カテゴリー: BIOLOGICS

[Bio-Edu] イオン交換クロマトグラフィの原理 – バイオロジクスの製造における基本 [2021/02/13]
イオン交換の原理を使ったクロマトグラフィ

文字通りイオンを交換反応で結合できる樹脂 (レジン) を使ったクロマトグラフィです。カラムにパックすれば陰イオン交換カラムクロマトグラフィーとなります。パックしない場合をバッチクロマトなどと呼びます。

タンパク質は、アミノ基やカルボキシル基を持っているので、プラス・チャージも、マイナス・チャージも持っています。

等電点 (pI)とは、タンパク質全体として電荷が中和されている状態の溶液pHを指します。因みに、あるタンパク質を等電点にpH調整すると、沈殿すると言われています。

イオン交換分離の原理と分離に影響する4つの因子とは？ – ThermoFisher –
https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/principle-and-factors-of-ion-exchange-separation/

実務では
- 目的タンパク質の等電点(pI)を知る
- 陰イオン交換体に結合させたい場合は、目的タンパク質の電荷を負にするために溶液pHを塩基性に調整する
- 陽イオン交換体に結合させたい場合は、目的タンパク質の電荷を正にするために溶液pHを酸性に調整する
- イオン交換体との結合を弱めたい場合は、pHでコントロールできるか、実務的には塩濃度を上げることで、イオン結合を弱める手法をとる。もちろん両方を組み合わせることも可能。
原理

目的のタンパク質の電荷と溶液中の電荷を帯びたイオンとの競合により、イオン交換体(レジン)との親和性に強度が付くことで、吸着てずにパススルーさせたり、吸着後に溶出させたりする。

タンパク質の場合、弱塩基性、弱酸性のアミノ基を思っており、有効表面電荷の正負および強度に応じて、イオン交換原理によるクロマトグラフィが可能となる。下図のようにpHを酸性から塩基性にタンパク質が溶けている溶液pHを変化させた時、有効表面電化は、プラスチャージのカチオンからマイナスチャージのアニオンに変化していく。電荷がちょうどゼロ(0)になるpHを等電点 (pI)という。

Cytiva, https://www.cytivalifesciences.co.jp/newsletter/biodirect_mail/technical_tips/tips51.html

なぜpHを上げていくと電荷がマイナスチャージになるのか

前述のCytivaの参考文献に示されているように、pHを酸性から塩基性に上げていく場合、なぜ電荷が、プラスからマイナスになっていくのか、その原理を以下に解説します。

酸と塩基・代謝概要 – 熊本大学、平成25年4月15日病態生化学分野 (生化学2)教授、山縣和也 –
http://www.medic.kumamoto酸と塩基・代謝概要-u.ac.jp/dept/biochem2/class/250415-1.pdf

タンパク質は、アミノ酸で作られているので、単純化してアミノ酸で考える。アミノ酸は、アミノ基(-NH2), カルボキシル基(-COOH)を持っており、両性電解質である。例外は、プロリンでアミノ基の代わりにイミノ基を持つ(本当はイミノ酸)。
- pI; 等電点となるpHでは、以下のように解離していて総体としての電荷はゼロである
  - (-NH2) → (-NH3+)
  - (-COOH) → (-COO-)
- 酸(HCl)を添加していくと、H+が増えるため以下の様に乖離して総体として正電荷であり、陽イオン交換体に結合できる
  - (-HN3+) → (-HN3+)
  - (-COO-) → (-COOH)
- 塩基(NaOH)を添加していくと、H+が減るため以下の様に解離して総体として負電荷となり、陰イオン交換体に結合できる
  - (-HN3+) → (-HN2)
  - (-COO-) → (-COO-)
pHとは? – 鈴研株式会社 –
https://www.suzuken-ltd.co.jp/choose/ph/

pHの理解

pHは水素イオン濃度を表しています。単純式は以下の通りです。

pH = ‐log [H⁺]　

水は、以下のように電離しています

H₂O = H⁺ <-> OH^–

pHの最大と最小は、1と14です。水素イオン濃度と水酸イオン濃度を掛けるといつでも14になります。

H⁺濃度 × OH^–濃度 = 10^-14 mol/L

イオンの溶離効果は、1 価より2価の方が高い。
- 陰イオン : Na₂CO₃ > NaHCO₃ > NaOH（KOH)
- 陽イオン : H₂SO₄> メタンスルホン酸 = HCl
イオン交換分離の原理と分離に影響する4つの因子とは？ – ThermoFisher Scientific –
作成者 LATB Staff, 01.19.2017

編集履歴
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2021/02/13 Mr.HARIKIR
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2021年2月14日
気になる企業 — 生物科学安全研究所 (RIAS) [2023/10/15]
RIASと丸紅ケミックス

