カテゴリー: BIOLOGICS

[Bio-Process] 細胞の凍結融解から拡大培養の開始 – フラスコ培養/Inoculum – △ID9636 [2020/02/01]
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Bio-Process-Inoculum
- 凍結保管セルバンクの融解とフラスコ培養
液体窒素から取り出し融解したCell bankを、スモールスケールのフラスコ培養により培養を開始するステージです。
フラスコ
Sci-Tech
回転方向、スピードとインターバルをプログラム制御
- WAVE BIOREACORによる拡大培養
フラスコ培養の次のスケールは、WAVE BIOREACTORで拡大培養を続けます。
[Bio-Equip] Flexsafe RM – Wave Bioreactor シングルユースバッグ – Sartorius – ID11421 ID11421
[Bio-Process] 拡大培養/Subculture – ID9342 [2020/02/01] ID9342
- Production Culture
その後、Production Cultureを2週間行われ、Harvest工程へ続きます。
[Bio-Process] バイオロジクスにおける本培養の概要/Production – [2021/10/30] ID17487
2020年2月1日
[Bio-Process] 細胞バンク – ID9833 [2020/02/01]
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生産細胞株
通常、Cell Bankの保管は、劣化を極力抑えるために液体窒素蒸気下の極超低温で行われます．
保管容器
Nunc™ Press Out Tool for Cryobank and Bank-It™ Vial Systems, ThermoFisher
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/374009
- 凍結保管セルバンクの融解とフラスコ培養
関連するICHガイドラインと試験項目
Q5シリーズ、FDAガイダンス、その他ウイルス否定試験、無菌、マイコプラズマ、などの試験項目を示します。
~メンバー専用　↓~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ~↑ メンバー専用~
2020年2月1日
[Bio-Process] 除菌ろ過 (Sterile filtration) [2020/02/01]
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処理目的
得られたサンプルは、in vitro, in vivo試験で評価するために、除菌ろ過を行い、無菌状態にする
考慮事項
- 膜面積
- サンプルの状態 (プレフィルターの必要性)
- 処理時の温度(室温/冷温室)
- 一般的に膜面積当たりの最適な流速が存在する。勢いよく一気にろ過するような速で行うと、目詰まりが早くなる。
マイレクス（Millex）-HV フィルター, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, ガンマ線滅菌済本製品は医療機器あるいは体外診断用医薬品ではありません。
https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Millex-HV-Syringe-Filter-Unit-0.45m-PVDF-33mm-gamma-sterilized,MM_NF-SLHV033RS
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2020年2月1日
[Bio-Process] UF/DF Process [2020/09/30]
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UF/DF工程
目的物資の安定な電気伝導度とpHに組成を変更することを目的とします。
- 膜面積
- 処理時間
- 室温と冷温室
- TMPの設定 (システムへの入りの圧力と出の圧力管理)
- クロスフロー(ポンプ速度)は、高濃度あるいは高粘度の処理には、適切な設定が必要となる
- バッファ交換: 通常は8 diavolumeで1000倍希釈を目指す
ラボシステムとして、Sartorius StedimのVIVA FLOW 200を以下に示します。
Sartorius, VivaFlow 200
Fisher Scientific –
https://www.fishersci.fi/fi/en/catalog/search/products?keyword=Sartorius+VivaFlow+200
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2020年2月1日
[Bio-Process] Polishing Process of mAb purification [2020/02/01]
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Polishing (高度精製)
目的
- 一般的な高度精製は、陰イオンと陽イオン交換クロマトグラフィで行われる
- それでも十分な精製度が得られない場合、疏水やマルチモーダルの担体が用いられる
- 基本的なレジンとその条件設定が確定できれば、レジンの粒径を小さくすることで、ピークの分離は向上する
考慮事項
- 抗体の場合は、プラットフォーム精製が存在する
  1. Protein A (Binding/Elution)
  2. AEX (Flow-through )
  3. CEX (Binding/Elution)
  4. Virus Filtration
  5. UF/DF (バッファ交換/濃縮)
  6. 添加剤添加
  7. 分注保管
- 研究初期段階で、抗体以外のレアなタンパク質の精製の場合
  - AECまたはCEXでCapturing工程として精製する
  - その場合、バッファ交換が必要ない条件設定を構築した方が良い。以後の追加精製が楽になる
    Conductivityは、容易に低くすることができないため、低いconductivityで回収できれば、続く精製工程の手間が省略できる
    後のpH調整で簡単に調整可能であり、pH調整によるconductivityの変化は少ないため、pHは問わない。
    リン酸を含まないバッファで回収できれば、Polishingに使用するハイドロキシアパタイトでの精製に使える
  - Polishingのクロマトは、ハイドロキシアパタイトが推奨できる。
    pHは5.5以上(でないと、レジンが溶ける)
    アルカリ側は、Resinは安定
    リン酸を含まない、あるいは、低い(~5mM)でないと吸着できないタンパク質もある。前工程で緩衝液の組成は、この工程に備えて考慮しておく
    NaCl濃度で溶出されるタンパク質やリン酸で溶出されるタンパク質など、マルチモーダルな条件設定が可能
    Endotoxinは、分子が色々あるため、パス画分にも、溶出画分にも現れる
    精製戦略としては、パス画分に目的タンパク質をパスさせないこと、目的タンパク質が溶出する直前の洗浄条件を求めること、目的タンパク質が溶出できる最小条件を求めること、である。
GE Healthcare HiPrep™ IEX FF 16/10 Columns, Fisher Scientific –
https://www.fishersci.fi/shop/products/ge-healthcare-hiprep-iex-ff-16-10-columns-2/10607855
関連記事(タンパク質質精製)
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BIOLOGICS, medicine
[抗体医薬] クリースビータ〜くる病、軟骨化症〜キリンHD [2020/02/14]
2020年2月14日
Post Views: 348 クリースビータ協和キリンの医薬品です。効能または効果 FGF23関連低リン血症性くる病・骨軟化症効能または効果に関連する注意含糖酸化鉄、ポリマルトース鉄の投与に伴うFGF23関連低…

