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カテゴリー: BIOLOGICS

  • [Data Link] rAAV vector/遺伝子治療薬に関する文献調査 [~2020/08/24] – ID2033 [2019/09/13]

    [Data Link] rAAV vector/遺伝子治療薬に関する文献調査 [~2020/08/24] – ID2033 [2019/09/13]

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    Key Considerations in Gene Therapy Manufacturing for Commercialization, 2018 – Cell Culture DISH

    (1) Phase 1 Clinical Study: 18 month (breakthrough), Several months (Traditional BLA)
    (2) Decision on BT Application: – (BT), N/A (TD)
    (3) EOP 1 Meeting Confirms BT Therapy Study: 6 months (BT), N/A (TD)
    (4) Phase 2/3 Clinical Study: 24 months (BT), P2:Several Mo. to 2y and P3:1 to 4y (TD)
    (5) EOP 3/Pre-NDA/Pre-BLA Submission Meeting: -, –
    (6) NDA/BLA Preparation: 6months(BT), – (TD)
    (7) NDA/BLA Review: 6months(BT), 10months(TD)
    (8) Development Timeline: ~5.2y (BT), ~7.4y(TD)

    ・Plasmid Manufacturing : Fermentation→Plasmid Recovery→Purification→Fromulatiion→(Transfect)
    ・Viral Manufacturing: Expand→(Transfect)→Clarification→Concentration→Purifiation→Sterilization→(Activate & Modify)
    ・Cell Processing: Isolate & Enrich→(Activate & Modify)→Expand→Harvest→Formulation

    Viruses used: Retrovirus, Lentivirus, AAV and Adenovirus.

    iCELLis Nano, 500の情報、Allegro single use bioreactor

    DSP platform : 3 chromatography system.

    Transfection System

    Analytical Method

    https://cellculturedish.com/wp-content/uploads/2018/09/Key-Considerations-Gen-Therapy-Manufacturing-Commercialization.pdf

    Methods Matter — Standard Production Platforms For Recombinant AAV Can Produce Chemically And Functionally Distinct Vectors, 2019 –

    https://www.biorxiv.org/content/10.1101/640169v2.full.pdf

    Pharmacology of Recombinant Adeno-associated Virus Production, 2018 – mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Mar 16; 8: 166-180 –

    ベクターが大きいとFull率は低下する。トリプル-インフェクションでは、更にfull率は低下する。

    rAAV2-FIX vectors in A549-derived producer cell line
    (1) full particels : 8%~13%

    rAAV2 vectors inHEK293 cells
    (1) full particles : up to 74% for a 3.4kb-vector, 40%~45% for a 4.2kb-vector
    (2) full particles: 8% and 10%~12% by triple-transfection

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5908265/

    Manufacturing of viral vectors for gene therapy: part I. Upstream processing, 2014 – Pharmaceutical BIOPROCESSING –


    https://www.openaccessjournals.com/articles/manufacturing-of-viral-vectors-for-gene-therapy-part-i-upstream-processing.pdf

    Pharmacology of Recombinant Adeno-associated Virus Production, 2018

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5908265/

    In Vitro Packaging of Adeno-Associated Virus DNA ,1998

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC109794/

    Pharmacology of Recombinant Adeno-associated Virus Production
    Magalie Penaud-Budloo, Achille François, Nat    , 2018

    Next-generation AAV vectors—do not judge a virus (only) by its cover , 2019, AviGen GmbH source – ベクター開発、発現制御、プロモーター

    CATAPULT, UKにおける遺伝子治療、Cell Therapy, Viral Vectors, 製造・分析、クリニカル、Webinar開催など、網羅的に関係する情報の宝庫 soruce

    Production of Recombinant Adeno-associated Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector, 2018

    A scalable method for the production of high-titer and high-quality adeno-associated type 9 vectors using the HSV platform, 2016

    Enhancement of Adeno-Associated Virus Infection by Mobilizing Capsids into and Out of the Nucleolus
    , (2009) AAV2の感染時、核小体への導入効率の向上薬剤(MG132とHU)

