カテゴリー: BIOLOGICS

  • [rAAV] rAAVの従来からの精製方法 (PEG沈殿、超遠心), 2010 – ID2417 [2019/09/26]

    [rAAV] rAAVの従来からの精製方法 (PEG沈殿、超遠心), 2010 – ID2417 [2019/09/26]

    rAAV vectorの精製方法

    沈澱化と遠心分離、および超遠心機を使用する従来からのAAV精製方法を以下に2種類を示しました。工業化するには、超遠心機の使用は不適切です。何か代替できる方法に切り替える検討が工業化には必要です。具体的には、クロマトグラフィへの切り替えです。適切な吸着担体と詳細な条件検討により工業化を進める必要があります。

    Standard purificationOptimized purification
    TransfectionTransfection
    ⬇︎⬇︎

    Centrifugation (Cell Pellet by 2,500g x 10min)

    Same as left
    ⬇︎⬇︎
    Freeze-thaw Lysis (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM MgCl2, pH8.0)Same as left
    ⬇︎⬇︎
    cfg (2,500g x 10min)Same sa left
    ⬇︎⬇︎
    cfg-supcfg-sup + culture supernatant
    ⬇︎⬇︎
    ⬇︎8% PEG, 0,5M NaCl by adding 40% PEG 8000, 2.5M NaCl, 2h on ice    
    ⬇︎⬇︎
    ⬇︎cfg (2,500g x 30min)
    ⬇︎⬇︎
    ⬇︎cfg-ppt
    ⬇︎⬇︎
    ⬇︎

    Resuspend

    (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM MgCl2, pH8.0)

    ⬇︎⬇︎
    DNase Treatment (100U/mL, 1h, 37’c)Same as left
    ⬇︎⬇︎
    Ultracentrifugation (104,000g x 24h, 20’c)Same as left
    ⬇︎⬇︎
    Dialysis vs PBS (overnight)Same as left
    ⬇︎⬇︎
    Ultracentrifugation (182,000g x 24h, 20’c)Same as left

    まとめ

    上記表には,文献の精製手順の比較により,その詳細を示した.その内のOptimized Methodについて概略フローを,以下に示した.従来法と異なる点は,PEG8000による沈殿化である.

    Culture -> Cell -> Lysate -> Clarification -> Polyethylene Glycol (PEG) 8000 -> Ultracentrifugation -> Dialysis ->Ultracentrifugation

    注) UltracentrifugationをGradientと業界では読んでいるようで,おそよく塩化セシウムの濃度勾配を使用することが,それをGradientと称しているものと推察される.

    High AAV vector purity results in serotype- and tissue-independent enhancement of transduction efficiency

    編集履歴

    2019/09/26, Mr.HARIKIRI
    2023/10/25, 修正(まとめ)

  • 気になる企業 – Creative Biolabs Inc. はcGMP製造もできるCRO – ID2413 [2020/05/21]

    気になる企業 – Creative Biolabs Inc. はcGMP製造もできるCRO – ID2413 [2020/05/21]

    Creative BioLabs

    Creative BioLabs Incはアメリカに本社を置き.イギリスとドイツにも拠点を持つ.

    前身は2006に設立、2015年にfoundされました。創薬初期のステージで使用する技術としてPhage display,ハイブリドーマ作成などの実施が可能である.カスタムバイオテクノロジーと製薬サービスを提供する.創薬後期のステージで使用するヒト化技術,親和性成熟技術など,高度な分析技術を必要とするサービスも提供できる.を作製できる抗体は,研究用,診断用,治療用の提供が可能.cGMPによるモノクローナル抗体製造は1,000L規模で可能.100名の擁するContract Research Organization (CRO)です.。format変換, identification, affinity maturation, humanizationなどresearch段階での技術は高く、できることは沢山の説明はあります。

    https://www.creative-biolabs.com/immuno-oncology/cell-culture-process-development.htm

