
自分自身で複製できないものには、ウイルスの他にファージと呼ばれるものがあります。
ウイルス
ウイルスは、細胞に感染して細胞の生存機能を利用することで複製します。一方、ファージの感染対象が、細菌であることがウイルスと異なります。ウイルスは、通常丸い形をしていますが、ファージは、下図のように数十年前に初めてアメリカが月面着陸に成功した時に使用された「月面着陸宇宙船」の形にそっくりです。ファージについては、後述します。
ウイルスとファージの形の違いには意味があります。ウィルスとは、比較的柔らかい表面の動物の細胞に感染するためには、この形(機能)で十分です。ウイルスは、細胞の表面に「ソフト」に吸着します。細胞とウイルスの表面は、よく似た膜(脂質膜)で覆われた構造であるため、「シャボン玉」同士が接触して吸着し融合していくような感じです。生命の活動とは不思議なもので、目的である細胞に融合したウイルスは、その後、細胞中へ完全に入っていきます(感染)。
細胞 (Cell) 
COVID-19 図1. 細胞とウイルス
細胞(左図)とウイルス(新型コロナウイルス-WHO特設サイト-、右図)
ファージ
ファージでは、細胞表面が硬い細菌に感染するために、「月面着陸宇宙船」の形(機能)をしています。
ファージの足の部分で、細菌に着陸(吸着)し、その後、胴体部で穴を開けて、スポイドの頭のような部分に保管されている自らの遺伝子を細菌の内部に注入します。
図2. 大腸菌とファージ
大腸菌(左図)とファージ(右図)
増殖の機構は同じ
ウイルスとファージの増殖は、細胞や細菌の生命活動を使って増殖します。細胞、細菌の中に自分の遺伝子が入ってしまえば、後はそれぞれの宿主(細胞、細菌)の生命活動の中でウイルス、ファージの独自の遺伝子が機能することにより、ウイルスやファージのパーツであるタンパク質が作られます。そのパーツから完全な形のウィルスやファージが作られ、宿主から飛び出ていきます。
増やす方法
細胞・細菌を増やす
栄養分を含む溶液(培地)に細胞や細菌を浸して、適度な条件 (温度、pH、浸透圧、酸素濃度、栄養素)で維持(培養という)してやると増殖します。
- 動物細胞、大腸菌
- 温度
- pH
- 溶存酸素濃度
- 栄養
増殖は、1個が2個になる、中学生の頃にに学んだあの増殖です。1個が2個、2個が4個、4個が8個、8個が16個・・・。この2個になる時間を「ダブリングタイム」と言います。
ウイルス・ファージを増やす
ウイルスやファージは、「細胞を増やす」で増やした細胞・細菌を用います。細胞、細菌に、ウイルス、ファージを添加して感染させます。感染とは、前述したように細胞、細菌の中に入ることです。細胞に接触させるだけで、感染させることができます。
ウイルスやファージは、自分たちが増殖しやすい宿主を知っており、その宿主である細胞や細菌の表面に付着(これを知っていると表現)して、中に入り込みます。これを感染といいます。感染した後、宿主の細胞、細菌の生命活動を利用して自分自身のパーツをつくり、複製していきます。宿主を知っているとは、受容体が存在していると言い換えることができます。
受容体とは、相手方(細胞など)に自分(ウイルス)のある部分を認識して結合できるある部分(一番的にタンパク質)のことを一般的にそのように呼びます。受容体が存在しなけば、感染は成立しません。
まとめ
バイオの初学者向けに、細胞、細菌、ウイルス、ファージの増やす方法 (単に「培養」と呼んだりする)について解説しました。
以上
大腸菌のイラスト – 理研 –
http://rtcweb.rtc.riken.go.jp/DNA/sec/m1.htmlファージに関する情報です
ファージ — – ウィキペディア –
https://ja.wikipedia.org/wiki/ファージ細胞培養の種類、培地、など詳細な基礎的な情報がえられます
細胞培養の基礎知識 – Merck –
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipeecoli.pdf線画培養からシングルコロー取得して液体培養までの必要な材料と手順などの情報が得られます
大腸菌培養 – Sigma Aldrich –
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipeecoli.pdf昆虫細胞の培養培地に関する製品情報です
昆虫細胞培養 – Thermo Fisher Scientific –
https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cell-culture/insect-cell-culture.html参考動画 – 細胞の説明
編集履歴
2020/03/27 Mr.Harikiri
2022/05/09 追記 (図)、文言整備
2020/10/06 追記 (培養用の培地情報)、文言整備
2022/11/08 追記(はじめに)、文言整備 -
