![[Bio-FAQ] タンパク質とは何ですか?[2022/11/16]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2022/11/6B7AF2DA-F824-46A6-84AA-59CE1BCF6278.jpeg)
Q : タンパク質とは何ですか?
A : タンパク質とは、ヒトや動物、その他の生体内における何がしかの機能を持った最終的な機能性物資であと定義することができます。タンパク質は、アミノ酸で作られています。脂質、炭水化物とは異なる生体内の成分です。タンパク質の持つ機能を医薬品としたものが、バイオロジクスです。タンパク質の設計図は、メッセンジャーRNA (mRNA)です。mRNAはDNAを鋳型としてコビーされます。DNAは、細胞の核に保存されています。
タグ: protein
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![[Bio-FAQ] タンパク質濃度はどうやって求めますか?[2022/11/16]](data:image/png;base64,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)
[Bio-FAQ] タンパク質濃度はどうやって求めますか?[2022/11/16]
Q : タンパク質濃度はどうやって求めますか?
A : タンパク質はアミノ基をもっているので，その特性，すなわちA280nmに高い紫外線波長の吸収を持つことを利用してタンパク質の濃度を求めます．
最も簡単な方法は，分光高度計を用いた方法です．そのほか，高感度測定法として「ローリー法」などがあります．化学反応により発色させてから，その色を同様に分光高度計で測定するため，高感度となります．
分光高度計の測定波長A280nmを用いた測定方法については，以下のリンクを参照できます．
- OD測定 (A280nm)
- ローリー法
- RP-HPLC法 (目的タンパク質を逆相(RP)カラムで分離し，そのピーク面積 (一般的な波長はA220nm)を標準タンパク質と比較して求める．不純物が含まれていても目的のタンパク質のみの濃度を求めることができる．
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[Bio-FAQ] タンパク質の精製を始める前に、そのタンパク質についてよく考える必要があるのですか?[2022/11/16]
Q : タンパク質の精製を始める前に、そのタンパク質についてよく考える必要があるのですか?
A : まず、精製品として取得したいタンパク質を精製するには、そのタンパク質自体の情報を理解する必要があります。分子量、アミノ酸配列、精製機材としてのレジンとして特異的なレジンがあるか、そして、3D立体構造を知ることは、精製に関わる挙動をイマジネーションすることができます。
- 分子量
- アミノ酸配列情報
- 特異的な精製は可能か
- 3D立体構造
分子量はどれくらいか
精製しようとしているタンパク質の物性について知ることから始めます。
100kDaを超えると大きい分子と認識します。もしもRefoldingが必要な場合、このような高分子でのRefoldingは期待薄です。できたとしても、その歩留まりは非常に低いはずです。
Refoldingが可能なタンパク質の分子量は、一般的に30kDa以下です。それ以上になると、分子量の増加とともにRefolding効率が低下してきます。
アミノ酸配列情報
等電点はどれくらいか
イオン交換体の精製を考える場合に、その等電点を知ることは、陰イオン交換体を使用できるのか、陽イオン交換体を使用できるのか、まずは、大雑把に判断するために必要な情報です。
ウイルスや核酸は、負電荷が強いので、陰イオン交換体による吸着/溶出法が使用できます。IgGの場合、そのpIは、中性から塩基性であることが多いので、その場合には、その抗体のpIを超えないpHのバッファー組成で、陰イオン交換クロマトグラフィを実施できます。IgGはパススルーしますが、その他、pIが低い不純物質は、吸着するので精製されるわけです。
疎水性はどれくらいか
分子量が大きくなるにつれて、疎水性は一般的に高くなります。大きな分子であれば疏水クロマトが使用できるでしょう。IgGの分子量は、150kDaなので、疎水クロマトが使用できます。
疎水性が強ければ、塩析による沈殿化も容易です。容易ということは、沈殿化によるロスに注意を払う必要もあるということです。
ただ、疎水クロマトでは、疎水レジンであっても吸着容量がイオン交換クロマトグラフィと比較して低くなるし、高分子であるほど吸着容量は低下することを考慮する必要があります。
特異的な精製は使用可能か
アフィニティ精製
抗体の精製のようにProtein Aレジンによる精製が可能なら使用すれば、初期精製の苦労を回避できます。文明の力は使いましょう。そのために、試薬メーカーが開発してくれています。
AAVのアフィニティ・レジンも開発されています。使用しない手はないでしょう。
血液凝固系のタンパク質は、もっぱらヘパリン親和性を持っています。ヘパリン・レジンを使えるかも知れません。
精製タグによる精製
ラボでの精製をしやすくするために、N末またはC末にHistidine x 6を付加して、Niカラムで精製が可能にデザインすることがあります。Imidazoleの濃度で溶出できますが、おそらくHistidineでも溶出は可能なはずです。一般的には、Histidineで溶出することはないようです。私は、見たことがありません。
最適なImidazole濃度は、必要十分な濃度を知ることが重要です。薄すぎると回収率が低下し、高すぎると不純物が多くなりがちです。ただし、この工程は、キャプチャリングなので、後の精製工程の能力が高ければ、Imidazole濃度については、それほど厳密な設定は必要ないでしょう。