BIOLOGICS
[遺伝子治療薬] ZOLGENSMA – スイスのノバルティス社(AveXis)が開発した遺伝子治療薬 [2020/06/22]
2020年9月19日
Post Views: 521 ZOLGENESMA スイスのノバルティス社(売上高約500億ドル, Investing.com調べ)が買収したAveXis社の開発した骨髄性筋萎縮症(Spinal Muscular At…

BIOLOGICS
気になる企業 – Moderna – 新モダリティ(mRNA)・ワクチン (新型コロナウイルス) で駆ける / Phase IIIの中間結果では94.5%の有効性を示す – LNP製剤による2~8℃保存が可能である優位性 – ID15029 [2020/12/03]
2020年5月2日
新型コロナウイルスのワクチン開発を進めている米国のバイオテクノロジー企業MODERNA社の開発の仕方から、その全体戦略、mRNA医薬品の課題、などを学ぶことができる。mRNAによる個別化医療(多品種-少量生産)モデルを追求。mRNAワクチンでは、必要となる大量な需要に対しても余念がなく外部CMOとしてLonzaと連携。

BIOLOGICS
[Bio-Equip] Imaged cIEF and CE-SDS – proteinsimple – ID11524 [2020/03/06]
2020年3月6日
Post Views: 357 Maurice バイオ医薬品の同一性、純度、および不均一プロファイルの再現性分析と定量分析を行うことができます。サンプルあたり15分以内で迅速に結果を得られます。 cIEF（キャピラリー等…

BIOLOGICS, key-word
[用語] PCL – Packaging Cell Line/Producer Cell Line [2020/08/23]
2020年8月23日
Post Views: 510 Producer Cell LineとPackaging Cell Lineの違い Packaging Cell Lineは、キャプシドまたは空のウイルス量子を生産します。遺伝子治療用のウ…