気になる企業 – Yposkesi (イポスケシ) – ヨーロッパ最大のAAV/Lentivirus Vectorの生産能力を誇る – ID12817 [2020/03/31]
Yposkesi
YposkesiはフルサービスCDMOである。
- フランス
- Genenthonのスピンオフ, 2016
- 患者団体 AFM-Telethon (イタリア)
- SPI投資ファンド
- 50,000 ft2 (5,000m2)
- up to 100,000 ft2 2021
- Start at 2022 for commercial production and EMA and FDA compliance
- 4 suites for drug substance
- 2 suites for fill & finish
- 175人
- プロセス開発
- 2 to 10L bioreactor (suspension)
- Adherent
- トランスフェクション
- DOE
- Ratio of Plasmid DNA/Transfection reagents/Cell density
- Ration Full/Empty
- vector constructionの比較
- 分析法開発 (analytical development)
- assays qualification
- validation
- ウィルベクターGMP製造 (BSL 2)
- 33 batches / year
- 2 x 200L single use bioreactor
- 500L single use bioreactor
- 24 Cell Factory 10
- purification
- Depth→UF/DF→Affinity→IEX→Size exclusion
- Fill & Finish
- Crystal(R) Closed Vial Technology
- AsepticTechnologies(R), 1mL (Cyclo-Olefin Co-polymer)
- glass vials
- 250μL to 4.5 mL
- 100%目視検査 → Labeling
- BSL2 class C area, and grade A containment isolator
- 手動/半自動
- 300 vials/batch
- Crystal(R) Closed Vial Technology
- QC
- capability
- IR detection western blot
- DLS
- subvisible particle counting(light obscurantism or microscopy)
- and general
- GP QC team
- environmental monitoring test
- utility test (water system)
- Controls of all incoming raw material
- in-process control and release assays
- internally lab
- subcontractors
- Runs stability studies
- <-135℃, <-80℃, <-20℃, 2~8℃, 15℃ to 25℃
- Analytical development, tech transfer, validation
- capability
- QA
- Regulatory Support
- 臨床ロットに必要な文書の作成
- Bill of material
- 新しい原材料の登録
- 臨床ロットに必要な文書の作成
編集履歴
2020/03/31 Mr.HARIKIRI
-
![[GT] 承認された遺伝子治療薬 – まとめ – ID10658 [2020/06/09]](data:image/png;base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAABLAAAANGAQMAAADXg+UGAAAAA1BMVEUAAACnej3aAAAAAXRSTlMAQObYZgAAAAFiS0dEAIgFHUgAAACRSURBVBgZ7cExAQAAAMIg+6deDB9gAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAABwEe5ZAAGMJbmmAAAAAElFTkSuQmCC)
[GT] 承認された遺伝子治療薬 – まとめ – ID10658 [2020/06/09]
まとめ
2020年3月現在、承認された遺伝子治療薬の数は、一桁であるが、既に世界は、「抗体医薬」から「遺伝子治療薬」にカジを大きく切っている。
ほぼ全ての抗体医薬に関する技術は、コモディティ技術となり、新規参入CDMO/CMOが、この業界に低いリスクで参画が可能となった。
大手CDMO/CMOは、これからプラットフォーム技術の構築が開始される「遺伝子治療薬の製造技術」を用いた委託製造業に参入を進めている。
