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  • [Bio-Equip] Thermo Fisher 「CaptureSelect」 – AAV1~AAXをキャプチャリングできるAffinity resin – [2019/09/21]

    [Bio-Equip] Thermo Fisher 「CaptureSelect」 – AAV1~AAXをキャプチャリングできるAffinity resin – [2019/09/21]

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    ID2320

    CaptureSelect

    CaptureSelectは、複数種類のアデノ随伴ウイルス(AAV)に対応するアフィニティ精製用の樹脂(resin)です。

    抗体医薬での精製方法がプラットフォーム化されているように、遺伝子治療薬のデリバリーシステムであるAAVの精製に欠かせない担体です。

    CaptureSelectは、抗体医薬のキャプチャリングとして使用するProtein Aレジンに相当するステップに使用します。

    動画による説明 : CaptureSelect

    ラクダ抗体を利用したAffinity Resin技術

    Binding Capacity: >10e13~10e14

    ウイルスベクター精製用 POROS CaptureSelect 樹脂および試薬 , より

    再生処理

    吸着・溶出してAAVを精製した後は、レジンの再生処理が必要です。十分な洗浄を行って、再利用することで実製造でのコスト低減が可能でなければなりません。0.5M NaOHなどのアルカリ再生処理が可能であることに越したことはありませんが、リガンドがタンパク質なのでアルカリ洗浄には対応していないようです。3M GuHClでの再生処理が可能であるので、取り敢えずは合格というところでしょうか。本当はアルカリ耐性が欲しいところですが。

    • Resistance: 4M Ures, 3M GuHCl

    文献

    1) データシート

    Enabling technologies for efficient downstream processing of biosimilars, vaccines and gene therapy vectors:

    https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/latin-america/promotions/pdf/bioproducao/12-Shelly-Parra-Efficient-downstream-processing-of-biosimilars-vaccines.pdf

    編集履歴

    2019/09/21, Mr.Harikiri
    2021/11/02,追記(解説、再生処理)

  • [Bio-Edu] ラクダが持っている抗体は、一般的なIgGとは異なる構造の重鎖抗体 – ID2300 [2019/09/21]

    [Bio-Edu] ラクダが持っている抗体は、一般的なIgGとは異なる構造の重鎖抗体 – ID2300 [2019/09/21]

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    ラクダの重鎖抗体

    一般的にラクダ抗体は、通常の抗体IgGとは異なる構造の重鎖抗体と呼ばれる少し分子量が小さい抗体をある比率で持っている。

    特にラクダ科のアルパカでは抗体の内50%は、この重鎖抗体を占めるという。結合ドメインは一般的な抗体では2本鎖なので2個のドメインだが、重鎖抗体は、軽鎖がないので1個のドメインで結合ドメインとして機能する。

    重鎖抗体の構造

    重鎖抗体の形状は、一般的なIgGから軽鎖(CL-VL)が外れて、更に重鎖のCH1ドメインが欠落したY字構造である。

    分子量は150kDa(各ドメインの分子量を単純割合で12.5kDaとする)から軽鎖の50kDa(2x(2×12.5)kDa)を引いて100kDaとなり、更にCH1の2×12.5kDa = 25kDaを引いて、75kDaであると簡単に推定される。

    • IgGの分子量 : 150kDa
    • 重鎖抗体の分子量 : 75kDa

    nanobody/VHH抗体

    重鎖抗体を産業上の利用を容易にする目的で、可変領域のみに改変したものを、VHH抗体又はNanobodyと呼ぶ．

    • nanobodyの分子量 : 12.5kDa(上記の計算による理論値)

    一般的な抗体(IgG)では、2個のドメイン(Y字の1の手に2つの指:(VHとVL)で抗原に結合する。

    ラクダ抗体では、軽鎖がないので、1個のドメイン(VH)で抗原と結合できるシンプルな構造となっているため、産業利用が進められてきた。

    最近では、更に抗原結合部位のみ、即ち、VHのみを使った研究が多く進められている。

    遺伝子治療などのバイオ医薬品(バイオロジクス)の開発には、欠かせないアフィニティ(Affinity)として、nanobodyが製品がされている(参照)。

    ラクダ抗体の産業利用

    [Bio-Equip] Thermo Fisher 「CaptureSelect」 – AAV1~AAXをキャプチャリングできるAffinity resin – [2019/09/21] ID2320

    参考文献

    アルパカが持つ不思議な抗体の魅力: https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9604/9604_index.pdf

    編集履歴

    2020/04/28 文言整備、追記(産業利用製品)
    2021/11/02 追記(アイキャッチ画像変更)