    Scalable Production of AAV Vectors in Orbitally Shaken HEK293 Cells (2019)

    Quantification of Adeno-Associated Virus Particles and Empty Capsids by Optical Density Measurement (2003)

    特許公報(B2)_アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型９の配列、それを含むベクターおよびその使用、配列が特許になっている。

    特許公報(B2)_アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型８の配列

    AAVベクターの製造・品質に関するリフレクションペーパー (pmda

    https://www.pmda.go.jp/files/000221591.pdf

    平成29年度我が国におけるデータ駆動型社会に係る基盤整備 「根本治療の実現」に向けた適切な支援のあり方の調査

    https://www.meti.go.jp/meti_lib/report/H29FY/000111.pdf

    遺伝子組換え生物に係る
    法規制の動向について
    独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター (Biological Resource Center, NITE ; NBRC)

    https://www.kansai.meti.go.jp/2-4bio/kansai_smartcell/180925_4.pdf

    バイオ戦略の策定に向けた検討
    バイオテクノロジーによるイノベーションを通じて実現を目指す 経済社会像(ビジョン)

    https://www8.cao.go.jp/cstp/tyousakai/bio/1kai/siryo4.pdf

    遺伝子治療とゲノム編集治療の 研究開発の現状と課題
    Since 1874

    https://www.kantei.go.jp/jp/singi/kenkouiryou/genome/advisory_board/dai4/siryou4-1.pdf

    ウイルスを基盤とした遺伝子治療薬の臨床開発の
    現状と今後の展望

    https://www.jstage.jst.go.jp/article/dds/34/2/34_99/_pdf/-char/ja

    ex vivo遺伝子治療用製品の品質管理戦略の留意点

    Points to consider on quality control strategy for ex vivo gene therapy products

    http://jsgt.jp/CLINICAL_STUDY/2018-1pmda.pdf

    脳卒中に対する遺伝子治療の現状と将来

    http://cbfm.mtpro.jp/journal2/contents/assets/016030167.pdf

    AAV を利用した遺伝子治療
    小 澤 敬 也

    http://jsv.umin.jp/journal/v57-1pdf/virus57-1_047-056.pdf

    アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる遺伝子治療　(2003)

    AAP (Assembly Activating Proteins)

    A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

    生物多様性影響評価書

    科学研究費助成事業 研究成果報告書

    適正製造規範に適合する簡易精製が可能な次世代AAVベクターの開発

    PMDA

    厚生労働省精神・神経疾患研究委託費

    遺伝性筋疾患に対する 分子治療の基盤研究

    病原体検出マニュアル　(国立感染実用研究所)

  • [Bio-rAAV] 遺伝⼦治療における代表的な委託製造会社 (CMO) – ID1881 [2021/02/08]

    [Bio-rAAV] 遺伝⼦治療における代表的な委託製造会社 (CMO) – ID1881 [2021/02/08]

