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[Bio-Culture] CHO細胞の培養における制御パラメータ、添加物及び装置・設備の事例 – ID6721[2020/09/08]

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harikiri

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細胞培養とは

細胞を無菌・人工的に育てること

制御パラメータ

  • 培養装置
    • 細胞バンクの保管容器
    • フラスコ (ポリ材質)
    • WAVE培養装置
    • iCellis (付着細胞用)
    • Bioreactor (浮遊細胞用)
  • シングルユースバッグ(ポリ材質)
    • Extractable and leachables (E&L/溶出物/浸出物)の問題を抱えている
    • ThermoFisher SciencesのSingle Use Bagす少ないらしい
    • E&L試験の概要 source: 一般社団法人化学物質評価研究機構
    • リスク評価→溶出試験(ワーストケース試験)→毒性試験→浸出試験(実環境の製品)
  • ステンレスタンク
  • 微量混入
    • タングステン(W)
  • 細胞周期
    • ダブリングタイム
      • 安定的に目的タンパク質を生産できる細胞の世代数は、細胞株の構築時に確認されている
      • プロダクション培養のスケールまで拡大培養していく過程で、その世代数は進む
      • プロダクション培養では、一般的に15日以内で終了することになるが、確認された世代数以内で完了しなければならない
    • 安定期
    • 分裂期
  • 温度
    • 基本的に37℃付近で制御する。酵母などでは動物細胞と違い発熱量が多いため基本的に冷却するが、動物細胞の場合、加温することが基本である。
    • 200L SUBでは、Jacket(7L)にLauda製の温度制御装置は、2.25kW加熱、1.25kW冷却を備える5)
  • pH
    • 新陳代謝によるpHの変動を制御。乳酸が蓄積されてくるとpHは下がる
    • 炭酸ナトリウム添加、CO2のスパージ
    • センサープローブ (Finess 5))
  • DO
    • Air, O2のスパージ
    • 30%~90% 5) : 一般的に40%を設定
    • DOプローブ (Finess 5))
  • 通気量
    • BIoreactorのトップからの吹付け、スパージング
    • 200L SUBのO2, Air, N2,では、20 standard liters/minute (SLPM)、CO2では、5 SLPM5)
  • 攪拌速度
    • 細胞の均一化、継続的・随時供給する栄養素の供給の均一化
    • 200L SUBでは、95~140rmp5)
  • 培地
    • 基礎培地 & フィード培地
      • アミノ酸
      • 栄養素
  • 酸素分圧
    • 細胞の呼吸
  • 二酸化炭素分圧(pCO2)
    • 二酸化炭素の培地中溶存量によりpH制御。pCOが低下するとpHが上がる。
    • 細胞培養により代謝産物として作られた乳酸は、pHを下げる
    • 下がったpHを上げるには、CO2を吹き込んでpCOを高める
  • エネルギー源: グルコース
    • 細胞が分裂したり目的蛋白質を生産するエネルギー源
  • ミネラル
    • 細胞が正しく活動するため
    • 銅
    • 亜鉛
    • マンガン
  • 無機塩
    • そのためpH制御のために炭酸ナトリウムの随時添加
  • 脂質
    • 細胞は細胞膜が一番外側にあり、その構成ようしは、蛋白質と脂質の混合構成となっていおり、細胞分裂に必要
  • 成長因子
    • 直接的な細胞増殖のために添加される
  • Antiform, Pluronic F68 5)
  • 代謝産物(中間体)の役割
    • ある代謝サイクルにおける律速の充足効果は研究が続けられている
    • α-ketogultalate (AKG) の添加効果(最近のアンチエイジングのマウスへの摂食研究では、健康寿命や寿命自体が伸びる)

参考文献

1)

１から分かる細胞培養における培養環境

https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/cell-culture-environment/
2)

Chinese Hamster Ovary(CHO)細胞を用いた高品質 な抗体医薬の高生産培養システムの開発

https://tsukuba.repo.nii.ac.jp/index.php?action=pages_view_main&active_action=repository_action_common_download&item_id=36952&item_no=1&attribute_id=17&file_no=1&page_id=13&block_id=83
3)

公開特許公報(A)_細胞培養制御方法、細胞培養制御装置及びこれを備える細胞培養装置

https://biosciencedbc.jp/dbsearch/Patent/page/ipdl2_JPP_an_2011229215.html
4)

CHO プロトコール System200

https://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/wave_03_16.pdf
5)

The Unican Concept: Engineering Dual Capability into Single-Use Vessels

https://bioprocessintl.com/upstream-processing/upstream-single-use-technologies/unican-concept-engineering-dual-capability-single-use-vessels/
気になる成分 – AKG; αケトグルタル酸 – アンチエイジング効果のあるTCA回路代謝物 [2020/11/07] ID22185
編集履歴
2020/01/11 HARIKIRI(MR)
2020/09/08 追記(付着及び浮遊細胞用装置、AKG代謝)

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