  • [rAAV-DSP] AVB Sepharose High Performance – ID2292 [2019/09/21]

    [rAAV-DSP] AVB Sepharose High Performance – ID2292 [2019/09/21]

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    AVB Sepharoseの概要

    吸着可能なAAVの血清型

    • AAV1
    • AAV2
    • AAV3
    • AAV5

    Resinの特性

    • Binding Capacity: >10e12 vg/mL of resin
    • 組換え酵母で作られた蛋白質(14kDa)
    • Resingの安定性: 文献

    概要

    低pH溶出と比較して、高pH溶出および0.5または1.0 Mアルギニンでは、収量は低下したが、アルギニンを含む高pH溶出バッファーは、AAV純度が高くなることを示しており(260/280)、高pH溶出は、低pHでは敏感なウイルスを精製するための代替手段となる。

    Elution bufferの種類

    • EB1 0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl, pH 2.5
    • EB2 0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl, 0.5 M arginine, pH 10.0
    • EB5 20 mM Tris-HCl, 2.5 M MgCl2, pH 8.0
    • EB6 0.1 mM sodium acetate, 2.5 M MgCl2, pH 2.5
    • EB7 0.1 M glycine, 0.5 M NaCl, pH 3.0
    • EB8 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 0.5 M arginine, pH 10.8
    • EB9 1.5 M NaCl, 0.02% (w/v) TweenTM 80, 50% (v/v) ethylene glycol, 20 mM L-histidine, 20 mM CaCl2, pH 6.
    Load Sample/Column information
    • カラム : Tricorn 5/50 (1 mL column volume)
    • レジン : AVB Sepharose High Performance, 1 mL
    • 平衡化バッファ : 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0
    • ロードサンプル : rAAV, 7x10e10 vg/mL x 20 = 1.4x10e12 in Equilibration buffer / 0.2 μm filter, 20 mL
    • 線流速 : 153 cm/h
    • 溶出液評価: AAV ELISA測定
    Study 1
    1. 1st Elution buffer: EB1(recovery 120% of 130% total recovered virus: batch wiseと結果が真逆)
    2. 2nd Elution buffer: EB8 (recovery 6%)
    Study 2
    • Elution buffer : EB3(recovery 72% of 73% total recovered virus
    Study 3
    • Elution buffer : 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCVl, 1.0M arginine, pH10.8 (recovery 62% of 64% total recovered virus)

    AVB SepharoseTM High Performance, GE Healthcare

    https://gels.yilimart.com/Assets/Images/doc/file/28411211_DATAFILE_01.PDF

    編集履歴

    2019/09/21, Mr.HARIKIRI

  • [Games] スプラツーン2 ☆99の次は?、☆1に戻る。なんでやねん – ID2286 [2019/09/21]

    [Games] スプラツーン2 ☆99の次は?、☆1に戻る。なんでやねん – ID2286 [2019/09/21]

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    スプラツーン2

    ☆99になって、これで終わりかとおもっていた。昨日、ガチエリアで初めての”S”になった。貯めていたサザエを取りに広場にいるジャッジくんに会いに行って、13個のサザエを貰ったのは良かった。

    ジャッジくんが、なんか変なことを言っている。

    ☆1をくれるとかなんとか。”えっ”。結局☆99は、☆1へとリボーンしてしまった。”え ーー”、ガッカリしてしまった。Nintendoさん、メンテナンスしてないですね。スプラツーン2のOnline Playをするために、300円/月払ってるのに。。だが、スプラツーン3を待ってますよ^^)

  • [Data Link] 薬物動態学 – □ID2282 [2019/09/20]

    [Data Link] 薬物動態学 – □ID2282 [2019/09/20]

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    2013年度薬物治療塾Dコース 後期第一回勉強会主旨: http://plaza.umin.ac.jp/~juku-PT/D/D014.pdf

    添付文書が読める薬物動態学: http://www.jiho.co.jp/Portals/0/ec/product/ebooks/book/48407/48407.pdf

  • [Bio-Equip] Bio Process用フィルター製品 – △ID2280 [2019/09/20]

    [Bio-Equip] Bio Process用フィルター製品 – △ID2280 [2019/09/20]

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    はじめに

    レジン充填したカラムを用いるタンパク質精製は，一般的で主要な精製方法です．膜メーカーからレジンに代わる単体としてメンブラン製品にリガンドを付加することで，精製基材をラインナップしています．メンブラン・クロマト基材はレジン充填カラムと比較して処理流速を高めることが可能でプロセス時間を短縮に寄与します．以下には，3MとPallのメンブラン・クロマト基材を紹介します．