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    rAAV vectorを製造するCMOリスト

    企業サイトサイト製造サイト特徴関係
    WuXi Advanced TherapiesUS1,000L遺伝子治療医薬品の開発と製造、AAV vector suspension platformWuXi AppTec
    CatalentUS, EU,footprint(400,000ft23)10 cGMP clinical suites, 200L, 400L, 800L, 2 x iCELLis 500, 24 HYPERStack 26/CS10
    10 cGMP Commercial Campus (including fill/finish)    		>バイオ医薬品30年の経験、20クライアント, AAV vector, 60 prgrampOriginal
    BioRelianceRockville, Maryland, USA & IrelandViral/Cell banking to fill finish (2,000 v/day), Secure Biostorageウイルス・クリアランス試験、Carsbadとの遺伝子治療用製品の開発と製造BioRelianceとCarlsbad(20+ years)がサービスする, California,親会社: Millipore-SIGMA-Merck
    Oxford BiomedicaUKUK(1,200m2, SUB 200L, BSL-C3 Lab)遺伝子治療医医薬品、PCL(*1)、Gene TherapySANOFI, GSK, NOVARTIS
    Broucher
    Lonza Pharma & BiotechUSHuston,Portsmouth, Holland, Singapore, Japan(Nikon)バイオロジクス、遺伝子治療医薬品、AAV, HSV, NDV,(Anc-AAV)Original
    NovasepEUバイオロジクス、遺伝子治療医薬品、Adeno, Lenti, HSV, VSV, VEEV2021/01/15 ThermoFisherによる買収
    MolMedEU
    YposKesiFR~500L
    ~200L SUB, 24 x Cell Factory 10    		遺伝子治療医薬品2016, Genenthonからスピンオフ
    TAKARA BIOJP遺伝子治療医薬品
    IDファーマJPiPS, CRISPR-Cas9elixirgen therapeutics
    遺伝子治療研究所 (Gene Therapy Research Institution)JP遺伝子治療医薬品
    vigene biosciences (2012~)Rockville, MarylandCellSTACK; iCELLis, 50~500L bioreactor, HEK293Plasmid製造、小規模AAVから臨床(GMP)まで、AAV、レンチウイルスOriginal (Small company)
    patheonby ThermoFisher
    詳細    		Alachua, FL
    Cambridge, MA
    Lexington, MA
    Plainville, MA,
    US    		50L~2000L
    		Florida Bio (2006~2016), 100 clients, 500 product released14+years, Brammer BioがPatheonに統合
    VIROVEK
    詳細    		Hayward, CA, USSF9/vaculovirus1e13 vg/$3,500 ~ >1e15 vg/$119.900 価格表あり2006~

    https://www.kantei.go.jp/jp/singi/kenkouiryou/genome/advisory_board/dai5/siryou4-2-8.pdf

    Merck Darmstadtは、Millipore (2010), Sigma-Aldrich(2015)を傘下に収めて

    https://ja.wikipedia.org/wiki/メルク_(ドイツ)

    編集履歴

    2020/07/17 Mr.Harikiri
2021/02/08 追記 (ThermoFisherによるnovasepの買収)
  • [Bio-Edu] バイオロジクスの研究開発から商用製造

    [Bio-Edu] バイオロジクスの研究開発から商用製造

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    序

    作用機序から目的バイオロジクス(モノ)を探索し、発現系構築・精製法検討を進めながら、試験管レベルでのヒットを得る。

    モノの培養・精製による取得と並行して、動物での薬理的効果を確認しながら、製造スケールは徐々に大きくしていく。最終的はに、商用スケールを目指しているためだ。

    以下、もう少し詳しくその流れを見ていこう。

    基礎的検討 (Stage 0)

    薬を世の中に出すことは大変な労力と時間およびお金がかかります。バイオロジクスでいうと、病気に効きそうな蛋白質(など)が特定され、そこから5年〜7年程度かけて基礎的検討が行われ、やがて研究成果もでてきつつ、商用生産スケールの培養スケール(1000倍以上)で製造がと可能となり、培養・精製が恒常的に実施可能な状態になります．ここまでで更に5年程度かかります。

    • 目的疾患とバイオロジクス
    • 遺伝子配列、発現系構築、精製法検討開始
    • 特許調査・特許出願
    • 評価系構築
    • 物取り、試験管レベルの評価(細胞など)
    • 動物を用いた評価
    • 毒性否定試験
    • 特性解析、安定性試験
    • ヒトでの安全性試験開始

    プロセスバリデーション

    Stage 1: Process Design

    これまでに実施した開発・スケールアップの知識から商用製造プロセスを定義する段階

    • QbDアプローチ、実験計画法による開発、段階的なリスクアセスメントの実施によるリスク低減化、CQA,
    • 培養条件、精製条件それぞれについて、各パラメータの範囲を定義していく段階
    • 分析系バリデーション