大手の医薬品メーカーは、遺伝子治療薬の製造が可能な小さいCDMOや開発ベンチャーを傘下に収める段階を完了した。
今や遺伝子治療薬の開発は本格化し加速していく。
2016
http://www.nihs.go.jp/mtgt/section-1/gene-therapy-drug-20160914.pdfウイルスを基盤とした遺伝子治療薬の臨床開発の
https://www.jstage.jst.go.jp/article/dds/34/2/34_99/_pdf/-char/ja
現状と今後の展望 – 2019 – JSTAGE –製品名 適応症 企業 導入遺伝子、ベクター 投与経路/導入遺伝子 承認年 Glybera リポ蛋白質リパーゼ(LPL)欠乏症 uniQure社
欧州での販売を2017年10月25日の特許切れをもって終了AAV1ベクター in vivo/LPL 2012 IMLYGIC 切除不能性悪性黒色腫 Amgen/BioVex Inc. GM-CSF遺伝子搭載腫瘍溶解性Herpes Virus 1 in vivo/GM-CSF 2015 Strimvelis アデノシンデアミナーゼ欠損症 GlaxoSmithKline ADA/レトロウイルス(自家CD34+細胞) ex vivo/ADA 2016 Zalmoxis 移植片対宿主病(GVHD)の合併予防 MolMed Herpes VIrusスチミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子、欠乏型ヒト低親和性神経成長因子受容体、CAR-T療法/レトロウイルスベクター in vivo/HSV-TK,ΔLNGFR 2017 Kymriah B細胞性リンパ腫 Novartis CD19標的キメラ抗原受容体遺伝子/レトロウイルスベクター Ex viro/CD19-CAR 2017(US)
2019(JP)Yescarta DLBCL Gilead Sciences/Kite Pharma CD19/レトロウイルスベター Ex vivo/CD19-CAR 2017 Luxturna RPE65突然変異網膜ジストロフィ Spark Therapeutics RPE65/AAV2ベクター in vivo/RPE65 2017 FDA Zolgensma (AVXS-101) 骨髄性筋萎縮縮小 Novartis SMN1遺伝子/AAV9 in vivo/SMN1 2019 Zynteglo 輸血依存βサラセミア(TDT) Bluebird Bio βA-T87Q-globin遺伝子/レンチウイルス(自家CD34+細胞) in vivo/βA-T87Q-globin 2019 Colategen 慢性動脈閉塞症 Anges ペルプラスミド in vivo/HGF 2019 Valoctocogene Roxaparvovec Hemophilia A (血友病A) BioMarin Pharmaceutical AAV5ベクター in vivo/FVIII 見送り(2020/8) - 血友病A : 4,000~5,000人の男児出生に1人の割合で実証する血液凝固第VIII因子欠乏遺伝子疾患。現在の治療は、血漿分画製剤を週3回の投与が必要です。
- Valoctocogene Roxaparvovecは、Roche/Sparcの競合、3年間のP2では、年間出血率0~0.7source。投与量は6e13 vg/kg, 4e13 vg/kg source
編集履歴 2020/03/30 Mr.Harikiri 2020/06/09 追記(BIOMARINのvaloctocogene roxaparvovec(血友病A遺伝子治療薬) 2020/09/17 誤記修正
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[Data Link] 気になる企業 – Cayman Chemical – 実験用試薬の調達 – ID12767 [2020/03/30]
実験用試薬の調達
バイオの実験には多数の試薬、装置が必要です。把握しなければならない情報は多いのです。日本で実験用の試薬を必要とするとき、代理店がありまずが、その元となるメーカーについても知っておきたものです。
HELPING MAKE RESEARCH POSSIBLE – Cayman Chemical – サイト
https://www.caymanchem.com -
[健康] 緑内障 – 治療ステップ -ID12762 [2021/10/11]
緑内障
緑内障は，120~150万個あるとされる「網膜神経節細胞;etinal ganglion cell, RGC」が一部で死滅した結果，その部分の視野が欠損する症状として現れます．従って，緑内障は治らない病気です．網膜神経節細胞は，種々の形体が見られるが，脳へ至る長い軸索を持つ共通する特徴がある．