    3Mのメンブランクロマト基材

    Zeta Plus EXT SP

    膜型のSP(陽イオン交換)レジンです．

    https://www.lenntech.com/Data-sheets/Zeta-Plus-EXT-SP-Series-Filters-L.pdf

    3M Zeta Plus SP Series Filters, Regulatory Support File: https://multimedia.3m.com/mws/media/1238785O/3m-zeta-plus-zb-series-filters.pdf

    Emphases AEX

    バイオロジクスのプロダクション培養後のハーベス工程に使用できる。ハーベストでは、細胞の除去が最低限の目的であるものの、培養状態によっては、細胞由来の不純物が多く含まれる場合がある。AEXのモードを持つEmphases AEXは、細胞由来のHCP, HCDを効率よく吸着除去することが可能である。

    3M Biopharmaceutical Innovation. Pure and simple, 3M Emphaze AEX Hybrid Purifier: https://multimedia.3m.com/mws/media/1021045O/3m-emphaze-aex-hybrid-purifier.pdf

    Pallのメンブランクロマト基材

    Mustang Q

    • 膜タイプの陰イオン交換機材
    • レジンでカラムを立てるよりも30倍以上の高速処理

    Mustang® Q XT 陰イオン交換・クロマトグラフィーカプセル

    https://products.pall.jp/jp/ja/biotech/chromatography/membranes/zidgri78lhe

    フィルター関連記事

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    2019/09/20, MR.HARIKIRI
    2023/11/10, 文言整備(はじめに，を追加)

  • [rAAV-Edu] POROS CaptureSelect (AAV精製 resin) の性能とAEXによるfull/emptyの分離 – ID2271 [2019/09/18]

    [rAAV-Edu] POROS CaptureSelect (AAV精製 resin) の性能とAEXによるfull/emptyの分離 – ID2271 [2019/09/18]

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    AAVX Resinの特徴

    複数の血清型AAVを吸着

    POROSは、Thermo Fisherのブランドです。以前は独立したメカーでしたが、M&Aで傘下になっています。POROSプランドでAAVをキャプチャー精製する製品は、CaptureSelect(TM)というものがあります、そのラインナップは、AAV8, AAV9, AAVXです。AAVXレジンは特別で、血清型の違いに関係なく高い吸着性能を持っています。すなわち、1つのレジンで精製方法をプラットフォーム化することが可能です。

    これは、抗体医薬で使用されるていProtein Aレジンと同様の位置付けに等しい将来性のあるレジンです。

    • Binding Capacity: >10e14 (vg/mL)

    CaptureSelectとは

    ラクダの重鎖抗体を応用したnonobody技術により、AAVに対する結合性のあるLigandをPorosレジンにカップリングした製品である。

    AAVXレジンの吸着性能をバッチ法で評価

    CaptureSelectのラインナップの内、AAVXは殆どのAAVの血清型に対して高い親和性を有している。

    AAVXレジンと各血清型のAAV (培養、抽出、清澄化したサンプル液)を混合し、チューブ内で10分間の吸着反応させる系で、溶出バッファー(0.1M citric acid, pH2)により回収した溶出液をqPCRでvgを測定し、その回収率を評価している。

    その結果、AAV1(99.63%), AAV2(97.8%), AAV2_HSPG(98.33%), AAV4(98.05%), AAV5(97.88%), AAV6(97.45%), AAV6.2(98.93%), AAV7(98.37), AAV8(97.76%), AAVrh10(96.28%), AAVrh32.33(99.29%), AAV9PHPB(98.51%), AAV7m8(98.39%)、と多数の血清型のAAVを高い効率で吸着・溶出が可能であることが示されている。

    AAVXレジンとその他のレジンとの比較

    比較に使用したレジン

    1. AVB: GE Healthcare
    2. Poros AAV8
    3. Poros AAV9
    4. Poros AAVX

    その結果、下図のように、AABレジンでは、AAV8, AAV9、AAV10を吸着できるものの60%から80%程度の吸着能しかないことが示されている。AABレジンの製品仕様ではAAV1, AAV2, AAV3及びAAV5で使用できるとあることから、当然の結果である。

    AAV2のemptyとfullのHQカラムによる分離

    CsCl2密度勾配の超遠心処理で精製した遺伝子が封入されていないempty AAVと封入されているfull AAVを混和して、AEXカラムであるPOSOR HQカラムにアプライしてクロマトグラフィーを行うと、emptyとfullを分離できる。