BIOLOGICS
[Bio-FAQ] 核酸とは何ですか?[2022/11/16]
2022年11月16日
Post Views: 450 Q : 核酸とは何ですか? A : タンパク質精製における核酸は不純物に他ならない。UV測定においては、A260nmに最大吸収するため、A260とA280の比で核酸の除去状況をある程度判断…
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2020年2月1日
[Bio-Process] Low pH Virus Inactivation
Post Views: 293
Bio-Process
Low pH Virus Inactivation Process
低pH処理によるウイルス不活化は、pHの調整後は静的な保管条件が維持されるため、基本的にはプロセス容器中で実施される。CMOなどのスケールが小さい製造では、シングルユース製品であるFlex bugなどが使用できる。
- Low pH3~4 as Virus Inactivation Process
- 容易に破れず、使用しているプラスチックからの溶出物も少ないバイオ医薬品製造用バッグは、様々な工程で使用されている。
- 抗体医薬製造においても、Low pH処理によるウイルス不活化処理工程の容器として使用されている。
Thermo Scientific™ Productainer™ BPC Bag with 3 Ports
https://www.fishersci.com/shop/products/productainer-bpc-bag-3-ports/p-4521461
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BIOLOGICS
[Bio-Equipment] 遺伝子導入装置 ; Transfection for Plasmid to cells
2020年9月30日
Post Views: 537 遺伝子導入装置バイオ医薬品の目的タンパク質をコードする遺伝子を産生細胞株に注入する装置。その操作の後、導入できた細胞のセレクション → クローニングへと進む。 MaxCyte ExPER…

BIOLOGICS
[Bio-Equip] Cytiva – AKTA Ready System
2020年9月30日
Post Views: 529 AKTA Ready System Flow Kitというシングルユースの配管キットを装置する方式のクロマト装置である。配管の洗浄が必要なく、バイオロジクスのCMOでは汎用されている。ク…

BIOLOGICS
[Bio-Process] 除菌ろ過 (Sterile filtration) [2020/02/01]
2020年2月1日
Post Views: 300 処理目的得られたサンプルは、in vitro, in vivo試験で評価するために、除菌ろ過を行い、無菌状態にする考慮事項膜面積サンプルの状態 (プレフィルターの必要性) 処理時の…

BIOLOGICS
[Bio-Process] UF/DF Process [2020/09/30]
2020年2月1日
Post Views: 299 UF/DF工程目的物資の安定な電気伝導度とpHに組成を変更することを目的とします。ラボシステムとして、Sartorius StedimのVIVA FLOW 200を以下に示します。 F…

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[Bio-Process] Polishing Process of mAb purification [2020/02/01]
2020年2月1日
Post Views: 315 Polishing (高度精製) 目的一般的な高度精製は、陰イオンと陽イオン交換クロマトグラフィで行われるそれでも十分な精製度が得られない場合、疏水やマルチモーダルの担体が用いられる …

BIOLOGICS
[Bio-Process] Low pH Virus Inactivation
2020年2月1日
Post Views: 293 Bio-Process Low pH Virus Inactivation Process 低pH処理によるウイルス不活化は、pHの調整後は静的な保管条件が維持されるため、基本的にはプロセ…