一般的に網膜と呼ばれる膜は，何層にもなっていて一層目の網膜細胞(錐体細胞と桿体細胞)で受けた情報を網膜神経節細胞が仲介し最終的に脳(視床，視床下部，中脳)に伝達される(2023/11/08)．
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網膜神経節細胞とその周辺に位置する組織細胞を描いた参考となる図を検索しています回答を生成しています…
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網膜神経節細胞とその周辺に位置する組織細胞を描いた参考となる図は、以下のようなものがあります。
- 1 では、網膜の各層と神経細胞の配置を示しています。網膜神経節細胞は網膜の最も内側にあり、視細胞からの情報を受け取る双極細胞やアマクリン細胞とシナプスを形成しています。神経節細胞の軸索は視神経となって脳に伝達されます。
- 2 では、神経節細胞の種類とその特徴を示しています。神経節細胞には、外側膝状体のP細胞に投射するMidget細胞、M細胞に投射するParasol細胞、K細胞に投射するBistratified細胞、視交叉上核に投射する光感受性神経節細胞などがあります。それぞれに応答速度や受容野の大きさ、色やコントラストの感度などが異なります。
- 3 では、神経節細胞の軸索が視神経交叉でどのように分かれるかを示しています。神経節細胞の軸索は鼻側半分と耳側半分とでまとめられ、鼻側半分のものは反対側に、耳側半分のものは同じ側に投射されます。これにより、右視野の情報は左の外側膝状体で、左視野の情報は右の外側膝状体で処理されます。
- 4 では、外側膝状体の構造と神経節細胞の投射先を示しています。外側膝状体は視床の一部で、6層の構造を持っています。1、2層に位置する神経細胞をM細胞、3、4、5、6層をP細胞、間にあるものをK細胞と呼びます。神経節細胞の投射先は、Midget細胞がP細胞層、Parasol細胞がM細胞層、Bistratified細胞がK細胞層になります。また、外側膝状体と同じ側に位置する目の情報は2、3、5層に、反対側の目の情報は1、4、6層に投射されます。
- 5 では、網膜の内網状層の構造を示しています。内網状層は、双極細胞やアマクリン細胞と神経節細胞の樹状突起とがシナプスを形成する部位です。神経節細胞はオン型とオフ型に分かれ、オン型は双極細胞のオン型とアマクリン細胞のオフ型と、オフ型は双極細胞のオフ型とアマクリン細胞のオン型とシナプスを形成します。これにより、神経節細胞は中心周辺拮抗型の受容野を持ちます。
Learn more1ja.wikipedia.org2human-cell.com3jstage.jst.go.jp4inami.co.jp5ganka.info6bing.com7js-brain.com8gettyimages.com
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- 緑内障の病名の由来 : 眼圧が急激に上がるなどする急性の緑内障を紀元前４～５世紀頃に古代ギリシャのヒポクラテスが「地中海の海の色のように青くなり、やがて失明状態になる」と記述しているところに由来とする説。東洋人では青くなることは少ない。
- 一般的に眼圧が上がって発症すると言われてますが、日本人には当てはまるとは言えません。7割が正常眼圧の範囲内での正常眼圧緑内障と呼ばれています。しかし、治療法は眼圧を下げるしかなく目的は一つでその手段が手術や点眼の2択です。
- 因みに、白内障は、レンズである水晶体が白く濁って白くなることから日本ではこの名称がついています。いずれにしても、見た目の命名であって発症の原因は異なります。
メルマガ、150:なぜ緑内障と呼ぶか（緑内障の由来）- 新宿東口眼科医院 –
https://www.shec.jp/mailmag/150/原因別
- 隅角の詰まりによるもの
- 原発閉塞隅角緑内障（げんぱつへいそくぐうかくりょくないしょう）
- 発達緑内障（はったつりょくないしょう）
- 房水の排出路の詰まりによるもの
- 原発開放隅角緑内障（げんぱつかいほうぐうかくりょくないしょう）
- 正常眼圧のもの
- 正常眼圧緑内障（せいじょうがんあつりょくないしょう）
40歳をすぎたら「正常眼圧緑内障」にご注意を, 2011
https://www.healthcare.omron.co.jp/resource/column/life/95.html緑内障 – EyeLife – より
https://www.eyelifemegane.jp/v2/sick_glaucoma.php緑内障について詳細に纏められた資料があります。以下のリンクを辿ってみてください。
緑内障で失明しないために (2019)
https://www.akashi-shiminhosp.jp/pdf/person/person_20190808_2.pdf要因
緑内障の要因は種々あると考えられており、多因子リスクの説が有力です。ストレス、低血圧、睡眠時無呼吸症候群などです。いずれも循環関係、すなわち血行不良などが原因となっているようです。