    • emptyの溶出位置: 10mS/cm
    • fullの溶出位置: 12mS/cm
    HQ POROS AAV2
    AAV

    参考文献

    Overcoming downstream purification challenges for viral vector manufacturing: enabling advancement of gene therapies in the clinic: https://pdfs.semanticscholar.org/935c/2e2ee928ba35ebbe22bf43c2e5e1ebe1a4f0.pdf

    Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0166093406004022?via%3Dihub

    Review – ラクダが持つ不思議な抗体の魅力:https://harikiri.diskstation.me/myblog/biologics/2300/

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    2019/09/18, Mr. Harikiri
    2021/11/02,記載整備

  • [rAAV] rAAVベクターの精製方法 – Universal Method (2018) – ID2266 [2019/09/18]

    [rAAV] rAAVベクターの精製方法 – Universal Method (2018) – ID2266 [2019/09/18]

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    はじめに

    遺伝子治療薬のデリバリー・システムとしてAAV使用が盛んです。今後は、AAVの精製についても抗体医薬と同様に精製方法のプラットフォーム化が進むと予想されます。それを目指して精製関連機材メーカーは、意欲的な製品を発表しているところです。

    ここでは、AAVの精製方法について情報を集めてみたいと思います。現状が把握できれば、今後の方向性も自ずと見えてきます。

    文献の内容

    AAVの血清型に依存しないプットフォーム化された精製方法に関する文献

    GE HealthcareのAVB SepharoseとPOROSの CaptureSelect AAV8及びAAV9の比較

    トリビア: 欧州で開発された最初の遺伝子治療薬Glybera (AAV1-LDL)

    Affinity精製の不利な点は、遺伝子が封入の有無(Empty/Full)にかかわりなく精製されること。

    AEXは、EmptyとFullの分離が可能であり、微妙な電荷の違いが存在することを示唆している。

    この文献では、AffinityとAEXを使用することで精製プラットフォームを提案している。

    Affinity精製サンプルのAUC分析では、多数のピークが確認され、Full以外のEmptyやその他のCapcid蛋白質などの不純物が多く含まれていた。

    Affnity後のAEX精製サンプルのAUC分析(UVモニター)では、1つの主ピークを認め、精製度が上がっている画分は、AEXのクロマトプロファイルとしてA260/A280比は、1を超えておりFull画分と考えられた。

    編集履歴
    2019/09/18 はりきり(Mr)
    2020/06/12 整備(Gutenberg blockに変換)

    精製方法の骨格

    Affinityクロマト→イオン交換クロマト

    対象文献

    Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes, 2018

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5767896/pdf/main.pdf

    参考文献

    AVB SepharoseTM High Performance, GE Healthcare

    https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/pdf/28920754ab.pdf

    アデノ随伴ウイルス精製用アフィニティー担体 – GE Healthcare –

    https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/1259.html

    POROSTM CaptureSelectTM AAV Resins: AAV8, AAV9, AAVX – Thermo Fisher –

    https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/100038399_POROS_CapSel_AAV8_AAV9_Resins_UG.pdf

    Enabling Custom Solutions for Downstream Processing for Future Therapies: AAV Case Study, BioProcess International, 2016 – bioprocess international –

    https://bioprocessintl.com/ask-the-experts/aav-case-study-poros-resins-captureselect-ligand-webcast/

    編集履歴

    2019/09/18, Mr. Harikiri
    2021/11/02,記載整備

  • [Cafe] 珈琲蔵人 珈蔵 箕面店 – ID2242 [2019/09/16]

    [Cafe] 珈琲蔵人 珈蔵 箕面店 – ID2242 [2019/09/16]

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    モーニングセット

    トウモロコシ・ツナ・ホットサンド モーニングセットを頂いた。

    KARURA 20190916

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    2019/09/16, Mr.Harikiri
    2022/11/15, 地図(プラグインからGoogleMapコードに変更)

  • [Data Link] Purification of rAAV-1 and -9 with ultracentrifugation-free technique towards GMP production.(2013-2015, 科研費研究) – ID2225 [2019/09/15]

    [Data Link] Purification of rAAV-1 and -9 with ultracentrifugation-free technique towards GMP production.(2013-2015, 科研費研究) – ID2225 [2019/09/15]

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    Purification of rAAV-1 and -9 with ultracentrifugation-free technique towards GMP production: https://kaken.nii.ac.jp/ja/file/KAKENHI-PROJECT-25460407/25460407seika.pdf

    UFP-750-E-3MA: https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/1140.html

    Highly Efficient Ultracentrifugation-free
    Chromatographic Purification of Recombinant
    AAV Serotype 9: https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/pdfExtended/S2329-0501(18)30111-6