2021年、丸紅ケミックスと生物科学安全研究所(RIAS)は，バイオ医薬品や再生医療等製品のウイルス安全性試験，有効性試験の受託サービスを提供するパートナーシップを結んで受託強化を図っいる．
- 2021年夏よりウイルス安全性評価ガイドライン（ICH-Q5A）に準拠するウイルス否定試験・ウイルスクリアランス試験のBSL3に対応する新ラボでの試験受託と新ラボの監査受け入れを本格的に開始した．
- 生物科学安全研究所は、動物用医薬品や飼料添加物などの試験研究を行う一般財団法人
- 狂犬病抗体検査や食品検査などの公益事業も行っている．
- 動物用医薬品等の開発・承認申請を支援するコンサルタント業務や、生物科学に関する情報発信やシンポジウムの開催なども行っている．
顧客
1. 動物用医薬品製造業者
2. 飼料添加物製造業者
3. バイオ医薬品開発・製造企業
4. 再生医療等製品開発・製造企業
受託サービス
1. 安全性試験
2. 有効性試験
3. 狂犬病抗体検査など(渡航サービス)
編集履歴

2021/02/03, Mr.Harikiri
2023/10/15, 追記(詳細追加)
2021年2月3日
気になる企業: IDファーマ – センダイウイルス・ベクターの技術で希少疾患に対する遺伝子治療薬の開発を進める [2021/01/30]
IDファーマ

株式会社IDファーマは、CROなどを手がけるアイロムグループの100%小会社で、先端医療関連の開発を担う。センダイウイルス・ワクチンや遺伝子治療用ベクターなどの領域を担う。主力技術を活かして新型コロナウイルス・ワクチン開発も進めている。
1. 再生医療や遺伝子創薬にとりくむバイオベンチャー
2. センダイ・ウイルス・ベクターを利用した安全性の高い遺伝子導入技術
3. iPS細胞政策きっとや遺伝子治療製剤などの製品を開発・製造・販売している．
I’ ROM GROUP
先端医療事業｜事業紹介 | アイロムグループ (iromgroup.co.jp)

再生医療や遺伝子治療分野を専門に医薬品の研究・開発や製造、販売を手がける会社
株式会社ＩＤファーマ｜Baseconnect

2020/05/01, アイロムグループ、子会社IDファーマが国立感染症研究所と新型コロナウイルス新規ワクチンの共同研究開発を開始 ^{source: 日本経済新聞}
- 資本金 3,000万円
- 従業員 22名
- ベクター製造サービス
- iPS細胞作成キットCyto Tune iPS
- センダイウイルス・ベクター(SeV)を使ったiPS細胞作成技術
- SeVにFGF2遺伝子搭載した治療薬の開発
- レンチウイルス・ベクター(サル免疫不全ウイルス;SIV)を用いた網膜色素変性症治療薬の開発
出典 : ID Pharma
- SeVを用いて、感音難聴である突発性難聴の治療薬開発: 非臨床では蝸牛にベクターを注入することで回復することが確認されている
出典 : ID Pharma
- バイオナイフ(BioKnife)の開発 : SeVを使用して、センダイウイルスの粒子形成に関わるM遺伝の欠損、腫瘍細胞が持つ酵素の存在により膜融合を活性化する膜タンパク質の遺伝子の追加、などのデザインが施されている。これにより、腫瘍細胞に感染したSeVは、腫瘍細胞の膜表面に膜融合する膜タンパク質を作らせることで、腫瘍細胞は細胞融合し、やがて死滅する。
IDファーマ製品紹介
https://www.idpharma.jp/products/

アイロムグループの概要

investing.comより
- 従業員 : 796人 (2021/01現在)
- 4つのセグメント
  - 治験施設支援機関（SMO）事業
  - 開発業務受託機関（CRO）事業
  - 先端医療事業
  - メディカルサポート事業
編集履歴
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2021/01/30 Mr.HARIKIRI
2023/10/15,文言整備
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2021年1月30日
[Bio-Edu] タンパク質の「イオン交換体」による精製原理 – 目的タンパク質の物性を知る必要性 [2021/02/25]
はじめに

タンパク質の精製とは、どのような作業をするのでしょうか? 精製とは目的物と異なる物質を取り除き、目的物質の割合を上げること、すなわち純度を高めることです。

ここでは、イオン交換体を用いたタンパク質の精製の原理について解説します。

イオン交換体

先ず、イオン交換について説明します。その前に，タンパク質はアミノ酸の数珠繋ぎで作られています(ポリペプチド)。具体的には，アミノ酸のアミノ基と隣のアミノ酸のカルボキシル基とがペプチド結合してポリペプチドを作っています．