    技術移転プロジェクトを立ち上げ、研究所と製造サイトの共同作業により技術移転が推進される段階。

    • 培養の技術移転および精製の技術移転
    • Stage 2に備えます

    Stage 2: Process Qualification

    定義したプロセスが再現性よく商用生産できることの確認する段階

    安定稼働プロジェクトを立ち上げ、研究所がサポートしながら、工場が主体で安定稼働を確認が推進される段階

    • 3ロットの製造の実施で確認
    • 安定性試験の開始
    • 特性解析による物性の確認

    Stage 3: Continued Process Verification

    継続的な検証により、ルーチンで実行している商用製造がコントロール下(最近のトレンドは、PATによるリアルタイムモニタリングによるデータ比較)にあることの確認を得る段階

    *1: PAT: Process Analytical Technlogy。説明は、ここを参照できます。

    • レーザー解析: 原薬粉砕工程での粉砕粒子径のモニタリング
    • NIR (拡散反射法): 造粒中の水分
    • NIR(透過法): 打錠工程の製剤均一性

    参考

    FDA, Guidance for Industry Process Validation: General Principles and Practices (22 page of all)

    2019/12/17 改定

  • [GT] 世界で承認された細胞・遺伝子治療薬 – ID1872 [2019/09/06]

    [GT] 世界で承認された細胞・遺伝子治療薬 – ID1872 [2019/09/06]

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    遺伝子治療薬リスト(2017)

    2017年に経済産業省がまとめた、世界で承認された遺伝子治療薬です。補充療法とがん溶解による治療薬などが含まれます。

    • AAV1, AAV2 Vectorによる遺伝子導入
    • HSV1 による腫瘍溶解
    • T細胞遺伝子治療
    製品名開発企業承認国、年対象疾患導入遺伝子製品の種類投与方法
    GlyberaUniqueオランダ、2012リポ蛋白リパーゼ(LPL)欠乏症LPLAAV1筋肉内投与
    in vivo
    ImlygicAmgenUS, 2015切除不能悪性黒色腫顆粒球マクロファージ刺激因子(GM-CSF)HSV1腫瘍内投与
    in vivo
    Strum eli’sGSKUK, 2016アデノシンでアミナーゼ(ADA)欠損症ADA遺伝子導入自己CD34+細胞(RV)静脈投与
    ex vivo
    ZalmoxisMolMedイタリア, k2016高リスク造血器悪性腫瘍(GVHD重症化防止)HSV-TK+ΔLNGFR遺伝子導入同種T細胞(RV)静脈投与
    ex vivo
    KymriahNovartisUS, 2017急性リンパ芽球白血病(ALL)(小児、若年成人)CD19 CAR遺伝子導入自己T細胞(LV)静脈投与 ex vivo
    Yes artsKite PharmaUS, 2017びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫CD19 CAR遺伝子導入自己T細胞(RV)静脈投与
    ex vivo
    LuxtumaSpark TherapeuticsUS, 2017レーバー先天性黒内障RPE65AAV2網膜内投与
    in vivo

    薬価サーチサイト KEGG MEDICUS 薬価

    DailyMed

    文献

    遺伝子治療の課題と方策、平成30年3月1日、経済産業省、商務・サービスグループ 生化学産業課

  • [Bio-rAAV] アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使用する意義(特徴)と製造概要 – ID1862 [2019/09/06]

    [Bio-rAAV] アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使用する意義(特徴)と製造概要 – ID1862 [2019/09/06]

