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ウイルス・ベクターと宿主細胞の準備

• ベクターに適合した宿主細胞(master cell bank, working cell bank)
• ベクター
  • construction
  • generation
  • premaster seed
  • master seed
  • working seed
• PCLとは
  • Packaging or Producer Cell Line
  • Three Plasmid Transfectionに代わる生産系である
  • 目的遺伝子以外のAAVベタクー産生に必要な遺伝子を既に組み入れた生産細胞、または、目的遺伝子さえも組み入れた生産細胞
  • Oxgene™️、Vigeneなどが持っている

目標のAAVベタクー発現量

15cm ディッシュ1枚から 1-2×10¹¹ genome copies (GC)、または、10¹¹-10¹² GC/mL（各細胞あたり 2×10⁴ – 1×10⁵ ウイルス粒子）

Material

Plasmid DNA Batch

[ignore]

• non-GMP製造(14.0千万円/3 x Plasmid/200L/3m)
• GMP製造(16.0千万円/3xPlasmid/200L/3m)
• 分析(0.5千万円/3 x Plasmid/3m)
• カルタヘナ申請 (0.5千万円/3m)

[/ignore]

ITRに組換えが少ないプラスミドを得る。

プラスミドの品質: 形質転換後の ITRs による組換えは、プラスミドのサイズを減少させるので、これを抑制させる。Life Technologies社の Stbl3 コンピテントセルをプラスミドの増幅に用いる。

Plasmidの精製

1. プラスミドDNAをE.coliに形質転換
2. シングルコロニー
3. 拡大培養
4. アルカリSDS法による粗精製
   • アルカリ-SDSは、大腸菌染色体ＤＮＡを細胞壁とともに除去するため、プラスミドDNAのみを得るのに信頼性の高い方法　(Lab向き)
5. クロマト精製
6. 脱塩
7. 濃縮
8. Sterile Filtration
9. 分注
10. 凍結保存(-30℃)
11. 二種カルタヘナ法対応(GMP製造開始前)

pDNA培養特許

大腸菌中でプラスミドｄｎａを製造規模で生産するための流加発酵法及び培地 (特許, 2011), link

pDNA精製特許

プラスミド精製　(2007), link

Cytivaによる精製ストラテジー

ヒトおよび動物の遺伝子治療用プラスミドの精製プラスミドDNA (2007), link

アルカリSDS法レジメ

ラボでの調製のレジメを以下に示した。

1. 大腸菌の培養
2. 遠心/E.coli
3. 添加・懸濁(25mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 50mM Glucose), 100μL
4. 穏やかに添加・撹拌(0.2M NaOH, 1% SDS), 200μL
5. Incubation 4℃ for 5min
6. 添加・懸濁 (7.5M 酢酸アンモニウム、pH7.6、氷冷)、150μL
7. Incubation 4℃ for 5min
8. 遠心(15,000rpm x 10min)/sup回収
9. Sup/(100+200+150=450μL)
10. 添加・懸濁(イソプロパノール), 270μL
11. Incubation R/T for 10min
12. 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
13. 添加・懸濁(2M酢酸アンモニウム、pH7.6)、50μL
14. Incubation 4℃ for 5min
15. 遠心(15,000rpm x 10min)/sup回収 (pptにはタンパク質)
16. 添加・懸濁(イソプロパノール)、50μL
17. Incubation R/T for 10min
18. 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
19. 添加・懸濁(70% EtOH)、
20. 遠心pptを乾燥
21. 添加・懸濁; TE(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA pH8.0), 25μL
22. RNA分解: 添加(リポヌクレアーゼA)、1μL
23. Incubation 37℃ for 30min
24. 反応停止: 添加・懸濁(2M酢酸アンモニウム、pH7.6)、12.5μL
25. 添加・懸濁(イソプロパノール)、37.5μL
26. Incubation R/T for 10min
27. 遠心(15,000rpm x 10min)/ppt回収
28. 添加・懸濁(70% EtOH)、適量
29. 遠心pptを乾燥
30. 溶解: TE(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA pH8.0),　25μL

