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[日本薬局方] 微生物限度試験法・無菌試験法の操作の具体例 [2025/04/04]

執筆者:

harikiri

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培養条件のポイント

培地温度日数使用理由
FTM30～35℃14日間嫌気・通性嫌気性菌対応
SCDM20～25℃14日間真菌・一般細菌対応

※両方とも14日間継続培養が必要。毎日または定期的に混濁や菌塊の有無を観察します。

補足情報

  • 培地は無菌性を保証するために、使用前に無菌試験および性能確認試験（Growth Promotion Test）を実施する必要があります。
  • **FTMの酸化状態（表層がピンク色になっていないか）**も使用前に確認する必要があります。

試験の具体的な流れ

ステップ①：試料の接種

  1. 試験対象（例：注射剤、軟膏など）を無菌操作下で準備。
  2. TSBおよびFTMに、決められた量の試料を直接加える（通常、10mLあたり最大1mLまで）。
  3. 混和して、すぐに培養へ。

※製剤が濁っている場合や防腐剤を含む場合は、中和剤の添加が必要になることがあります。

ステップ②：培養条件

培地温度期間
TSB20～25℃（好気）14日間
FTM30～35℃（嫌気）14日間
  • 培養中は、濁りや沈殿など発育兆候を目視観察
  • 防曇ガラス容器や傾斜容器が用いられることもあります

ステップ③：判定

判定基準結果
合格14日間、いずれの培地にも発育兆候がない（透明）
不合格濁り、沈殿、ガス産生、膜形成などがあれば不合格

まとめ：直接接種法の特徴

項目内容
対象製剤ろ過困難なもの（油性、軟膏、乳剤、粉末など）
メリット簡便、器具が少なくて済む
注意点製剤が培地に干渉する場合がある（中和・希釈・事前検証が必要）
合否判断微生物の発育が完全にゼロであることが必須

【無菌試験における性能確認（陽性対照試験）】

Ⅰ. 性能確認とは？

  • 無菌試験では、使用する培地や試験操作が微生物の検出に適しているかを確認する必要があります。
  • これを「性能確認（適格性試験, Validation / Suitability Test）」と呼びます。
  • 性能確認では、**少量（≦100 CFU程度）**の既知の微生物を試験に用い、それらが培養で増殖するかを確かめます。

Ⅱ. 使用される陽性対照菌（試験菌株）

日本薬局方では、以下の微生物を性能確認に使用することが推奨されています：

微生物名（学名）推奨株（ATCCなど）例特徴
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）ATCC 6633グラム陽性、好気性芽胞菌
クラウディア・アルビカンス（Candida albicans）ATCC 10231酵母
アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus brasiliensis）ATCC 16404カビ
大腸菌（Escherichia coli）ATCC 8739グラム陰性桿菌
サルモネラ・アバニ（Salmonella Abony）NCTC 6017グラム陰性桿菌
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）ATCC 6538グラム陽性球菌

Ⅲ. 試験方法と評価

試験手順（概要）

  1. 選択した菌株から、**微量（≦100 CFU）**の懸濁液を調製する。
  2. それを実際の試験と同様の方法（直接接種法または膜ろ過法）で試験培地に添加。
  3. 指定の条件下（温度・期間）で培養する。
  4. 微生物が増殖して検出できることを確認。

判定基準

  • 各菌株が適切な培地と条件で明確に増殖すること。
  • 結果が不適合の場合は、培地、操作、試験条件を再評価・再確認する必要があります。

Ⅳ. 実施タイミングと頻度

  • 性能確認は以下のタイミングで実施される：
    • 新しい培地ロットを使用する前
    • 試験法の初導入・変更時
    • 定期的なバリデーションまたは疑義発生時

Ⅴ. なぜ重要か？

  • 無菌試験は、「微生物が**いないことを確認する試験」」なので、微生物がいた場合にちゃんと見つけられるかを確認する性能試験が不可欠。
  • これが確認できていないと、**偽陰性（本当は汚染されているのに検出されない）**リスクが高まります。

最後に

  • 直接接種法は、膜ろ過法に比べて簡便ですが、製剤成分による干渉が起きやすいため、慎重な事前評価（バリデーション）が必要です。
  • 中和剤や希釈剤の選定、陽性菌回収率の検証などが重要です。

参考ポスト

[日本薬局方] 微生物限度試験・無菌試験および関連する試験 [2024/10/17, 2025/06/09修正]

参考文献

編集履歴

2025/04/04 Mrはりきり

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