このポリペプチドの末端や側鎖(アミノ酸ごとの)には，フリーのアミノ基やカルボキシル基は、溶液のpHに応じてイオン化しています。そのイオン化によって、アミノ基(NH2)は、Hが一つ増えてNH3⁺になり正に荷電します。カルボキシル基(COOH)は、逆にHが減ってCOO^–になり負に荷電します。Hを増やすためには、塩酸などの酸を添加します．
1. -NH3+ ⇌ -NH2 + H+
  - (アミノ基は弱塩基であり水に溶けると右の式に傾く)
  - (右の式に塩酸を添加してH+濃度を上げるとアミノ基に戻る)
2. -COOH2+ ⇌ -COOH + H+
  - (カルボキシル基は弱酸であり水に溶けると上記左の式に傾くカルボキシラートイオンになる)
  - (左の式に塩酸を添加してH+濃度を上げるとカルボキシル:-COOH2+基に戻る)
Hを減らすには、NaOHなどの塩基を添加します。アミノ基とカルボキシル基がいずれもイオン化していない状態、すなわちNH2とCOOHになっているpHを等電点(pI)といい、荷電していない状態です。
1. NH2 →(NaOH adding)→ NH- (アミノ基が正荷電する)
2. COOH →(HCl adding)→ COOH (カルボキシル基が負荷電する)
イオン交換体は、負に荷電する合成化合物、または、正に荷電する合成化合物を樹脂(レジン)に結合させているものを言います。陰イオン交換では、陰イオンとイオン結合が可能な正に荷電した合成化合物を結合させたレジンを使用します。

タンパク質の溶解液のpHを調節して、その目的のタンパク質が負に荷電するか正に荷電するかを設定し、それに応じたイオン交換体を用いて、そのレジンにタンパク質を結合させることで、目的のタンパク質を効率よく回収することができます。具体的には、イオン交換体に結合させたタンパク質は、今度はそのレジンから解離させるために、そのイオン結合を切る条件にレジンの環境を変えてやります。すると、目的のタンパク質がレジンから溶出さされます。

イオン交換クロマトグラフィ

レジンの置かれる環境を変化させるために、緩衝液(パッファ)をレジンに添加したり、バッファのみを取り除いたりすることで、レジンの置かれている環境の変化を作ってやります。

具体的には、バッチ法とカラム法があります。以下にそれぞれ説明していきます。

バッチ法

レジンに緩衝液を添加してスパテルでかき混ぜて、レジンの環境の均一化を行います。次に、
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編集履歴
2020/06/22 はりきり(Mr)
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条件の基本は、電気伝導度とpH

conductivityとpHの組み合わせ条件を網羅的に実験します。最初は、吸着条件です。その後、洗浄条件も必要ですが、簡便さを追求する場合は、吸着条件の実験データから目的タンパク質の部分的精製条件とすることも可能です。
- レジンの選定
  - 陽イオン交換
  - 陰イオン交換
  - 疎水担体
  - マルチモーダル
- 電気伝導度(conductivity)
- pH
- その組み合わせ
- レジンの選定
検討の概要
- 陽イオン・陰イオン交換レジン及び疎水担体では、pHとNaCl濃度の組み合わせ
- ハイドロキシアパタイト(HA)では、NaCl濃度とリン酸(K2HPO4)の組み合わせ
- Adhere、MMCでは、陽イオン・陰イオン交換レジンと同様、pHとNaCl濃度の組み合わせを使いますが、遠濃度は、高めの範囲を設定します。
実験方法

レジンの準備
- レジンの洗浄(酸・アルカリ、中和、最後に水に平衡化)
- 遠心してWet volumeを測定
- その一部を採取して、数日乾燥させて、前後の重さを測定
- レジンのwet volume(g)を使用した時、含まれる水の量を見積もる(計算しておく)
出発材料の準備
- 培養上清
- 組成が不明でも良い
- 培養液を水で希釈系列を作る
  - 1倍(希釈無し), 0.1mLを調製
  - 1.5倍, 0.1mLを調製
  - 2.0倍, 0.1mLを調製
  - 5.0倍, 0.1mLを調製
  - 10倍, 01mLを調製
吸着反応とアッセイ
- 培養液の希釈系列にレジンを添加
  - 96 well microplateで(プレートミキサー)も良い
  - 蓋つき試験管でも良い(サクラローターで攪拌)
  - 室温, 1hr
- 分析
  - SDS-PAGE
  - 特異的アッセイ
- 希釈率を決定
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2021/02/25, Mr.HARIKIRI
2021年1月25日
[Bio-Equip] 培養シャーレ – セルスタック ; CellSTACK – 接着性の細胞の培養を効率的に作業できるアイデアに満ちた構造 [2021/01/20]
セルスタック