    Comprehensive service portfolio including antibody

    • reformatting
      • Fab
      • F(ab)’2
      • scFv
      • VHH
      • minibodies
      • bispecific
    • production
    • epitope binning and mapping
      • identify the epitope
      • elucidate the mechanism
      • strengthen intellectual property
    • humanization
      • variety of methods and toolkits
    • affinity maturation
      • high-throughput phage library
    • affinity measurement
      • kinetic properties
    • sequence liability identification
    • immunogenicity prediction
      • in vitro screening (Sensitive immunogenicity Assessment Technology; SIAT)
      • in vivo screening

    cGMP manufacturing

    Development

    • Culture media screening and adaptation
    • Material preparation for different stages of projects, such as transient and pool material production
    • Various bioreactors available
    • Productivity and/or quality optimization
    • 細胞培養プロセス開発
      • クローン選択から培養条件の最適化
      • 培養開発プラットフォーム
      • 100名以上の専門スタッフ
    • 1L~2,000L cGMP製造
      • Wave
      • Vi-cell
      • YSI
      • Cedex Bio HT
      • Novaflex
      • Bioprofile 400
      • BGA
      • Terumo tubing welder
      • Osmometer
      • Steril tubing
      • welder and sealer
      • Integrity tester
      • Media prep systems for lab & pilot plant

    Product Quality Optimization

    • Aggregation control
    • Charge variant control
    • Glycosylation optimization
    • Sialic acid content optimization
    • ADCC/CDC activity optimization

    Late stage cell culture process development

    • Technical transfer
    • Commercial process development service
    • Process characterization and validation

    IND-enabling cell culture activities

    • Clone selection and process optimization
    • Scale-up and toxicological material production
    • Technical transfer for cGMP production for worldwide IND submissions

    Perfusion and concentrated fed-batch platform

    • High viable cell density and viability
    • For perfusion: long term steady-state operation and stable productivity and quality
    • For concentrated fed-batch: quick adoption from fed-batch with high harvest product titer and improved quality
    • From bench top scale-down model to cGMP anufacturing production

    GENE THERAPY DEVELOPMENT

    Adeno-associated Virus Vector

    様々なHost Cellを提供している

    YB2 / 0細胞株 : フコース含有率が低いラット骨髄腫細胞株

    rcAAVの測定

    委託で測定を受けてくれる。

    Replication-component AAV testing

    Replication-incompetent vector particles derived from AAV (adeno-associated virus) have been shown to mediate transfer and expression of heterologous genes (transgenes) into a variety of cells in vivo and in vitro. It has tremendous potential in both research and therapeutic applications.

    https://www.creative-biogene.com/Services/Custom-Viral-Service/Replication-Competent-AAV-Testing.html
    編集履歴
    2019/09/26 はりきり(Mr)
    2020/05/21 追記(詳細サービス)
    2020/11/24 追記(rcAAV測定)

    以上

  • [rAAV-Lab] AAVの発現・精製から動物試験までの手順をNovagenのAAV精製キット説明書から知る – ID2407 [2019/09/26]

    [rAAV-Lab] AAVの発現・精製から動物試験までの手順をNovagenのAAV精製キット説明書から知る – ID2407 [2019/09/26]

    アイキャッチ by DALL:E3

    はじめに

    AAV vectorを精製するNovagenのキットの紹介です。私たち研究者のナレッジにしてしまいしょう.

    手順は,(1)前培養、(2)トランスフェクシ,さらに(3)後培養(AAV増殖)

    (4)ハーベトス,(5)当該キットによる精製,(6)100kDaのUF膜を用いた濃縮,および(7)除菌ろ過で精製サンプル取得というのが,AAV vector取得の手順です.

    その後,目的のDNAが取得できているか評価するためには(8)AAV vectorからDNA抽出、(9)PCRによる目的遺伝子の確認、(10)動物への投与に至ります.

    Purification of Adeno-associated Virus (AAV) Vectors Using Norgen’s AAV Purification Kit
    NORGEN Biotek Corp.