また、強度近視の場合、緑内障の発症リスクは高くなることもわかっているようですが、強度近視は、眼軸の伸びることが原因であることも近年わかって来ています。更に、眼軸が伸びるのは、眼球の強膜の細胞における小胞体ストレスにより、強膜を作っているタンパク質に異変を来すことが原因であると、最新の研究で明らかにされています。
眼軸が伸びることで、緑内障の発生にも関わっているのでは無いかとも言われています。すなわち、眼軸が伸びることで、眼底部の視神経周辺を圧迫し神経の栄養が悪化することで、神経が徐々に死んでゆくことで視野が欠けてくるという理屈です。
検査
- 眼圧検査
- 隅角検査
- 眼底検査
- 視野検査
緑内障の治療スフップ
治療は基本的に、現状維持か進行速度の抑制です。生涯にわたってクオリティ・オブ・ライフ(QOL); 人生の質の向上をできるだけ目指すことになります。
少し切実な話になります。それほど遠くない将来には、現在、開発が精力的に進められている遺伝子治療により、網膜を含めた眼底の組織の再生が可能になるかも知れませんが、現在は、対処療法で凌いで人生を全うすることになります。
- 点眼 :
- 正常眼圧 : 10〜21 mmHg
- 眼圧上昇/視野障害 : 1種類から開始
- 視野障害の悪化 : 2種類、3種類と増やしていく
- 正常眼圧においてもプロスタグランジン製剤で効果がある
- レーザー治療
- レーザー線維柱帯形成術 (隅角光凝固術)
- 観血的緑内障手術
- 眼圧 : >15mmHg
- 緑内障インプラント手術
- Express(R) : ステンレス製のインプラント(2.6mm, 380μm)
以上
参考文献
緑内障について -Santen –
1. ストレスをためない
https://www.santen.co.jp/ja/healthcare/eye/library/glaucoma/nattoku/about-gla/
2. 規則正しい食生活
3. 適度な運動
4. 急速な水分補給をしないさくらい眼科
https://www.sakurai-eyeclinic.jp/content3.html2. 視神経を強化する緑内障予防法
首の指圧について書かれている
【血流を改善して緑内障予防】血管指圧で血管を直接刺激する方法 | 緑内障社長の目に良い日記 – 緑内障・視野欠損の不安に負けず生きる方へ (cjnext.com)編集履歴
2020/03/30 はりきり(Mr) 2021/10/11,追記(病名の由来) 2021/01/03,追記(要因は多因子のリスク) 2023/11/08,追記(具体的に損傷する組織細胞名)
![今日の英語 – We would be grateful – 感謝します [2020/04/02]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/11/F12C8F86-A0B0-4334-9DAD-E75022893870.jpeg)
![気になる企業 – VIROVEK (バイロベック) – AAV-toxin Vector技術 – ID12859 [2020/03/31]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/10/B4F24978-42E9-477E-92B0-94605AEBEAB4.jpeg)
![[Bio] 細胞の同一性試験 – DNA Finger Printing Test (Random amplified polymorphic DNA; RAPD) – ID12852 [2020/03/31]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/04/BC3CB4B4-937C-4284-97D3-DCB0EEED9552.jpeg)
![[rAAV-Production] – 治療用AAV Vector製造 – 考慮事項 – SM-ID12844 [2020/10/14]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2019/10/249B4F20-3B70-444D-B8EB-E94C4F05E4D8.jpeg)
![[Bio-Edu] 細胞・細菌・ファージ・ウイルスを増やす 簡単な解説 – ID20721 [2020/10/06]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2021/02/80F3D755-3019-49C6-BDAE-47D137C87826.jpeg)
![[GT] 非臨床試験 (遺伝子治療) – SM-](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/01/B3A94AB0-D3B4-4665-962D-A4C150A3051C-1200x838.jpeg)