GMPグレード/pDNAの調達

• タカラバイオ – GMPグレードでのブラスミドDNA製造受託 – サイト
• 和研薬 – プラスミドベクター製造 – サイト
• WAKO – GMP準拠設備での高品質なプラスミド生産 – サイト
• メディリッジ – 高品質 プラスミドDNA製造 – サイト
• 徳島大学医学部 – 【学外受託サービス】 プラスミドDNA精製受託 – サイト

種類

1. pAAV
2. pRC
3. pHelper

品質試験

• 無菌試験 (JP 4.06, USP71, Ph Eur 2.6.1)
• Endotoxin (JP 4.01, USP 85, Ph Eur 2.6.14)
• 純度 (紫外線分光)
• 制限酵素地図試験(アガロース電気泳動)

• 塩基配列 (サンガー法)
• CCC含量試験(アガロース電気泳動)
• 宿主DNA (qPCR)
• pH (JP 2.54)

日本薬局方

https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/0000066530.html

薬局方の国際調和

https://www.pmda.go.jp/rs-std-jp/standards-development/jp/0005.html

E.coli 産生株

治療用rAAV Vectorの調製には、3種類のPlasmid DNAが消耗品として必要である。

Plasmid DNAの調製にもGMP製造で行う必要があるため、Plasmid DNAを増やすための産生株(E.coli)の構築が必要となる。

[ignore]

• 製造(1.0千万円/3m)
• 分析(0.5千万円/3m)

[/ignore]

試験項目

• ファージ否定試験(寒天培養)
• 生菌数(コロニー)
• コロニー形成能(目視)
• 栄養要求試験(チアミン要求性、寒天培養)
• 生化学反応(菌種同定試験)
• 表現型試験(UV感受性、寒天培養)

• プラスミド保持率試験(コロニー形成)
• プラスミドコピー数(qPCR)
• 制限酵素地図試験(アガロース電気泳動)
• 塩基配列試験(サンガー法)

[/ignore]

製造に関しての考慮事項

Transfection

以前は、以下のリン酸カルシウムが使用されたりしていたが、最近は、ポリエチレンイミン (PEI)を使用するが、よりグレードの高いPEIが開発されている。

• コストを抑えるためにリン酸カルシウムを使用できるが、pHにセンシティブ(0.05の変動でも影響を受ける)であるため、HBSバッファの使用を推奨する

阻害要因

トランスフェクションの阻害要因には、以下のDNAセンサーに関わるものが考えられるsource: invivogen.com。

いずれも、多少なりとも細胞死に関わっている。

• 細胞質の核酸センサー : dsDNAの感知
  • AIM2
    • AIM2は、パターン認識受容体 (その他にNLRP3)
    • dsDNAに強く反応、カスパーゼ1の活性化、炎症性サイトカイン誘導(IL-1β、IL-18)[1]
  • サイクリックGMP-AMPシンセターゼ(cGAS)
    • STING / TBK1 / IRF3シグナル伝達、１型IFN刺激因子(ISG)の発現誘導

Post Transfection Culture

プラスミドの濃度や比率、PEIの比率、加えて、培養条件によっては、発現効率は異なってくると考えられる。DoE手法による詳細な検討の実施が必要である。

• 培地の血清の有無によって、発現量が異なる。Serotypeによっても異なる
• トランスフぇクション後、72時間後まで引っ張れば、効率的であったとの報告もあるが、5日後で効率的であったとの報告もある(44)

44)
Lock M., Alvira M., et al.
Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum. Gene Ther. 2010;21(10):1259-1271. [PubMed]

Harvest & Clarification

目的rAAV以外の不純物は、ヒトへの投与では炎症の元となる

• 細胞由来たんバク質
• 細胞由来DNA
• 血清タンパク質
• 培地成分
• ヘルパーDNA または、ヘルパーウイルス

References:

[1]. Patrick, K.L. et al. 2016. For Better or Worse: Cytosolic DNA Sensing during Intracellular Bacterial Infection Induces Potent Innate Immune Responses. J Mol Biol 428, 3372-3386.

発現タイターの検討

GFP コントロールウイルスでトランスフェクション効率条件を検討する。

編集履歴
2020/03/31 Mr.HARIKIRI
2020/10/14 追記(pDNAの精製、GMPグレード受託情報)

Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties, 2015

各SerotypeのrAAVの精製方法の文献からreviewした文献

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5388796/?report=classic