    AAV Production

    1. 培養条件: HEK細胞と濃度,培養スケール,培地組成
      • Cell seed 10e7 HEK293 cells/15cm plates,
      • DMEM, 10% FBS, 2mM L-glutamine,
      • penicillin/streptomycin
    2. トランスフェクション: 培養1日後に細胞に封入させる遺伝子(pDNA)
      • Transfection (plasmids: rep/cap, genome, helper, containing the inverted terminal repeat (ITR) )after one day
    3. 後培養: トランスフェクション1日後に培地交換
      • Change media after one day, DMEM+L-glutamine (no serum)
    4. ハーベスト: 上清回収は後培養後3~6日
      • Harvest after 3-6days

    AAV Purification

    5. AAVの精製: AAVを増殖させた培養液を用いて精製します.

    • For in vitro and vivo, 300mL of AAV9 containing media
    • 33mL fo 300mL ->Norgen AAV purification kit -> eluate (9.9mL) ->

    6. 濃縮: 遠心型のUF膜を用いた濃縮

    • concentration 100kDa centrifugal filter unit Amicon Ultra-4
    • Collection: 0.5mL

    7. 除菌ろ過 (0.22μm)

    • 吸着が少ないタイプを使用(例えばDurapore)

    DNA Extraction

    8. DNAの抽出:

    • Sample,5μL + 4μL(2 units) DNase (Norgen’s Kit) ->
    • Incubation 37’c for 30min ->
    • EDTA add final 5mM ->
    • Heating 90’c for 20min (inactivation DNase)

    qPCR Quantification

    9. qPCRによる目的遺伝子の確認

    In vitro Transduction with AAV

    10. 動物投与試験: In vivo administration of AAV

    • Purified sample (Concentrated by UF 100kDa)
    • Dilution to 4 x 10e11/0.5mL
    • 2 divided volume
    • 2 mice C57BL/6, ~1 x 10e11/mice
    • mice tissues harvesting 1m post transduction

    文献

    NORGEN: Purification of Aden-associated Virus (AAV Vectors Using  Norgen’s AAV Purification Kit

    編集履歴

    2019/09/26, Mr.HARIKIRI
    2023/11/07, 文言整備

  • 気になる企業 – Nexredge – バイオ医薬品の開発など技術支援するサービスを提供する – [2023/11/07]

    気になる企業 – Nexredge – バイオ医薬品の開発など技術支援するサービスを提供する – [2023/11/07]

    Nexredge社

    Nexredge(ネクスレッジ)社は,バイオ医薬品の開発など技術支援するサービスを提供する.

    https://www.nexredge.co.jp/

    創立 : 2015年,東京中央区日本橋

    1. 生物学的製剤
    2. 再生医療等製品
    3. GMP等の薬事規制に適合した開発支援
    4. 工業化支援
    5. MF国内管理人(*1)
    6. 医薬品製造業国内代理人

    *1

    MF国内代理人とは、

    外国の原薬等製造業者が原薬等登録原簿(Master File; MF)に登録する際に、日本国内に住所を有する事務を行う者のことです.MF国内代理人は、登録申請書や変更登録申請書などの書類をPMDAに提出したり、PMDAや厚生労働省との連絡を行ったりする役割を担います.MF国内代理人は、登録者からの要望に基づいて、原薬等国内管理人の名称や住所などの情報を公表することもできます.MF国内代理人は、外国製造業者の認定(Accreditation of Foreign manufacturers; AFM*2)とは異なる制度であり、MF登録に関する業務のみを行います。

    原薬等登録原簿(MF)の公示について | 独立行政法人 医薬品医療機器総合機構 (pmda.go.jp)

    *2

    AFMとは、

    Accreditation of Foreign Manufacturersの略で、医薬品等外国製造業者の認定を意味します.医薬品医療機器法に基づき、日本に輸出される医薬品や医薬部外品を製造する外国の業者は、厚生労働大臣の認定を受ける必要があります.認定は、製造所ごとに区分され、有効期間は5年です.認定を受けるためには、申請書や製造所の構造設備に関する資料を提出し、PMDAが行う調査に合格する必要があります.認定の手続きや必要な書類については、こちらをご覧ください。

    https://www.pmda.go.jp/review-services/drug-reviews/foreign-mfr/0003.html

    編集履歴

    2019/09/26, Mr.HARIKIRI
    2023/11/07, 追記(事業内容9

  • [Bio-Equip] Thermo Fisher 「CaptureSelect」 – AAV1~AAXをキャプチャリングできるAffinity resin – [2019/09/21]