BIOLOGICS
[Bio-Process] ハーベスト工程・培養上清の回収 [2020/02/01]
2020年2月1日
Post Views: 494 ハーベスト規定の期間の培養が終了した細胞培養液は、細胞を取り除き培養上清を取得する。この工程をHarvestと呼美ます。図1に示すミリポアのPODファイターはカセット式になっていて、図…
編集履歴
2020/02/01, Mr. Harikiri
2020/04/24, 追記　(関連記事)
2021/10/30, 文言整備
2020年2月1日
[Bio-Process] ハーベスト工程・培養上清の回収 [2020/02/01]
Post Views: 494
ハーベスト
規定の期間の培養が終了した細胞培養液は、細胞を取り除き培養上清を取得する。この工程をHarvestと呼美ます。
図1に示すミリポアのPODファイターはカセット式になっていて、図2に示すフォルダーにセットします。
PODのフィルターサイズは、デブリス除去、細胞除去、清澄化を段階的に行えるように、大きいサイズから小さいサイズにセットされています。図2に示したフォルダーの大きさは、身の丈ほどあり、1000L~2000Lの培養液を処理するのに必要です。
1. membrane pod
2. Millipore Millistack+ POD
Merck Millipore, Pod Filter
http://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Millistak+-Pod-Disposable-Depth-Filter-Systems,MM_NF-C9485?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ろ過膜の特徴
- Harvest工程は以下のろ過膜を使用可能
  - フィルターサイズで濾過する単純なろ過
  - 「活性炭や鉱物を練り込んだ膜」によるろ過
- 単純なろ過では、精製効果は期待できないが、「活性炭や鉱物を練り込んだ膜」では、培養過程で生じる死細胞由来のタンパク質、DNAなどの不純物を除去することが可能である。
- 「活性炭や鉱物を練り込んだ膜」は、Protein Aレジンのライフタイムを延長効果が期待できるとともに、Protein A施処理後に得られる部分生成品の品質向上も期待できる。
編集履歴
```
2020/02/01 HARIKIRI(MR)
2021/03/27 記載整備
2021/10/30 記載整備
```
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[Bio-Equipment] 遺伝子導入装置 ; Transfection for Plasmid to cells
2020年9月30日
Post Views: 537 遺伝子導入装置バイオ医薬品の目的タンパク質をコードする遺伝子を産生細胞株に注入する装置。その操作の後、導入できた細胞のセレクション → クローニングへと進む。 MaxCyte ExPER…
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[Bio-Equip] Cytiva – AKTA Ready System
2020年9月30日
Post Views: 529 AKTA Ready System Flow Kitというシングルユースの配管キットを装置する方式のクロマト装置である。配管の洗浄が必要なく、バイオロジクスのCMOでは汎用されている。ク…
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[Bio-Process] 除菌ろ過 (Sterile filtration) [2020/02/01]
2020年2月1日
Post Views: 300 処理目的得られたサンプルは、in vitro, in vivo試験で評価するために、除菌ろ過を行い、無菌状態にする考慮事項膜面積サンプルの状態 (プレフィルターの必要性) 処理時の…
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[Bio-Process] UF/DF Process [2020/09/30]
2020年2月1日
Post Views: 299 UF/DF工程目的物資の安定な電気伝導度とpHに組成を変更することを目的とします。ラボシステムとして、Sartorius StedimのVIVA FLOW 200を以下に示します。 F…
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[Bio-Process] Polishing Process of mAb purification [2020/02/01]
2020年2月1日
Post Views: 315 Polishing (高度精製) 目的一般的な高度精製は、陰イオンと陽イオン交換クロマトグラフィで行われるそれでも十分な精製度が得られない場合、疏水やマルチモーダルの担体が用いられる …
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[Bio-Process] Low pH Virus Inactivation
2020年2月1日
Post Views: 293 Bio-Process Low pH Virus Inactivation Process 低pH処理によるウイルス不活化は、pHの調整後は静的な保管条件が維持されるため、基本的にはプロセ…
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BIOLOGICS
[Bio-Process] ハーベスト工程・培養上清の回収 [2020/02/01]
2020年2月1日
Post Views: 494 ハーベスト規定の期間の培養が終了した細胞培養液は、細胞を取り除き培養上清を取得する。この工程をHarvestと呼美ます。図1に示すミリポアのPODファイターはカセット式になっていて、図…
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2020年2月1日
[Bio-Equip] ambr 250 – Modular/High Throughput — 250mLスケールでフルコントロール培養を複数台で実行する – ID8287
Post Views: 301
- ambr
ambr 250 modular
100mLから250mLのシングルユース仕様のリアクターを2個単位で増設可能。250mLリアクターには、Feed培地は5種類のタンク(50mL x 2, 20mL x 3)を装備できます。
- 500Lや1,000Lへのスケールアップ製造を目的とするプロセス・オプティマイゼーション
- 培養条件について、どの範囲で培養が成立するするかを検証するプロセス・キャラクタライゼーシヨン
250mLリアクターと共に、装置にセッティングする。
ambr 250 high throughput
サンプリング、培地のショットなどロボットによる全自動。
amber 250, sartorial stedium
https://www.sartorius.com/en/products/fermentation-bioreactors/ambr-multi-parallel-bioreactors/ambr-250-modular