セルスタックとは，Corning CellSTACK培養チャンバーでプラスチック製の接着細胞用の多段培養シャーレです。これはもう「ラボ用」とは呼べないかも知れません。遺伝子治療用のAAVベクターの治験薬製造に使っているCMOも存在します。
- 5段の製品 : Cell STACK5
- 培養面積 : 3,180cm²
- 注入口 : 直径 26mm
- 33mmネジキャップには孔サイズ 0.2µm の疎水性メンブレンが直接シールされており,コンタミネーションリスクを抑えたガス交換が可能です
- 別売りの化学薬品耐性のあるフレキシブルヒートシールチューブがついた直径 33mm ネジキャップ :培地や細胞液を直接無菌的に出し入れ可能
- USP クラス VI に適合したポリスチレンは、光学的な透明度と機械的強度が優れている
- γ-線滅菌済み, ノンパイロジェニックを保証
- 出荷前に100% リークテストを実施
¥ 35,200 per case (2021/01)

Refer to corning

ポリスチレン製セルスタック – 5チャンバー, ベントキャップ付き,　（2個/ケース）
https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/JP/ja/アプリケーションから製品を探す/セルセラピーとワクチン/セルスタック/Corning®-CellSTACK®-培養チャンバー/p/3319?clear=true

多品種には

昔ながらのフラスコ(下図)があります。これは、僕がバイオを始めた40年前には、もう既に存在していました。FL細胞という細胞をこのフラスコで静置培養すると、フラスコ面にモノレイヤに増殖します。培地を取り除いた後、トリプシン溶液処理でフラスコから細胞を剥がします。得られた細胞の内の大半は、ある使用目的に使い、残りは、継代培養(CO2インキュベータ)に回します。これを3、4日のサイクルで1年中培養するわけです。当時は、10~20本を培養していました。

Refer to ThermoFisher

細胞培養フラスコ
https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cell-culture/cell-culture-plastics/cell-culture-flasks.html
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2021/01/20 Mr.HARIKIRI
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2021年1月20日
[用語] pharmacovigilance; ファーマコビジランス; 安全性情報管理 [2021/01/19]
はじめに

医薬品の開発が終了し承認審査された直後では、その医薬品の安全性情報は不十分であるため、市販後のPV活動が重要となる。最近では、開発段階から市販後においてもPV活動の実施が求められる時代となった。そのためには、医薬品リスク管理計画(RMP)の作成と実行によりリスク・ベネフィットのバランスを最大化することも重要な活動となってきた。

スキーム
1. 科学的安全管理
2. 薬事関連規制
3. 日常的なPV業務
pharmacovigilance; 安全性情報管理

製薬会社における薬の安全性に関わる業務を意味します。医薬品の適正管理を維持するために、市販後の調査として業務がスタートします。薬が世に出ている限り継続的に情報の収集が行われます。患者に対して広く長く使用することで、臨床試験で認められなかった新たな副作用や効果の発見があります。

WHOによる定義:

「医薬品の有害な作用または医薬品に関連するその他の問題の検出・評価・理解・予防に関する科学と活動」

厚生労働省に対して医薬品や医療機器が承認申請されると製薬会社や医療機器会社は、約1年以内で当局から承認され、製造および市販することができます。その際、当然、日本では薬価、保険点数が付きます。市販された後も副作用などの実態調査が製薬会社の責任のもと実施されます。この活動をpharmacovigilance といいます。

pharmacovigilanceのもと実施される具体的な手法に、製造販売後調査; Post marketing Surveillance (PMS)があります。

因みに、承認申請は、厚生労働省に対して行いますが、実際に審査する実施機関は、独立行政法人医薬品医療機器総合機構（PMDA; Pharmaceuticals and Medical Devices Agency)です。

安全性情報管理(PV・ファーマコビシランス)とは

https://www.tempstaff.co.jp/kmenu52/faq/pharmacovigilance/
「医薬品に関する有害な作用やその他の問題の発見、評価、理解と予防に関する科学と行動」とWHOによる定義がなされている。

製造販売後調査(PMS)と医師の役割

製造販売後調査; Post Marketing Surveillance
https://japhmed.jp/PM06.pdf

製造販売後調査(PMS)で新薬の上市後も有効性と安全性を調べます
https://www.cro-japan.com/clinical_trial/PMS.htm

医療機器の製造販売後調査の現場と留意点について
https://www.pmda.go.jp/files/000203239.pdf

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2021/01/19 Hr.HARIKIRI
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2021年1月19日
[Bio-Vector] 人工染色体 – 目的細胞に導入して安定発現細胞株を作る – AAVベクターの生産株として適用できるのか? – chromocenter/TaKaRa [2021/01/15]
はじめに