    [Bio-Equip] Thermo Fisher 「CaptureSelect」 – AAV1~AAXをキャプチャリングできるAffinity resin – [2019/09/21]

    ID2320

    CaptureSelect

    CaptureSelectは、複数種類のアデノ随伴ウイルス(AAV)に対応するアフィニティ精製用の樹脂(resin)です。

    抗体医薬での精製方法がプラットフォーム化されているように、遺伝子治療薬のデリバリーシステムであるAAVの精製に欠かせない担体です。

    CaptureSelectは、抗体医薬のキャプチャリングとして使用するProtein Aレジンに相当するステップに使用します。

    動画による説明 : CaptureSelect

    ラクダ抗体を利用したAffinity Resin技術

    Binding Capacity: >10e13~10e14

    ウイルスベクター精製用 POROS CaptureSelect 樹脂および試薬 , より

    再生処理

    吸着・溶出してAAVを精製した後は、レジンの再生処理が必要です。十分な洗浄を行って、再利用することで実製造でのコスト低減が可能でなければなりません。0.5M NaOHなどのアルカリ再生処理が可能であることに越したことはありませんが、リガンドがタンパク質なのでアルカリ洗浄には対応していないようです。3M GuHClでの再生処理が可能であるので、取り敢えずは合格というところでしょうか。本当はアルカリ耐性が欲しいところですが。

    • Resistance: 4M Ures, 3M GuHCl

    文献

    1) データシート

    Enabling technologies for efficient downstream processing of biosimilars, vaccines and gene therapy vectors:

    https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/latin-america/promotions/pdf/bioproducao/12-Shelly-Parra-Efficient-downstream-processing-of-biosimilars-vaccines.pdf

    編集履歴

    2019/09/21, Mr.Harikiri
    2021/11/02,追記(解説、再生処理)

  • [Bio-Edu] ラクダが持っている抗体は、一般的なIgGとは異なる構造の重鎖抗体 – ID2300 [2019/09/21]

    [Bio-Edu] ラクダが持っている抗体は、一般的なIgGとは異なる構造の重鎖抗体 – ID2300 [2019/09/21]

    ラクダの重鎖抗体

    一般的にラクダ抗体は、通常の抗体IgGとは異なる構造の重鎖抗体と呼ばれる少し分子量が小さい抗体をある比率で持っている。

    特にラクダ科のアルパカでは抗体の内50%は、この重鎖抗体を占めるという。結合ドメインは一般的な抗体では2本鎖なので2個のドメインだが、重鎖抗体は、軽鎖がないので1個のドメインで結合ドメインとして機能する。

    重鎖抗体の構造

    重鎖抗体の形状は、一般的なIgGから軽鎖(CL-VL)が外れて、更に重鎖のCH1ドメインが欠落したY字構造である。

    分子量は150kDa(各ドメインの分子量を単純割合で12.5kDaとする)から軽鎖の50kDa(2x(2×12.5)kDa)を引いて100kDaとなり、更にCH1の2×12.5kDa = 25kDaを引いて、75kDaであると簡単に推定される。

    • IgGの分子量 : 150kDa
    • 重鎖抗体の分子量 : 75kDa

    nanobody/VHH抗体

    重鎖抗体を産業上の利用を容易にする目的で、可変領域のみに改変したものを、VHH抗体又はNanobodyと呼ぶ.

    • nanobodyの分子量 : 12.5kDa(上記の計算による理論値)

    一般的な抗体(IgG)では、2個のドメイン(Y字の1の手に2つの指:(VHとVL)で抗原に結合する。

    ラクダ抗体では、軽鎖がないので、1個のドメイン(VH)で抗原と結合できるシンプルな構造となっているため、産業利用が進められてきた。

    最近では、更に抗原結合部位のみ、即ち、VHのみを使った研究が多く進められている。

    遺伝子治療などのバイオ医薬品(バイオロジクス)の開発には、欠かせないアフィニティ(Affinity)として、nanobodyが製品がされている(参照)。

    ラクダ抗体の産業利用

    参考文献

    アルパカが持つ不思議な抗体の魅力: https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9604/9604_index.pdf

    編集履歴

    2020/04/28 文言整備、追記(産業利用製品)
    2021/11/02 追記(アイキャッチ画像変更)