CD CHO Medium (1x), Liquid
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10743029
HT Supplement (100X), Liquid
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11067030?SID=srch-srp-11067030
GE Healthcare™ ActiPro Liquid Medium
https://www.fishersci.se/shop/products/actipro-liquid-medium/15835261
HyClone Cell Boost 7a Supplement
https://www.gelifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/feed-supplements/hyclone-cell-boost-7a-supplement-p-06179
HyClone Cell Boost 7b Supplement
https://www.gelifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/media-and-feeds/feed-supplements/hyclone-cell-boost-7b-supplement-p-06306
L-Glutamine, 200 mM Solution
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25030081
UniVessel® SU
https://www.sartorius.com/en/products/fermentation-bioreactors/benchtop-bioreactors/univessel-su
UniVessel® SU
https://www.sartorius.com/en/products/fermentation-bioreactors/benchtop-bioreactors/univessel-su
ネオシェーカー NS-LR
https://www.monotaro.com/p/3339/7445/?utm_medium=cpc&utm_source=Adwords&utm_campaign=246-833-4061_8351441661&utm_content=89680347110&utm_term=_380604198153__pla-557619277147&gclid=CjwKCAiA4Y7yBRB8EiwADV1hacw6boHDTkb_KayZhNWO4LnQ8uwXxHSryvhJayfP9A-jjKZI8HT93RoCyxYQAvD_BwE
3578スピナーフラスコディスポーザブル
https://jp.misumi-ec.com/vona2/detail/223011456026/
A Rapid, Low-Risk Approach for Process Transfer of Biologics from Development to Manufacturing Scale (2020)
https://bioprocessintl.com/sponsored-content/biostat-str-bioreactors-a-rapid-low-risk-approach-process-transfer-of-biologics-from-development-to-manufacturing-scale/
編集履歴
2020/02/01, Mr. Harikiri
2020年2月1日
気になる企業 – Bia Separations – バイオ医薬品開発で次世代モダリティーに適用を提案するモノリス・カラム製品 – mRNAやAAV精製 [2020/09/20]
Post Views: 335
BIA Separations
- https://www.biaseparations.com
- クロマト樹脂
- 昭和電工との提携
- Sartoriusとの提携
https://www.biaseparations.com
次世代モダリティ医薬品
次世代のバイオ医薬品として、新しいモダリティの開発が進められています。Messenger RNA (mRNA)やリコンビナントAAV(rAAV)が代表的な次世代のモダリティです。
mRNA
mRNAを精製するには、CIMmultus PrimaS™️が使えます。source
- 「CIMmultus PrimaS™️」の特徴
  - High resolution mRNA purification tool
  - monolith structure
  - Rapid process, Scale-up
  - has a intact poly(A) tail
  - to remove dsRNA and DNA
  - to remove product-related impurities: enzyme, fragment of DNA and RNA
