ハンディーpHメーター
100μLのサンプル液量があればpH測定可能。精度は型番により0.1, 0.01のタイプがある。
タンパク質の精製条件の検討には、同シリーズの電導率計とともに欠かせない。
96 well plateを使用したレジンのスクリーニングや、特定レジンでの条件検討にも、欠かせないアイテムです。
コンパクトpHメーター・水質計
タグ: Lab-Equip
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![[Bio-Lab] NanoDrop – タンパク質濃度の測定 – ID9517 [2020/02/16]](data:image/png;base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAOYAAABkAQAAAAC6aXHFAAAAAnRSTlMAAHaTzTgAAAAaSURBVEjH7cExAQAAAMKg9U9tDQ+gAACAdwMLuAABXZHjmQAAAABJRU5ErkJggg==)
[Bio-Lab] NanoDrop – タンパク質濃度の測定 – ID9517 [2020/02/16]
少量でOD測定
4μLでUV スペクトルおよび固定波長も測定できます。タンパク質の条件等には、欠かせないアイテムです。
測定上の注意点 : 載せるサンプルの量が4μLと少ないため、乾燥した部屋では直ぐに蒸発して濃縮されます。素早く測定しましょう。
ThermoFisher
NanoDrop 超微量分光光度計および蛍光光度計 -
![[Lab-Equip] SDS-PAGE電気泳動システム – ID9509 [2020/02/16]](data:image/png;base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAGQAAABGAQMAAAAASKMqAAAAA1BMVEUAAACnej3aAAAAAXRSTlMAQObYZgAAAAFiS0dEAIgFHUgAAAAQSURBVBgZYxgFo2AUDCsAAAPUAAEWfRo/AAAAAElFTkSuQmCC)
[Lab-Equip] SDS-PAGE電気泳動システム – ID9509 [2020/02/16]
SDS-PAGEシステム
硫酸ドデシルナトリウムを添加したポリアクリルアミド・ゲル・電気泳動は、タンパク質の純度を分析する最も一般的な方法です。40年前では、自作のゲルを1日かがりで作り、翌日に、さんプルをゲルに載せて、電圧を付加して泳動し、その夕方から染色を一晩し、翌日から脱色するという工程を行なっていました。パイオの世界では、これらの作業もプレキャスト・ゲル(既製品)が登場することで、研究活動の姿は、一変しました。当時の電気泳動槽は、現在の10cm四方のプレキャスト・ゲルよりも2倍よりももっと大きなものもあって、ガラス製で価格も40~50万円と高価でした。
電気泳動を行うには、直流のパワーサプライも必要です。
タンパク質ゲル電気泳動槽システム, ThermoFisher
https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/protein-biology/protein-gel-electrophoresis/protein-gel-electrophoresis-chamber-systems.htmlsds
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![[Bio-Lab] Empty Column, PD-10/自分で充填するスペシャルなPD-10カラムの使い方 – Rapid Purification – カラム精製システムは不要 – ID8584](data:image/png;base64,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)
[Bio-Lab] Empty Column, PD-10/自分で充填するスペシャルなPD-10カラムの使い方 – Rapid Purification – カラム精製システムは不要 – ID8584
安価にカラム精製を行う
Mr.HARIKIRIからお届けするPD-10 Emptyカラムのスペシャルな使い方を紹介します。
僕が行うタンパク質精製の検討では、PD-10カラムを必ず使います．Empty columnが無い場合，プレ充填されているPD-10の中身を抜きます．
短時間でカラム検討を行うために，レジンの充填容量は0.5mL (多くて1mL)にします。吸着と洗浄および溶出の条件を決定するためです．
大学やもしかすると高校でもできるシンプルな実験設備で可能です．カラムには送液ポンプなどは必要ありません．自然落下の速度で実験を行えます．通常設定されるはずのカラムへのポンプ流速での線速より5倍程度高速になりますが、迅速検討としては、問題ありません．
PD-10 Empty Column
PD-10製品には，Emptyとプレ充填品がありますが，プレ充填品は，タンパク質の脱塩に用います．Empty品も同様のレジンをマニュアルで充填すれば，同様に脱塩に使用可能です．僕の場合は，色々なレジンを充填してタンパク質の精製検討に使用します．それは，前述したように，Rapid Purification Methodです．流速は高速です．少量のサンプルでOKです．
用途
- プレ充填のPD-10は，一般使用では，精製したタンパク質やラベル標識タンパク質、例えばAlexa標識物のバッファー交換(脱塩)に使用します．
- はりきりメソッドでは，中身のResinを抜いて、所望するresinを手詰めで充填(0.5mL)しオープンカラムと呼ぶ精製用カラムを作るために使用します．
PD-10, GE Healthcare
https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/0062.htmlレジンの充填
- からのPD-10カラムを準備する
- 上下のフィルターの内，ボトムのみ装着する
- 適量の水をPD-10カラムのトップから投入して，ボトムフィルターを浸潤させる
- PD-10カラムのボトムにキャップを取り付ける
- 改めて0.5mLの水を投入してそのカラム側面から見て水面の位置に印をつける
- 容積比率50%のレジンの懸濁液を準備する
- 水分を取り除いてから、ピペットでレジン懸濁液の1mLを取り，PD-10カラムに投入する
- トップフィルターをPD-10カラムのトップに装着する
- 直径8mmの適当な試験管(例えばマルエムチューブSS-14)のトップを装着したトップティルターに押し当てて，そのまま押し込んでゆき，レジンをパッキングする．