  • [rAAV-DSP] AVB Sepharose High Performance – ID2292 [2019/09/21]

    [rAAV-DSP] AVB Sepharose High Performance – ID2292 [2019/09/21]

    AVB Sepharoseの概要

    吸着可能なAAVの血清型

    • AAV1
    • AAV2
    • AAV3
    • AAV5

    Resinの特性

    • Binding Capacity: >10e12 vg/mL of resin
    • 組換え酵母で作られた蛋白質(14kDa)
    • Resingの安定性: 文献

    概要

    低pH溶出と比較して、高pH溶出および0.5または1.0 Mアルギニンでは、収量は低下したが、アルギニンを含む高pH溶出バッファーは、AAV純度が高くなることを示しており(260/280)、高pH溶出は、低pHでは敏感なウイルスを精製するための代替手段となる。

    Elution bufferの種類

    • EB1 0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl, pH 2.5
    • EB2 0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl, 0.5 M arginine, pH 10.0
    • EB5 20 mM Tris-HCl, 2.5 M MgCl2, pH 8.0
    • EB6 0.1 mM sodium acetate, 2.5 M MgCl2, pH 2.5
    • EB7 0.1 M glycine, 0.5 M NaCl, pH 3.0
    • EB8 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 0.5 M arginine, pH 10.8
    • EB9 1.5 M NaCl, 0.02% (w/v) TweenTM 80, 50% (v/v) ethylene glycol, 20 mM L-histidine, 20 mM CaCl2, pH 6.
    Load Sample/Column information
    • カラム : Tricorn 5/50 (1 mL column volume)
    • レジン : AVB Sepharose High Performance, 1 mL
    • 平衡化バッファ : 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0
    • ロードサンプル : rAAV, 7x10e10 vg/mL x 20 = 1.4x10e12 in Equilibration buffer / 0.2 μm filter, 20 mL
    • 線流速 : 153 cm/h
    • 溶出液評価: AAV ELISA測定
    Study 1
    1. 1st Elution buffer: EB1(recovery 120% of 130% total recovered virus: batch wiseと結果が真逆)
    2. 2nd Elution buffer: EB8 (recovery 6%)
    Study 2
    • Elution buffer : EB3(recovery 72% of 73% total recovered virus
    Study 3
    • Elution buffer : 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCVl, 1.0M arginine, pH10.8 (recovery 62% of 64% total recovered virus)

    AVB SepharoseTM High Performance, GE Healthcare

    https://gels.yilimart.com/Assets/Images/doc/file/28411211_DATAFILE_01.PDF

    編集履歴

    2019/09/21, Mr.HARIKIRI

  • [Bio-Equip] Bio Process用フィルター製品 – △ID2280 [2019/09/20]

    [Bio-Equip] Bio Process用フィルター製品 – △ID2280 [2019/09/20]

    はじめに

    レジン充填したカラムを用いるタンパク質精製は,一般的で主要な精製方法です.膜メーカーからレジンに代わる単体としてメンブラン製品にリガンドを付加することで,精製基材をラインナップしています.メンブラン・クロマト基材はレジン充填カラムと比較して処理流速を高めることが可能でプロセス時間を短縮に寄与します.以下には,3MとPallのメンブラン・クロマト基材を紹介します.

    3Mのメンブランクロマト基材

    Zeta Plus EXT SP

    膜型のSP(陽イオン交換)レジンです.

    https://www.lenntech.com/Data-sheets/Zeta-Plus-EXT-SP-Series-Filters-L.pdf

    3M Zeta Plus SP Series Filters, Regulatory Support File: https://multimedia.3m.com/mws/media/1238785O/3m-zeta-plus-zb-series-filters.pdf

    Emphases AEX

    バイオロジクスのプロダクション培養後のハーベス工程に使用できる。ハーベストでは、細胞の除去が最低限の目的であるものの、培養状態によっては、細胞由来の不純物が多く含まれる場合がある。AEXのモードを持つEmphases AEXは、細胞由来のHCP, HCDを効率よく吸着除去することが可能である。

    3M Biopharmaceutical Innovation. Pure and simple, 3M Emphaze AEX Hybrid Purifier: https://multimedia.3m.com/mws/media/1021045O/3m-emphaze-aex-hybrid-purifier.pdf