遺伝子組換えで目的物を作る方法には、一過性発現と安定発現細胞株を使う方法があります。目的物が1種類の場合、例えは抗体医薬の場合、殆どは一過性発現ではなく安定発現細胞株を樹立し製造に使用されます。

遺伝子治療で使用されるAAVベクターの作り方の主流は、動物細胞や昆虫細胞に対して、構成要素として必要な遺伝子をコードする3つのプラスミドDNAをトランスフェクションする一過性発現法であるThree Plasmid Transrectionです。

ウイルスベクターの新たな作り方

ここ数年、遺伝子治療医薬品のコマーシャル品が承認されて、その製造方法に関する技術についても注目されてきています。Three Plasmid Transfectionと同様の手法により、Produce Cell LineやPackaged Cell Line (PCL)と言われる、3つの Plasmideを目的細胞に導入することで安定発現細胞株を作成してくれるCDMO (Vigene社など)もあります。

ここで紹介する人工染色体を用いた安定発現細胞株の構築は、PLCと比較して優位性があるのでしょうか? 今後、結論を出したいとおもていますが、今回は、人工染色体を導入した安定発現細胞株の作り方について、TaKaRaとchromocenterのホームページから情報をまとめました。
- Three (3) plasmid method
  - 一過性発現
  - 製造の段階で用意した3つのプラスミド(一定の比率)を使い、薬剤によるトランスフェクションして、一過性で生産させる
- PLCによる生産株樹立
  - 安定生産細胞株
  - 3つのプラスミドを一つずつトランスフェクションとスクリーニングして構築
  - 製造時に、細胞株を拡大培養
- 人工染色体導入による生産株樹立
  - 安定生産細胞株
  - 必要な構成遺伝子をコードした人工染色体を細胞にトランスフェクションして構築
  - 製造時に、細胞株を拡大培養
人工染色体の特徴

TaKaRaのサイトを参照しました。
- 導入できる目的遺伝子の大きさは数Mb(大きいサイズ可能)
- 染色体とし振る舞う
  - 細胞分裂により受け継がれる
  - 一定のコピー数(コントロール可能)
  - 宿主遺伝子の破壊の可能性が低い
- 導入された遺伝子の発現について、サイレンシング、過剰発現されることは少ない
人工染色体の構造

マウスの染色体を使用したものをMouse Atrtificial Chromosome (MAC)、ヒトの場合をHuman Artificial Chromosome (HAC)と言います。
- Wild type 染色体の構造
  - テロメア
  - セントロメア
  - 遺伝子領域 (内在遺伝子)
  - テロメア
- 人工染色体の構造
  - (ヒト21番染色体(35Mb)の場合)
  - (内在遺伝子の削除)
  - テロメア
  - セントロメア
  - (loxPサイトの導入)
  - 人工テロメア
  - (このHACでは、5Mb)
遺伝子搭載サイズ
- Plasmid
  - ~ 20 kb
- Virus
  - ~ 150 kb
- BAC/PAC
  - ~ 300 kb
- YAC
  - ~ 1Mb
- HAC, Chromosome
  - ~ 100 Mb
従来ベタクーとの比較
- プラスミドベクター
  - 2本鎖DNA
  - 宿主染色体に取り込まれる *1
  - 遺伝子導入サイズは、~ 300 kb
  - 発現量は、挿入部位やコピー数に依存(コントロールが難しい)
  - 発現の安定性は、低く消失の可能性がある
- アデノウイルスベクター
  - 2本鎖DNA
  - 宿主核内で独立存在、一部は宿主染色体に組み込まれる
  - 遺伝子導入サイズは、理論的には~ 36 kb、現状8 kb
  - 発現量は、感染効率に依存(ある程度のコントロールは可能)
  - 一過性発現で発現は不安定性
- センダイウイルスベクター
  - 1本鎖RNA
  - 宿主細胞室内で独立存在
  - 遺伝子導入サイズは、 ~ 5 kb (数遺伝子)
  - 発現量は、感染効率に依存(ある程度のコントロールは可能)
  - 一過性発現で発現は不安定性
- 人工染色体ベクター
  - 2本鎖DNA
  - 宿主核内で独立存在
  - 遺伝子導入サイズは、理論的には制限はない。現状~ 2.4 Mb
  - プロモーターで強弱は決まり、発現量は一定
  - 発現は安定性。転写レベルとして50世代以上
```
*1 : 宿主染色体に組み込まれる原理として1の考察は、そもそも裸のDNAは染色体構造を取っていないことを理解しておく。輪っか状のpDNAであれば、核内に独立存在可能であると考えられるが、pDNA調整過程で1本鎖DNAが微量に混入する。これが、宿主染色体に組み込まれると理解される(Mr.Harikiri)
```
chromocenter社の方法

