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タグ: AAV9

  • 気になる企業 – GENETHOD – 遺伝子治療開発を手掛けるフランスの非営利団体 – ID5079 [2020/03/29]

    気になる企業 – GENETHOD – 遺伝子治療開発を手掛けるフランスの非営利団体 – ID5079 [2020/03/29]

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    Webinar on ThermoFisher

    フランスのGENETHONは現在、ThermoFisherの傘下になったアメリカのBRAMMERとの間で、遺伝子治療薬のウイルスベクター製造における改良研究について共同発表しました。(Accelerating advancement in gene therapy by improving downstream purification of viral vectors)

    https://vimeo.com/357326837

    GENETHONとBRAMMERの共同発表のビデオから。

    GENETHON

    参考文献1 (2015)からの発表

    フランスのエブリーにあるGenethonは、フランスの筋ジストロフィー協会（AFM）であるAFM-Telethonによって設立された、非営利のR＆D組織

    孤児の遺伝病の研究から臨床検証までの開発に取り組んでいます。 Genethonは遺伝子治療薬の発見と開発に特化しており、神経筋、血液、免疫系、および肝疾患の臨床、前臨床、および研究段階で複数の進行中のプログラムがあります。

    Brammer Bio

    Brammer Bioの製法では、AAVX resin (50 ~ 70% Elution)を使い、回収率は、平均60%を達成しています。

    AAVX resingから漏れ出たLigandの残存量は、8 (ng/1E12 vector gene (vg) )

    参考文献1

    「AAV vector – Slide – GENETHON, 2015
    Baculovirus」より、AAV9 vectorの精製工程とその回収率などの情報を以下に抽出しました。


    (1) AAV9 vector : Harvest (100%)→CEX (60%)→AEX(negative mode, 30%)→AEX (25%)→TFF (20%) →Sterile Fitration: 20% overall


    (2) AAV9 vector : Harvest (200L, 100%)→AAVX (1E12 vg/mL at 450cm/h, 30% full particles,3E12 capsids/mL 80%, DNA reduction factor: 3 to 4 log) →UF/DF (80%) → Sterile Filtration (50mL, 1e13 vg/mL, 80%): 50% overall

    https://www.slideshare.net/PatrickBasanez/bils-2015-genethon-m-hebben

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  • [rAAV-Edu] rAAV9の精製方法 (ウイルスの一般的な精製方法を理解できる) – 特許,2018 – ID2559 [2023/10/23]

    [rAAV-Edu] rAAV9の精製方法 (ウイルスの一般的な精製方法を理解できる) – 特許,2018 – ID2559 [2023/10/23]

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    rAAV9 vectorの精製方法

    培養液のバッファ組成をTFF処理で調整、硫安(AmSo4)沈殿処理と第4級アンモニウム陰イオン交換クロマトグラフィー(HiPrep Q XL)によるFlow through mode、最後にSECによる精製でrAAV9を得る

    rAAV9 vectorの調製方法

    1. Transfection by 3 plasmid (with PEI, FBS-free)
      • 遺伝子治療用としてウイルス・ベクターを使用するはに，目的遺伝子，ウイルスの殻，それてHelper因子，など必要なコンポーネントとしてそれぞれの遺伝子をウイルス増殖用の細胞内に挿入させる．
    2. Post culture
      • 遺伝子を挿入した生産用細胞を培養する．
    3. Harvest supernatant
      • 培養上清からウイルスを取得する場合は，遠心上清を回収する．細胞内に存在するウイルスを取得する場合は，遠心の沈殿画分を回収する．
    4. TFF process
      • バッファ組成を整えたり，ウイルス濃度を高めたり，更に，ろ過液に不純物を透過させて不純物除去したりする．
    5. 1/3 sut. concentration AmSO4 precipitation
      • 疎水性を高くして不純物の沈殿化させる工程(塩析)
    6. centrifuge
      • 33%飽和濃度の硫酸アンモニウム処理して遠心により沈殿化した不純物を沈殿へ分離し上清を回収する．
    7. 1/2 sut. concentration AmSO4 precipitation
      • 更に，硫酸アンモニウムを添加して50%飽和濃度にすることで，更に分割沈殿化させる．
      • 急な塩濃度の上昇は，共沈するのでそれを避けるために分割操作を行う．
    8. centrifuge
      • 遠心して上清を回収する．
    9. Dilution to 7.3 mS/cm
      • カラムクロマトで処理できる条件に整えるために，上清を水(でよい)で希釈して伝導度を下げる
    10. AEX
      • HiPress Q XL 16/10 column chromatograph with flow through mode
    11. TFF process
      • 30kDa : ウイルスの濃縮
    12. SEC column chromatography
      • HiLoad 16/60 Superdex 200, MNH pH6.5, 300mM NaCl, 0.01% F-68

    Highly Efficient Ultracentrifugation-free
    Chromatographic Purification of Recombinant
    AAV Serotype 9

    https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/pdfExtended/S2329-0501(18)30111-6

    Improved methods for purification of recombinant aav vectors, EP2443233A1, 2009

    https://patents.google.com/patent/EP2443233A1/en

    編集履歴

    2019/10/15, Mr. Harikiri
    2023/10/23, 追記(永木の精製ステップについて日本語でコメント追加)