    Pallのメンブランクロマト基材

    Mustang Q

    • 膜タイプの陰イオン交換機材
    • レジンでカラムを立てるよりも30倍以上の高速処理

    Mustang® Q XT 陰イオン交換・クロマトグラフィーカプセル

    https://products.pall.jp/jp/ja/biotech/chromatography/membranes/zidgri78lhe

    フィルター関連記事

    編集履歴

    2019/09/20, MR.HARIKIRI
    2023/11/10, 文言整備(はじめに,を追加)

  • [rAAV-Edu] POROS CaptureSelect (AAV精製 resin) の性能とAEXによるfull/emptyの分離 – ID2271 [2019/09/18]

    [rAAV-Edu] POROS CaptureSelect (AAV精製 resin) の性能とAEXによるfull/emptyの分離 – ID2271 [2019/09/18]

    AAVX Resinの特徴

    複数の血清型AAVを吸着

    POROSは、Thermo Fisherのブランドです。以前は独立したメカーでしたが、M&Aで傘下になっています。POROSプランドでAAVをキャプチャー精製する製品は、CaptureSelect(TM)というものがあります、そのラインナップは、AAV8, AAV9, AAVXです。AAVXレジンは特別で、血清型の違いに関係なく高い吸着性能を持っています。すなわち、1つのレジンで精製方法をプラットフォーム化することが可能です。

    これは、抗体医薬で使用されるていProtein Aレジンと同様の位置付けに等しい将来性のあるレジンです。

    • Binding Capacity: >10e14 (vg/mL)

    CaptureSelectとは

    ラクダの重鎖抗体を応用したnonobody技術により、AAVに対する結合性のあるLigandをPorosレジンにカップリングした製品である。

    AAVXレジンの吸着性能をバッチ法で評価

    CaptureSelectのラインナップの内、AAVXは殆どのAAVの血清型に対して高い親和性を有している。

    AAVXレジンと各血清型のAAV (培養、抽出、清澄化したサンプル液)を混合し、チューブ内で10分間の吸着反応させる系で、溶出バッファー(0.1M citric acid, pH2)により回収した溶出液をqPCRでvgを測定し、その回収率を評価している。

    その結果、AAV1(99.63%), AAV2(97.8%), AAV2_HSPG(98.33%), AAV4(98.05%), AAV5(97.88%), AAV6(97.45%), AAV6.2(98.93%), AAV7(98.37), AAV8(97.76%), AAVrh10(96.28%), AAVrh32.33(99.29%), AAV9PHPB(98.51%), AAV7m8(98.39%)、と多数の血清型のAAVを高い効率で吸着・溶出が可能であることが示されている。

    AAVXレジンとその他のレジンとの比較

    比較に使用したレジン

    1. AVB: GE Healthcare
    2. Poros AAV8
    3. Poros AAV9
    4. Poros AAVX

    その結果、下図のように、AABレジンでは、AAV8, AAV9、AAV10を吸着できるものの60%から80%程度の吸着能しかないことが示されている。AABレジンの製品仕様ではAAV1, AAV2, AAV3及びAAV5で使用できるとあることから、当然の結果である。

    AAV2のemptyとfullのHQカラムによる分離

    CsCl2密度勾配の超遠心処理で精製した遺伝子が封入されていないempty AAVと封入されているfull AAVを混和して、AEXカラムであるPOSOR HQカラムにアプライしてクロマトグラフィーを行うと、emptyとfullを分離できる。

    • emptyの溶出位置: 10mS/cm
    • fullの溶出位置: 12mS/cm

    参考文献

    Overcoming downstream purification challenges for viral vector manufacturing: enabling advancement of gene therapies in the clinic: https://pdfs.semanticscholar.org/935c/2e2ee928ba35ebbe22bf43c2e5e1ebe1a4f0.pdf

    Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0166093406004022?via%3Dihub

    Review – ラクダが持つ不思議な抗体の魅力:https://harikiri.diskstation.me/myblog/biologics/2300/

    編集履歴

    2019/09/18, Mr. Harikiri
    2021/11/02,記載整備