[日本薬局方] 微生物限度試験法・無菌試験法の操作の具体例 [2025/04/04]
無菌試験法の具体例1(膜ろ過法)
「日本薬局方 一般試験法4.06 無菌試験法」の概要
Ⅰ. 無菌製品の微生物学的試験：無菌試験の概要
- 無菌試験（Sterility Test）は、注射剤、点眼剤、透析液などの無菌製品に対して実施される試験です。
- この試験の目的は、試験対象製品に生きた微生物が存在しないことを確認することです。
- 試験は、製品の滅菌法の妥当性を確認し、製品が汚染されていないことを保証するために行われます。
Ⅱ. 試験法の種類と実施方法
日本薬局方では、以下の2つの方法が規定されています：
1. 直接接種法（Direct Inoculation Method）
- 試料をそのまま滅菌培地に接種し、微生物の発育を観察する方法。
- 接種後、30～35℃の好気性細菌用培地（FTM）と20～25℃の真菌用培地（SCD）の両方で14日間培養します。
2. 膜ろ過法（Membrane Filtration Method）
- 液状製品に用いられる主な方法で、製品を滅菌膜でろ過し、膜上の微生物を2種類の培地に移して培養します。
- 濁度や着色などで直接接種が困難な製品にも適応可能です。
Ⅲ. 培地および培養条件
| 培地名 | 培養温度 | 培養日数 | 対象微生物の例 |
|---|---|---|---|
| FTM（Fluid Thioglycollate Medium） | 30～35℃ | 14日間 | 好気性および通性嫌気性細菌 |
| SCD（Soybean-Casein Digest Medium） | 20～25℃ | 14日間 | 真菌（酵母・カビ）など |
※ 両培地とも、事前に**培地の適格性試験（Growth Promotion Test）**を実施し、有効性を確認する必要があります。
Ⅳ. 試験の適用対象
無菌試験は、以下のような製品に義務付けられています：
- 注射剤（バイアル、アンプルなど）
- 点眼剤
- 透析液
- 一部の手術用洗浄剤や注入液
※製品ごとに試験法の選択（直接接種 vs 膜ろ過）は、その性状・使用目的に応じて判断されます。
Ⅴ. 注意点・補足
よって、製造工程の**無菌保証（例：滅菌バリデーション、環境管理、無菌操作）**と組み合わせて使用される必要があります。
無菌試験は、無菌性を完全に保証するものではなく、統計的確認手段とされています。
試験対象例：バイアル注射剤（液体）
使用する材料・培地
| 材料 | 目的 |
|---|---|
| 膜ろ過装置（0.45μm以下） | 試料中の微生物を捕集 |
| 流加チオグリコール酸培地（FTM） | 嫌気性菌の培養用（30±2℃・14日間） |
| 大豆-カゼイン消化物液体培地（TSB） | 好気性菌の培養用（20～25℃・14日間） |
| 陽性対照菌（性能確認用） | 培地の性能検証（例：S. aureus, C. sporogenes など） |
ステップ①：試料の準備とろ過
- 滅菌済みの膜ろ過装置を組み立てる。
- 試料（例：注射剤1本）を装置に通して膜フィルターに微生物を捕集。
- 捕集後、フィルターを滅菌ピンセットで2枚に分け、
- 1枚：FTMに入れる（嫌気性）
- 1枚：TSBに入れる（好気性）
ステップ②：培養
| 培地 | 培養条件 |
|---|---|
| FTM | 30 ± 2℃／14日間 |
| TSB | 20～25℃／14日間 |
両培地を別々のインキュベーターで管理。
培養中は、毎日または数日に一度**外観観察（濁り・沈殿など）**を行います。
ステップ③：判定
| 判定基準 | 内容 |
|---|---|
| 合格 | 培地が透明なまま・濁りなしであれば「無菌」 |
| 不合格 | 培地に濁りや微生物の発育兆候があれば「汚染あり」 |
まとめ：膜ろ過法の流れ
cssコピーする編集する[試料準備] → [滅菌ろ過] → [膜を培地に移す] → [14日間培養] → [発育有無を確認]
無菌試験法の具体例2(直接接種法（Direct Inoculation）
目的・適用製剤
- 試料を直接培地に加えて微生物の発育を確認。
- 通常はろ過が難しい製剤に適用されます。
主な対象例：
- 油性注射剤（例：ビタミンE注射）
- 乳剤製剤
- 軟膏剤
- 粉末製剤（凍結乾燥製剤など）
使用材料・培地
| 材料／培地 | 用途 |
|---|---|
| 大豆-カゼイン消化物液体培地（TSB） | 好気性菌用（20～25℃、14日間培養） |
| 流加チオグリコール酸培地（FTM） | 嫌気性菌用（30～35℃、14日間培養） |
| 滅菌済試験容器、シリンジ、注射針など | 試料添加・操作用 |
以下に日本薬局方「4.06 無菌試験（Sterility Test）」において使用される主な培地を、役割ごとに明確にまとめます。
日本薬局方「4.06 無菌試験」で使用される主な培地一覧
【1】主要培地（試験本体で使用）
| 培地名 | 使用目的 | 培養条件 | 備考 |
|---|---|---|---|
| Fluid Thioglycollate Medium（FTM） （チオグリコール酸液体培地） | 主に好気性および通性嫌気性細菌の検出 | 30～35℃、14日間 | 酸化還元指示薬（レサズリン）を含む。培地の透明性が重要。嫌気性にも対応。 |
| Soybean-Casein Digest Medium（SCDM） （大豆－カゼイン消化液体培地） | 真菌（酵母・カビ）および好気性細菌の検出 | 20～25℃、14日間 | 一般的な微生物の広範な検出に対応する汎用培地。pH 7.1±0.2が望ましい。 |
【2】性能確認・培地の適格性試験で使用される標準微生物（参考）
これらの菌株を使用して、上記培地の性能（微生物の発育能）を確認します。
| 微生物名（例） | 使用する培地の一例 |
|---|---|
| Staphylococcus aureus（ATCC 6538） | FTM, SCDM |
| Escherichia coli（ATCC 8739） | FTM, SCDM |
| Bacillus subtilis（ATCC 6633） | FTM |
| Candida albicans（ATCC 10231） | SCDM |
| Aspergillus brasiliensis（ATCC 16404） | SCDM |
| Salmonella Abony（NCTC 6017など） | FTM, SCDM |
【3】補助培地（場合により使用）
これらは日局に明記されてはいませんが、洗浄液の無菌性確認やろ過工程の検証など、試験補助に用いられることがあります：
| 培地名 | 使用例 |
|---|---|
| Tryptic Soy Broth（TSB） | 補助的な増菌やバリデーション用 |
| Buffered Sodium Chloride Peptone Solution | 試料の希釈・洗浄液として使用される場合あり |