先ずは、目的遺伝子を持つ人工染色体を作成します。目的の染色体二は、薬剤耐性遺伝子タグが付けられます。

ドナー細胞の作成

1. 挿入型遺伝子搭載法

以下の構成要素でMAC/HACを作成し、これらを内包する「ドナー細胞」を作成します。
1. MAC作成の場合
  - 人工染色体ベクター
    
    バクテリア人工染色体 (BAC, loxPやHPRT領域が必要)、または、
    
    酵母人工染色体 (YAC)
2. MAC保持 CHO hprt -/-準備
3. 目的遺伝子搭載ベクターの添加(+Cre)
4. ドナー細胞の取得 (目的遺伝子が搭載されたMAC(hprt再構築)を有する)
5. MMCT法により安定発現細胞株の取得
  - 以下に説明したMMCT法を実施
  - 目的遺伝子搭載のMACを保有する目的細胞
2. 転座型遺伝子搭載法

ヒト染色体導入マウスA9細胞ライブラリー等から、目的遺伝子領域を含む細胞を選択
1. ヒト染色体導入マウスA9細胞を用意
  - 耐薬剤遺伝子を含む
2. DT40細胞内
  - 相同組換え
  - 不要な染色体領域の切断
  - BS/loxP (部位特異的組換え配列) 挿入
  - 人工テロメア挿入
3. MAC保持のCHO細胞を用意(ドナー細胞)
  - MMCT
  - Creによる相互転座
  - HAT選択
  - 転座型MACを保持する細胞の取得
4. MMCT法により安定発現細胞株の取得
MMCT法(微小核細胞融合法)
1. ドナー細胞を準備
2. コルセミド処理(48~72hrs)
  - 一つの核膜に包まれていた染色体が、個別に包まれ微小核が形成される
3. サイトカラシン処理
  - 細胞骨格を壊し、微小核を遠心分離にて取得する
4. ろ過精製
  - 8μm → 8μm → 3μm
5. レシピエント細胞に微小核を混合
  - フィトヘマグルチニン; PHA (架橋剤)
  - ポリエチレングリコール; PEG (融合剤)
6. スクリーニング
  - 薬剤耐性により選別培養する
人工染色体ベクターによる安定発現細胞株作製 – TaKaRa, chromocenter社の紹介 –
https://catalog.takara-bio.co.jp/jutaku/basic_info.php?unitid=U100009029

chromocenter – ホームページ
http://chromocenter.com

編集履歴
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2020/01/15 Mr.Harikiri
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2021年1月15日

[Gene Therapy] AAV Vectorの特徴、および他のベクターとの比較 / その他、参考文献 [2021/01/04]

はじめに

核酸を医薬品にする場合，その核酸の配列が患者の染色体に組み込まれる危険性が以前から懸念されています．更に，染色体に外来のDNA断片が挿入されることで，その細胞の癌化が生じる懸念があるわけです．

それでも，どうしてもその核酸関連の医薬品を使用しなければならいない場合もあります．これは，利益と効果の問題です．医薬品とはその利益と効果の天秤に乗っかっているのです．

2023年現在までに，2019から起きたCOVID-19の予防薬として核酸ワクチンが全世界的に使用されました．その結果，mRNA医薬品がCOVID-19の予防薬として成功を収めたことで，さらなる次のワクチンの開発に拍車がかかりました．例えば，インフルエンザやその他感染症のワクチンです．

ヒトの染色体に組み込まれるリスクが高いのは，核酸医薬のなかでもDNAの場合です．染色体はDNAでできているためです．

modernやpfizerが開発したCOVID-19ワクチンはmRNAですが，mRNAは体内での安定性が高くないため比較的すみやかに分解されます．そのため，mRNA自体による副作用は低いと考えられています．

それでも，mRNAはDNAに変換される反応経路が存在するためmRNA由来のDNA断片が細胞の染色体に挿入されてしまう可能性が考えられます．具体的には，RNAからDNAに変換する逆転写酵素の存在です．ある種の癌細胞では，この逆転写酵素を多く作るものもあるようです．そのような場合，RNAがDNAに変換されやすくなり，染色体へのDNA断片の挿入の可能性が無いとは言えないのです．

核酸関連の医薬品では，癌化のリスクが付きまといます．

ウイルスベクター

遺伝子治療用のウイルスべクター(非増殖性)は、ウイルスが細胞に感染する機構を利用して、組み換えた遺伝子を細胞内に導入できる

レトロウイルス
- 染色体への組み込み : 有り(挿入変異)
- 構造
  - エンベロープ
    - カプシド
      - ウイルスゲノム (1本鎖RNA、+鎖逆転写酵素)
        