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    ID1862

    rAAVベクターの特徴

    遺伝子がランダムに導入される理由を掘り下げて調査した。

    1. 導入目標: レトロウイルスでは分裂細胞にしか遺伝子導入できないが，AAVでは，分裂，非分裂を問わず導入可能で長期発現が可能
    2. 免疫原性: センダイウイルス，ヘルペスウイルス及びアデノウイルスが免疫原性が高いのに対して，AAVは低い
    3. 遺伝子毒性: 正常遺伝子導入の際、ベクター配列が染色体に入ること、正常遺伝子が組み込まれる位置の制御できないため、癌遺伝子近傍に入るとがん化の可能性がある(文献1, p.20)、また、文献2には、宿主の染色体にランダムに遺伝子が導入されるため，レトロウイルス，レンチウイルスと同様に遺伝子毒性がある (現状での技術面の成熟が期待される)
    4. 1997年現在では、野生型AAVが持つ染色体第19染色体の長腕(q13.4-ter)への特異的な遺伝子導入は、組換え技術で作ったAAVベクターで特異的な部位への遺伝子導入は達成できない(文献4)。
    5. 特定部への遺伝子導入制御方法に関する特許は、2008に公開されている(文献5)ので、この時点で、染色体の特定部位への遺伝子導入は難しい技術であったことが伺える、1997年では、その技術はなかった可能性がある。
    6. 上記の最近の文献でもランダム導入などの記載があり、野生型AAVの特異的に特定の部位に遺伝子を導入できるまでには至っていないものと考えられる(今後も調査予定)。
    7.  臨床計画書を見ると、rep遺伝子は使われないようだ。すなわちランダムに遺伝子が組み込まれる。
    8. 細胞毒性: 細胞毒性が低いとされるレトロウイルス，レンチウイルスなどと比較しても，細胞毒性はほとんどない
    9. 大量調製が容易
    10. 治験応用実績: 血友病，パーキンソン病，Leber先天性黒内障
    11. 投与経路: 全身投与により大量投与が可能

    rAAVのメリット

    1. 拡散防止措置P1施設で取り扱う
    2. 増殖/非増殖のいずれの細胞にも遺伝子導入が可能
    3. 非増殖性の細胞での長期発言
    4. 免疫原性が低い

    rAAVベクター製造

    • プラスミドベクター製造
      • AAV ssDNA(pAAV-GOIvector)
        • pAAV CMV Vector
        • pRC Vector
        • pHelper Vector
    • ウイルス作成細胞(HEK293/Tなど) Cell Bank製造
    • プロセス開発
      • 培養
        • Transfection条件(細胞濃度とプラスミドベクターの比率)
      • 精製
        • 抽出法
        • カラム精製
        • UF/DF
    • non-GMP ウイルスベクター製造
    • 非臨床試験
      • in vivo実験(1012 vg/mL)
    • カルタヘナ申請
    • GMP ウイルスベクター製造

    参考

    文献

    1. TAKARA: catalog.takara-bio.co.jp/research.htm
    2. 経済産業省: https://www.kantei.go.jp/jp/singi/kenkouiryou/genome/advisory_board/dai5/siryou4-2-8.pdf
    3. 平成27年7月24日、国立医薬品食品衛生研究所: http://www.nihs.go.jp/oshirasejoho/symposium/documents/H27_suraido_3.pdf
    4. https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-08672600/(1997)
    5. 公開特許公報(A)_アデノ随伴ウイルスのＩＴＲをもつＤＮＡのヒト第１９番染色体への組込み部位の制御方法(2008): https://biosciencedbc.jp/dbsearch/Patent/page/ipdl2_JPP_an_2006263018.html
    6. 遺伝子治療臨床計画書(2017) – rep遺伝子を欠いているためAAVS1へは導入されずランダムに組み込まれる(p.14): https://www.mhlw.go.jp/file/05-Shingikai-10601000-Daijinkanboukouseikagakuka-Kouseikagakuka/0000186212.pdf

    編集履歴

    2019/09/06 はりきり(Mr)
    2019/09/14 追記 (文献3, 4追加)
    2020/04/28 文言整備

  • 蛋白質の精製装置とその精製 [2019/08/25]

    蛋白質の精製装置とその精製 [2019/08/25]

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    蛋白質精製装置の歴史

    もう40年も前から蛋白質の精製装置は開発されている。当時はPharmaciaという社名の企業で市販されていたFPLCという装置が有名だった。

    今では、Pharmaciaの社名なくなり、GE Healthcareに変わっていて、精製装置のブランド名は、AKTAになった。

    GE Healthcareは、今年中には、GEの業績が不振なことから放出されて、別会社の子会社となるようだ。

    引用元 : https://www.gelifesciences.co.jp/newsletter/biodirect_mail/technical_tips/tips60.html