- 50%レジン懸濁液が正確に調製できていれば，0.5mLの時のカラム高となっており，全操作で付けた印の位置にレジンが充填されている．
- 以上で，所望のレジンが充填されたスペシャルPD-10カラムの作成が完了する．
- カラムは，レジンに対して適切な保存剤で冷蔵保存して，検討実験まで保管する．
- 僕の場合は，3M NaCl溶液をPD-10カラムが受けれる容量いっぱいを投入し，自然落下させて，カラムの側面から残り2mL程度になったときに，トップキャップを取り付けて密閉し，最後にボトムキャップを取り付け保管するようにしている．
- スペシャルPD-10カラムを使用する前には，僕の場合，どんなレジンでも，6M 塩酸グアニジン水溶液の6カラムボリューム(6CV)で洗浄し，その後，6CVの10mM NaOHで洗浄します．その後，平衡化バッファの適量で平衡化します．あとは，実験のカラム手順に従って精製条件検討を実施します．
- 精製条件検討については，以下の方法に従います．
- ロードサンプルをロードします．自然落下でロードしていきます．カラムのボトムから出で来るポストロードされたサンプルは，3mL~15mLの遠心管などで分取回収します．
- 洗浄・溶出するための準備したバッファは，6CVでそれぞれ投入して，同よょうに遠心管にて分取回収します．
- 得られたサンプルは分析に供与します．
- 分析は，一般的には，SDS-PAGE分析，A280や260のUV測定，ELISAなどによる特異的分析などがあります．当然，目的のタンパク質に対する特異的な測定方法の確立がなされている必要があります．
- まずは，SDS-PAGEによる全タンパク質と目的タンパク質の純度について分岐せすることが可能です．目的タンパク質の特異的分析方法により定量化することも必要です．
編集履歴
2020/02/04, Mr. Harikiri
2022/10/02,追記:レジンの詰め替え方法とスペシャルPD-10カラム，スペシャルPD-10カラムを用いたタンパク質の精製検討方法． -
![[Bio-Lab] Slide-A-Lyzer™ Dialysis Cassette – タンパク質サンプルのバッファー置換 – 昔は、透析チューブを使っていたが今はバカチョン – ID8580 [2020/09/16]](data:image/png;base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAB4AAAATBAQAAAADyNbQ/AAAAAnRSTlMAAHaTzTgAAAEzSURBVHja7cEBDQAAAMKg909tDwcUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAMCZAXntAAFAgoGwAAAAAElFTkSuQmCC)
[Bio-Lab] Slide-A-Lyzer™ Dialysis Cassette – タンパク質サンプルのバッファー置換 – 昔は、透析チューブを使っていたが今はバカチョン – ID8580 [2020/09/16]
Slide-A-Lyzer
ラボスケール用の透析用膜キットです。昔は、ロールの透析チューブを使っていました。必要な長さにハサミで切り、熱湯で保護剤のグリセリンを洗い流して、精製水で洗って、片方を結び閉じます。その後、サンプルをロートで、透析チューブに流し入れます。最後に、少し上に空気を入れた状態で、上を結び閉じます。その後、透析バッファーの入ったビーカーに投入して撹拌します。
この準備を端折りたいのであれば、この「Slide-A-Lyzer」を使うことです。
透析膜・カセットシステムの用途
現在では、Slide-A-Lyzerが簡単な操作で透析が可能なため、良く使われます。
- 精製タンパク質の精製途中で、クロマト精製をする前の準備としてバッファー組成を整えるとき
- 最終的に得られた精製サンプルを、動物試験や細胞を使ったアッセイに使用できるように、生体に優しいバッファー組成に整えるとき
昔は透析チューブを使っていた
旧研究者は、ロールになった透析膜を必要な長さにはさみで切って、煮沸して保存剤であるグリセロールを取り除くと共に、柔らかくした後、精製水でよくもく洗いして透析チューブにして使用していました。透析チューブは、まず、一方の端を一回結びします。もう一方から、ロートを使ってサンプルを流し込みます。その後、その一方の端を少し空気を入れて結び、透析チューブとします。
希釈率
バッファー交換とは、1,000倍希釈を目標とします。
- 1,000倍以上を目指す
- サンプル量と透析バッファーの液量をもとに計算する
操作方法
- サンプルをカセットに注射針と注射筒を使って注入
- 希釈率から必要な液量の透析バッファーを準備する
- 透析バッファーにカセットを投入して、スターラーバーにより撹拌する
- 本来は、カセット内の液と透析バッファーをサンプリングして電気伝導度を測定して、透析操作の完了時期を確認するのが良いが、一般的には、1回の透析バッファーでの操作の場合、一晩を目安にする
- 2回目の新しい透析バッファーでの操作を実施する場合は、1回目を5時間程度、2回目を一晩とする
- 透析操作が完了したカセットを取り出し、注射器でサンプルを取り出す
メリット・デメリット
ラボでは、(1)透析チューブやSlide-A-Lyzerを使ってバッファー交換することが多いですが、量が多かったり、タンパク質濃度を高めたかったりする場合、(2)クロスフローろ過膜(TFF)システムを使います。以下、比較してみましょう。
透析チューブ / Side-A-Lyzer TFF System ラボ用として簡単に透析が実施できる システム構築が必要 元のサンプルの液量より増える 濃縮が可能 透析用バッファーの量が多い 透析用バッファーの量は、理論上、サンプルの8倍量で1,000倍希釈を達成できる 膜の内外の透過が平衡状態となったときが、最終的な希釈率となるが、その平衡状態を知る方法は、サンプリングして、電動度などを測定するしかない ろ過された液量から、簡単に希釈率を計算できる Slide-A-Lyzer™ Dialysis Cassette
https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/protein-biology/protein-purification-isolation/protein-dialysis-desalting-concentration/dialysis-products/slide-a-lyzer-dialysis-cassettes.html編集履歴
2020/02/04 HARIKIRI(MR) 2021/03/27 TFFシステムとの比較
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