        野生型 : LTR – gag – pol – env – LRT
        
        非増殖性 : LTR – promoter – 目的遺伝子 – LRT
アデノウイルス
- 染色体への組み込み : 低頻度
- その他の仲間
  - ヘルペスウイルス
  - ポックスウイルス
- 構造
  - 20面体
  - カプシド
    - ウイルスゲノム (2本鎖DNA 36 kb)
      - 野生型 : ITR – E1 – E3 – ITR
      - 非増殖性 : ITR – プロモーター – 目的遺伝子 – ΔE1 – ΔE3 – ITR
アデノ随伴ウイルス (AAV)
- 染色体への組み込み : 低頻度
- 構造
  - カプシド
    - ウイルスゲノム (1本鎖DNA 4.7kb)
      - 野生型 : ITR – Rep – Cap – ITR
      - AAVベクター : ITR – プロモーター – 目的遺伝子 -ITR
レンチウイルス
- レトロウイルス科に属する
- 粒子サイズ : 100 nm
- 染色体への組み込み : 有り(挿入変異の可能性、野生型HIVの病原性)
- 構造
  - エンベロープ
    - カプシド
      - ウイルスゲノム (1本鎖RNA 8kb, 2本鎖DNAに変換する逆転写酵素を持つ)
センダイウイルス
- 粒子サイズ : 150 ~ 250 nm
- 1本鎖・マイナスRNA (RNA型RNAベクター)
- 染色体への組み込み : 無し
- 構造
  - エンベロープ
    - カプシド
      - ウイルスゲノム (15 kb)
        
        野生型 : N – P/V/C – M – F – HN – L
        
        F遺伝子欠損型 : 目的遺伝子 – N – P/V/C – M – HN – L

注) mRNAは、プラス鎖RNA。プラス鎖RNAウイルスには、ピコルナウイルス、フラビウイルス、トガウイルスがある。マイナス鎖RNAウイルスには、インフルエンザウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、フィロウイルスがある。2重鎖RNAウイルスには、レオウイルス、ロタウイルスが代表的。

非ウイルス・ベクター

プラスミド
- DNAをリポソームやポリマーで製剤にしたもの
- 染色体への組み込み : 低頻度
- 輪っか状
  - 複製機転 → プロモーター → 目的遺伝子 → poly A付加シグナル → 洗濯マーカー遺伝子 →
バクテリアベクター
- 遺伝子改変した細菌

ベクターの特徴まとめ

Vector	vivo	WT 病原性	Integration to genome	mutation risk	duration	重大事故
AAV Vector	in	none	none	none	long	腫瘍発生の報告はない
Adenovirus Vector	in	any	none	any	short	免疫原性高い。1999年大量投与による死亡事故(米)	comercial
Herpes Virus Vector	in	any	any	any	short		Zolgensma(AveXis), Luxturna,(Spark), Glybera(uniGure)
Plasmid Vector	in	n/a	none	none	short		Coteragen
Retrovirus Vector	in/ex	any	any	many	long	白血病
Lentivirus Vector	ex	any	any	many	long		Kimria

参考文献

AAVの発見

Adenovirus-Associated Defective Virus Particles Robert W. Atchison¹, Bruce C. Casto¹, William McD. Hammon¹ See all authors and affiliations Science 13 Aug 1965: Vol. 149, Issue 3685, pp. 754-755 DOI: 10.1126/science.149.3685.754
https://science.sciencemag.org/content/149/3685/754

AAV2全塩基配列

Nucleotide sequence and organization of the adeno-associated virus 2 genome. J Virol. 1983 Feb; 45(2): 555–564. PMCID: PMC256449PMID: 6300419, A Srivastava, E W Lusby, and K I Berns Copyright and License information Disclaimer
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC256449/

AAV3全塩基配列

Nucleotide Sequencing and Generation of an Infectious Clone of Adeno-Associated Virus 3, Virology, Volume 221, Issue 1, 1 July 1996, Pages 208-217
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC256449/

血清型

Clades of Adeno-Associated Viruses Are Widely Disseminated in Human Tissues, J Virol. 2004 Jun; 78(12): 6381–6388. doi: 10.1128/JVI.78.12.6381-6388.2004PMCID: PMC416542PMID: 15163731
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC416542/

Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes _ Elsevier Enhanced Reader

Achieving High-Yield Production of Functional AAV5 Gene Delivery Vectors via Fedbatch in an Insect Cell-One Baculovirus System. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 13 June 2019 Crown Copyright a 2019
https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/pdf/S2329-0501(19)30020-8.pdf

遺伝子治療用製品の開発における国内と海外の規制動向 —5年間の進展—、2016.6.16, 国立薬品食品衛生研究所、遺伝子医薬部、内田恵理子
https://www.nihs.go.jp/mtgt/section-1/related%20materials/201606.pdf