    蛋白質の精製方法

    一般的に蛋白質は、熱や有機溶剤に弱く、変性してしまうため、有機化合物のようには精製できない。

    蛋白質の精製では、水溶液状態を維持しながら精製工程を進めて純度を上げていく必要がある。

    そこで、液体をハンドリングする液体クロマトグラフィーであるFPLCやAKTAの出番となる。

    精製装置の原理

    蛋白質の精製とは、液体をどうコントロールするかということであり、言い換えるとその液体組成のコントロールをいかにするかに尽きる。

    主要な溶液組成は、塩濃度を表す電気伝導度 (conductivity)とpHの2つが基本となる。

    これらの組み合わせを作り出し、精製の舞台となる担体という場で蛋白質の精製を行う。

    担体の選択

    担体とは、蛋白質と相互作用がある樹脂と定義できる。

    担体は、通常ビーズ状でありその大きさは50~100μmφ、樹脂(Resin)ともいう。

    粒子であるため、粒子と粒子の間に水分を濾(こ)すことができる。

    具体的には、ガーゼのようなもので樹脂を捕捉し、水分と分離させる。

    実際には、樹脂より小さい網目のハードメッシュを円筒の上下につけて樹脂を挟み込んでカラムという筒に充填し、このカラムの片方から液体を流し、もう一方から液体を出すという原理で、担体を使用する。これをクロマトグラフィという。

    樹脂(resin)といっても、昔は天然の素材からつくるセルロース系しかなかったが、今日では、合成樹脂(ビニル系など)が使われる。

    精製をしようとしている目的蛋白質と不純物質(木吹物質の分解物や重合物、原料上混入してくる産生細胞由来のDNA,細胞成分など)を担体との相互作用によって分別する。

    担体は、以下の種類のものを選択する。1種類の担体での精製では不十分であるため、相互作用が異なる単体を選択する。多くても3種類の担体が使用される。

    担体の種類

    先ず、陰および陽の電荷を持つイオン性のリガンドと呼ばれる低分子化合物を担体に結合させているイオン交換体があげられる。

    これらの担体には、親水性の素材が通常使われている。

    次に、電荷を持たないが、疎水性の担体がある。これらの担体の性質を併せ持つマルチモーダルな担体もあり、昔らか高度に精製したい場合に、使用されていたハイドロキシアバタイト(リン酸カルシウム塩: HA)は、今でも高度なタンパク精製に使用される。

    更に、目的蛋白質と強い特異性で結合できるリガンド分子を担体に結合させたアティニティ担体がある。

    アフィニティ担体として、一般的に良く知られているのが、Protein A担体である。血漿分解由来の凝固系蛋白質は、ヘパリンに親和性を持つものがおおく、ヘパリン担体もアフィニティ担体と呼ばれる。

    蛋白質精製装置で目的蛋白質を精製する

    通常は、蛋白質精製装置(AKTAなど)を使用してカラム・クロマトグラフィーを行う。

    また、カラム・クロマトグラフィー工程のつなぎの工程として、UF/DF処理、沈殿化処理、ウイルス除去フィルターろ過なども実施される。

    編集履歴

    2019/08/25 記載
2020/02/01 改定(個別の工程の説明を分離しそれぞれ個別に説明)
2020/02/18 文言整備、Desktopでは2カラム化(右にフローチャート配置)
2020/10/04 体裁変更
  • [Bio-Edu] 血漿由来の抗体精製 – Poll AcroSep resin), 2009 – ID14 [2019/08/12]

    [Bio-Edu] 血漿由来の抗体精製 – Poll AcroSep resin), 2009 – ID14 [2019/08/12]

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    血漿中の抗体(IgG)を精製する方法

    2019年現在、抗体医薬品のほとんどは、遺伝子組換えCHO細胞から造られている。これらの抗体医薬品は、特定の疾患に対する特異抗体、即ちモノクローナル抗体である。

    今回紹介する血漿からの抗体は、補充療法としての抗体である。ヒトの血漿中にある抗体は、モノクローナル抗体ではなく、様々な抗原にたいする抗体が混合体として存在しており、上述の場合をモノクローナル抗体と呼ぶのに対し、ポリクローナル抗体という。