編集履歴
2020/11/22 Harikiri(Mr) 2021/05/02
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[用語] PDB ; Protein Data Base – タンパク質の立体構造を知る
PDB; Protein Data Base。タンパク質でできた医薬品をバイオロジクスと言います。タンパク質は、何十種類ものアミノ酸が多数結合してできています。分子量という分子の大きさを示す指標があります。この指標で表すと、タンパク質の分子量は数千以上を指します。それより小さいものをペプチドと言います。分子量が大きくなっても明確な物理性質が起こる訳ではない曖昧な表現は仕方ありません。
PDBは、タンパク質の物理化学的な情報についてまとめられているデータベースです。このデータベースの主な情報は立体構造であり3Dデータが提供されています。3Dデータはタンパク質の立体構造をありのままに理解するには大変重宝される情報です。タンパク質の機能は、立体構造で規定されていることが多いためです。ウイルスのスパイクタンパク質である抗原に抗体が結合できるのは、立体構造が相補的に形が一致していることが1つの大きな理由です。その他、結合に関与している物理現象には、疎水性結合、イオン結合などがあります。でも、立体構造がたいていの場合、最も重要であると考えられます。
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[Protein] 免疫グロブリン – IgMは感染初期からIgGに先んじて作られ、その後、IgGにバトンタッチ! [2020/06/26]
免疫グロブリンの種類と役割
免疫グロブリンは、自然免疫の代表格ですが、その種類は5つあり、それぞれ役割があります(図1)。
ひと昔前では、測定技術低さ・検出感度の低さの問題から、IgMの増加タイミングは、1~2週間後から、IgGについては、2~4週間後からと言われていました。
しかし、最近では、検出感度の改善により、IgMは、感染早々から, IgGでは、感染後1週間後からと、相当早い段階から産生され初めているようです(図2)。ただし、免疫力を発揮する濃度に達するまで産生されるには、それより数日から数週間を待つ必要があるはずです。
上記のように以前と今の違いを図2から考察してみます。IgMもIgGも産生されて、その濃度が最大になる頃を見てみると、IgMでは2週間、IgGでは1ヶ月になっています。したがって、それぞれ、産生量のピークとなる頃の期間であると認識すれば、正しい解釈であるとも言えます。
- IgG : 1量体(150kDa) source、血中に存在する、長期間の免疫、感染後1週間後から増加する
- IgA : 1および2量体(320kDa) source、唾液・涙に豊富、粘膜の粘液中に多く存在していて、遺物の体内への侵入を防ぐsource
- IgM : 5量体(900kDa, 稀に6量体) source、血中に存在する、体内に侵入した異物を5ヵ所の結合部位で数珠繋ぎにすることでがんじがらめにする source。初期感染時(感染後早急)から作られるて異物に対処し、その後IgGに引き継ぐ
- IgD : 1量体(180kDa)、2009年頃までその薬やは不明でしたが、呼吸器感染の免疫を担っているとのこと。上気道感染(扁桃腺、上気道組織)において分泌され、抗原との結合を切っ掛けに好塩基球が活性化するsouece
- IgE : 1量体(200kDa)、寄生虫関連の抗体、IgEとアレルゲンの結合にヒスタミンがマスト細胞から放出されることにより痒み(その他)が症状して注意喚起する役割ですが、量が多いとアレルギーという症状に繋がりますsource
http://www.ketsukyo.or.jp/plasma/globulin/glo_03.html 図1. 免疫グロブリンの種類
感染時のIgM/IgGの血中濃度
https://www.srl.info/srlinfo/infection/feature/feature.html 図2. 免疫グロブリンの挙動、自然免疫の補体活性及び赤血球凝集活性を測定することで、感染と免疫応答を観る
CFとHIの説明
補体結合反応（CF） 抗原抗体複合体と結合した補体を感作血球の不溶血を指標として間接的に証明。 ●群特異性が高い
●比較的早期に抗体消失
●感染スクリーニング用赤血球凝集抑制反応（HI） 赤血球凝集能をもつウイルスの場合、その凝集を抑制する抗体を証明。 ●型特異性が高い
●早期に抗体が上昇、持続する編集履歴
![[Bio-FAQ] タンパク質濃度はどうやって求めますか?[2022/11/16]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2021/02/80F3D755-3019-49C6-BDAE-47D137C87826.jpeg)
![[用語] PDB ; Protein Data Base – タンパク質の立体構造を知る](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2021/02/B886265D-DB46-4164-9376-36ACBE241A2C.png)
![[Protein] 免疫グロブリン – IgMは感染初期からIgGに先んじて作られ、その後、IgGにバトンタッチ! [2020/06/26]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/05/5754D002-C57A-4FC9-8992-BA71D66B5952.jpeg)