- Messenger RNA (mRNA)は、高分子で、シェアストレスに敏感です。モノリス構造は、高分子のアクセスを可能にし、10kb以上のmRNAを精製することができます。
- mRNAの化学的特性の豊富なスペクトルは、さまざまな精製カラムの基礎となります。 Messenger RNAには、荷電したリン酸バックボーンと、水素結合能力を持つ疎水性ヌクレオチド残基が含まれています。
AAV
AAVの精製には、CIMmultus SO3でキャプチャリングして、CIMmultus QAでポリッシングする方法が使えます。source
- 製造由来のクリティカルな不純物
  - Host Cell由来の核酸
  - Host Cell由来のタンパク質
  - クロマチン
    厄介な不純物、抗原性を持つ
    クロマトにおける阻害要因
    核酸をコンパクトに巻くためのコアとなっているタンパク質
    核酸は、酵素にゆり速やかに分解されますが、このタンパク質は頑丈なため、取り除かない限り残留する
- 目的物由来のクリティカルな不純物
  - Empty Capsids (目的遺伝子; GOIを含まないAAV粒子)
  - Capsid Aggregates (AAVの重合物)
  - Capsid DNA Complexes (AAV粒子とDNAの結合体)
以下のクロマトグラムは、SF9 harvest AAV2/8の蛍光SEC分析。AAVとクロマチンは挙動を共にしている。Bia Separationsは、2種類のIEXによりAAVの精製プラットフォームを開発している　(Harvest→TFF→AAV capture: CIMmultus SO3 (for impurites separation)→ Dilution→CIMmultus QA (for empty/full separation)
Analytical SEC with monitoring of intrinsic tryptophan fluorescence.
Chromatin aggregates built on nucleosomal arrays range in size from 10–500 nm. Aggregates based on nucleosomal fragments range from 2–10 nm. Both act as nucleation centers for accretion of non-nucleosomal proteins and RNA.
製品
Bia Separationsが開発した製品は、一般的に言えば、精製レジンです。ただし、粒子ではなくモノリスです。圧損失がなく高流速で処理が可能です。
分析用カラム
Products for analytical applications CIMac™️ line
- CIMac SO3
  - 分析バターンから、CIMmultus OHで精製したAAV9画分は、elution-1で不純物が除去できていることが分かる
- CIMac QA
  - 分析パターンから、MgCl2を含むバッファーで分析するとEmpty/Fullの分離が良くなることが分かる
製造用カラム
Products for preparative applications, CIMmultus™️ line
スクリーニングカラム
Products for immobilization screening
```
編集履歴
2020/09/20 Mr.Harikiri
```
2020年1月29日
気になる企業 Cellectis – 遺伝子編集 – ID7662 [2020/01/29]
Post Views: 297
Cellectis
- 2011年, Cellectics社が保有する独自のメガヌクレアーゼ技術を使用して、CDMO大手であるLonzaが所有の独自宿主細胞株CHO-K1SV細胞のグルタミン合成酵素（GS）をノックアウトすることに成功した。LonzaのGS Gene Expression System製品をさらに進化させた source: Manufacturing Chemist。
- ホームページ
- 拠点: フランス、米国
- 2019年、売り上げは、約20億円
- 主要領域 : ゲノム工学とゲノム手術
- 事業内容
  - ゲノム工学技術の研究、開発、商品化
  - 免疫系にがん細胞を標的とする免疫療法の開発
  - いくつかの子会社を保有
- 主要技術
  - TALEN®による遺伝子編集
    移植片対宿主病からの保護、拒絶反応の軽減、自殺スイッチの統合による安全性
  - メガヌクレアーゼ組換えシステム（MRS）による遺伝子の切り出し、修正、または置換に関する技術
  - CAR T*療法の開発
  - * CAR T: Chimeric Antigen Receptor T Cell
- 製品パイプライン
  - 上市品はまだなく、探索段階から臨床試験(Phase I)に6つの候補品の開発が進められている　source
Cellectics に関する情報 – investing.com より
https://jp.investing.com/equities/cellectis
編集履歴
2020/01/29, Mr. Harikiri
2020年1月29日