    例えば、川崎病では従来から血漿由来抗体の投与が試みられる。川崎病はウイルス感染をきっかけとして、遺伝子素因に起因すると考えられる異常な免疫反応により血管炎が生じる疾患である。ウイルスは変異をするので、モノクローナル抗体では、変異したウイルスに治療効果はない場合がある。比較してポリクローナル抗体では、治療効果の確率が高くなる、理屈的には考えられる。

    余談だが、異常な免疫反応に対しては、抗体では効果はないと考えられるため、抗体で効かない場合は、免疫抑制のあるステロイド剤が使用される。

    概要

    PlasmaをBlue Trisacryl AcroSep columnでAlbuminを吸着除去し, Mix modeのMEP AcroSep columnでIgGを吸着、EDTAでtransferinを洗浄除去後、IgGをpH5で溶出する

    原理

    • 血中の主たるタンパク成分であるアルブミン (Albumin)は、青色素に特によく吸着する。
    • 抗体の物性が良ければ、AEX、CEXのクロマトで精製可能だが、一発で精製したいなら、Mix Mode クロマトが選択肢の一つとなる。
    • 血漿には、鉄の輸送屋であるTransferinが含まれているが、おそらく鉄を介してAlbuminと抗体は親和性を有している

    精製担体

    4-Mercaptoethylpyridine (4-MEP)

    https://products.pall.jp/jp/ja/Laboratory/Protein-Sample-Prep-and-Detection/ID25/mep–zidgri78m5c

    [ED] 免疫グロブリンG; IgG

    https://harikiri.diskstation.me/myblog/biologics/8697/
  • [健康] 抗PD-1抗体を用いたがん免疫療法 [2024/01/15]

    [健康] 抗PD-1抗体を用いたがん免疫療法 [2024/01/15]

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    PD-1

    は、T細胞などの細胞表面に存在する免疫抑制性の補助受容体である。自己の組織やがん細胞を攻撃することが可能なT細胞を強力に抑制できる。

    その免疫抑制作用の発揮には、PD-1受容体にPDリガンド(PD-L1)が結合が必要である。

    抑制性免疫補助受容体PD-1が有益な免疫応答を抑制しないメカニズムを解明

    https://www.amed.go.jp/news/release_20190419-02.htmla

    抗PD-1抗体

    の抗体医薬には、以下の表にまとめたものがある(KEGG)。

    これら抗PD-1抗体とYervoy(抗CTLA-4抗体)の併用効果についても臨床試験が行われており併用効果がある程度見られている。

    用語

    PD1 : Programmed death-1，T細胞の表面に発現している免疫チェックポイント受容体(Receptor)の一種

    PD-L1 & PD-L2 : 腫瘍細胞の表見に発現しているPDに対するリガンド(Ligand)．

    製品

    キイトルーダペムブロリズマブMSD
    オプジーボニボルマブ小野薬品
    リブタヨセミプリマブサノフィ
    イミフィンジデュルバルマブアストラゼネカ

    編集履歴

    2024/01/15, Mr.HARIKIRI
    2024/05/22, 製品追加

  • [Bio-Edu] rAAVの臨床投与量 [2019/07/31]

    [Bio-Edu] rAAVの臨床投与量 [2019/07/31]