「L-dopaをドパミンに変換する酵素AADCをコードする遺伝子導入による遺伝子治療」に関する文書。2006年

① 遺伝子治療の臨床試験において、3つのプラスミドの製造を受託している会社(CMO)、Avigen社およびGenzyme社について記載がある。いずれも厳密に品質管理していると記載がある。
② Avigen社は、製造に使用するHEK293細胞のMaster Cell Bankを作成し品質管理は、専門の検査会社のBioReliance Corp. Rockville. MD, US)で実施されて安全性が確認されている。
③ 細胞の遺伝子型、表現型による安全性の確認では、細胞内酵素(lactate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, dehydrogenase, nucleoside phosphorylase)の電気泳動法による発言パターンの確認して、他種細胞の混入を否定している。安定している4から20世代数のMCBでのVector製造を実施している
④ アデノウイルスベクター全身投与された患者が死亡した例(1999, US)、レトロウイルスベクターを投与された免疫不全症患者が、白血病を発症した例の記載(2002-2005, FR)
https://www.nihs.go.jp/mtgt/section-1/related%20materials/201606.pdf

遺伝子治療用ベクターの定義と適用範囲, 2013 – 国立医薬品食品衛生研究所内田　恵理子 –
https://www.mhlw.go.jp/file/05-Shingikai-10601000-Daijinkanboukouseikagakuka-Kouseikagakuka/0000020310.pdf

2. センダイウイルスベクター : ベクター開発と医療・バイオ分野への応用 – ウイルス　第57巻第1号, pp.29-36, 2007 –
http://jsv.umin.jp/journal/v57-1pdf/virus57-1_029-036.pdf

レンチウイルス基礎情報
https://www.jnss.org/others/virus_vector/Lenti.htm

RNAウイルス – wikipedia –
https://ja.wikipedia.org/wiki/RNAウイルス

第15章ウイルスと病気

各種ウイルスの構造を理解できる(Mr.Harikiri)
http://jsv.umin.jp/microbiology/main_015.htm

編集履歴

2021/01/04 Mr. Harikiri
2023/03/25 追記(はじめに)

2021年1月4日

気になる企業 — 生物科学安全研究所 (RIAS) [2021/01/03]
RIASと丸紅ケミックス

2021年より、日本国内でのウイルス安全性試験の受託強化を図る。日本国内の総代理店は、丸紅ケミックス。
- RIASのウイルス測定関連施設の改修によりBSL2, BSL3対応とする
2021年1月3日
[GMP] FDAの発するワーニングレターなどは、FDAの活動について知ることができる – サーチエンジン
GMPを知るには

FDAは、GMPの番人であると言っても過言ではない。初学者は、そのようにまず認識しておいても間違いない。世界中の医薬品製造サイト(工場)は、FDAの認定を受けている場合、定期的な監査を最低限受ける必要がある。医薬品として製造に適しているGMPシステムを構築し維持しているかを確認される。

FDAのワーニングレターは、FDAがどのようなことを注視しているかを知ることができる。

Warning Letter due to Inadequate Pressure Stage Concept and Particle Monitoring, 2020/12/09 – ECA Academy –

インドの製薬会社は最近、換気システムと圧力レベルの維持、および防腐加工エリアでの粒子モニタリングの欠陥により、米国FDAから警告レターを受け取りました。さらに、微生物検査も批判されました。
https://www.gmp-compliance.org/gmp-news/warning-letter-due-to-inadequate-pressure-stage-concept-and-particle-monitoring

編集履歴
```
2020/12/27 Mr. Harikiri
```
2020年12月27日

カテゴリー: BIOLOGICS

イオン交換の原理を使ったクロマトグラフィ

実務では

原理

なぜpHを上げていくと電荷がマイナスチャージになるのか

pHの理解

編集履歴

RIASと丸紅ケミックス

顧客

受託サービス

編集履歴

IDファーマ

アイロムグループの概要

編集履歴

はじめに

イオン交換体

イオン交換クロマトグラフィ

バッチ法

条件の基本は、電気伝導度とpH

検討の概要

実験方法

レジンの準備

出発材料の準備

吸着反応とアッセイ

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セルスタック

多品種には

はじめに

スキーム

pharmacovigilance; 安全性情報管理

編集履歴

はじめに

ウイルスベクターの新たな作り方

人工染色体の特徴

人工染色体の構造

遺伝子搭載サイズ

従来ベタクーとの比較

chromocenter社の方法

ドナー細胞の作成

1. 挿入型遺伝子搭載法

2. 転座型遺伝子搭載法

MMCT法(微小核細胞融合法)

編集履歴

はじめに

ウイルスベクター

非ウイルス・ベクター

ベクターの特徴まとめ

参考文献

編集履歴

RIASと丸紅ケミックス

GMPを知るには

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