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    rAAV vectorの投与量

    遺伝子治療薬(in vivo)では、遺伝子を運ぶベクターとして、アデノ随伴ウイルス(AAV)が使用されます。AAVの殻の部分をCapsidといいますが、そこに目的の遺伝子が挿入されてrecombinant AAV (rAAV)が設計され、動物細胞や微生物でrAAVが製造されます。rAAVの数は、vector genomes (vg)単位で表されます。

    non-clinical(動物試験)の結果をもとに、ヒトでの試験(臨床試験)の試験デザインが立てられます。

    rAAVを使用した遺伝子治療薬の開発では、副作用が無く且つ治療効果が期待できるrAAV投与量が臨床試験で確認される必要があります。

    そのrAAVの必要な投与量は、どれくらいなのかは、そのrAAVの品質、対象疾患などで異なるため、一概に言うことはできませんが、どれくらいの範囲になるのかは、先行する臨床試験や文献から理解することが可能です。

    non-clinical

    参考文献1)のタイトルは、「ムコ多糖症VI型の治療のために静脈内投与されたAAV2 / 8ベクターの非臨床的安全性と有効性」です。非臨床試験、すなわち動物実験を行い、静脈投与における安全投与量での有効な量が示されています。以下の何の試験においても毒性はなかったとのことです。

    試験 (マウス:C57/BL6-Tg ARSBC91S/MPS VI)、投与後の15日後(D15)、150日後(D150)及び180日後(D180)で動物の状態を検査しています。

    投与

    • 毒性試験(toxicity) : 2e13 vg/kg, D15, D180/マウス
    • 生体分布(biodistribution) : 2e12 vg/kg, D15, D180/マウス
    • 生殖細胞伝達 (Germline transmission) : 2e12 vg/kg, D150/マウス
    • 遺伝子発現試験(expressi) : 2e12 vg/kg, D150/ウサギ
    • 用量反復(dose response) : 2e11, 6e11, 2e12 vg/kg, D150, D180/マウス

    評価

    • hematology
    • clinical chemistry
    • necropsy
    • histopathology
    • general health, phiysical
    • functional and neurobehavioral examination
    • body weight
    • body temperature
    • food intake

    Non-clinical Safety and Efficacy of an AAV2/8 Vector Administered Intravenously for Treatment of Mucopolysaccharidosis Type VI, 2017

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5552066/

    Clinical

    最近、あるrAAVを使用した臨床試験で、死亡例が出てしまいClinical Holdになりました。その濃度のオーダーは、1e14/kgでしたが、肝臓をターゲットにするrAAV vectorでした。死亡原因については、今後、解析結果がレポートされるものと思われます。

    患者さんへの投与は、1回の投与で、必要な遺伝子としてrAVVを必要十分に投与できれば、理論的には、その1回の投与で治療は終了します。その投与量の決定として、先行する臨床試験では、2回の投与、2濃度の投与量、などについて臨床デザインに含まれています。

    臨床事例

    rAAVの臨床投与量(clinical)

    2020/02に、BIOMARINが開発されたした血友病Aの遺伝子治療薬(rAAV5)が承認されました。同様にROCHEに買収されたSPARKも血友病Aの開発を行っています。

    以下のようにBioMarinの臨床試験で4e13 vg/kgを投与しているということは、動物試験では、さらに10倍程度は高い投与量での安全性の確認をしているのでは無いかと考えられます。

    BioMarin (SPK-8016)

    • 4e13 vg/kg
    • 6e13 vg/kg

    Spark (SPK-8016)

    • 5e11 vg/kg
    • 1e12 vg/kg

    まとめ

    BIOMARINは、低容量6e12、高容量4e13~6e13 vg/kgで臨床試験を行っています。高容量では、その後の2年間、出血制御は良好な状態を維持していると言っています。

    SPARKのケース(SPK-8016)は、BIOMARINより1/10から1/100です。

    編集履歴

    2020/07/31 Hr.Harikiri
2020/09/19 追記 (臨床投与量から動物試験での投与量を推察)
2024/01/15 文言整備
  • rAAV精製に必要な精製機材　工事中 – ID1165

    rAAV精製に必要な精製機材　工事中 – ID1165

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    Thermo /

    POROS™ CaptureSelect™ AAV9 Affinity Resin

    Antibody Fragment for AAV8, AAV9 , AAVX

    4M Urea, 3M GuHCl, <pH10,, 

    Equiriblation

    PBS

    Washing

    PBS

    1M NaCl containing

    Elution

    pH2-3, citrate

    CIP

    6M Urea, 6M GuHCl

    https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A27357