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タグ: PCR

  • COVID-19関連 — PCR全自動検査装置: エリートインジーニアス – フランスから感謝状が送られたとい素晴らしい装置 – Precision System Science社、は日本の企業です.でも、装置だけでは測定はできない [2020/11/21]

    COVID-19関連 — PCR全自動検査装置: エリートインジーニアス – フランスから感謝状が送られたとい素晴らしい装置 – Precision System Science社、は日本の企業です.でも、装置だけでは測定はできない [2020/11/21]

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    エリートインジーニアス

    エリートインジーニアスは、プレシッション システム サイエンス社(Precision System Science; PSS)が開発するPCRの自動検査装置です。機能、オプションの違いにより数種類のラインナップがあります。
    海外、特に欧州での当局による審査がスムーズであるため、日本の企業が開発する医療機器の承認申請は、欧州で行うことが殆どであるとのです。

    そういった中、欧州で販売することが承認されたPSS社のPCR自動測定装置がフランスでCOVID-19のPCR検査で活躍しています。

    サンプル中のウイルスからの遺伝子の抽出などの作業が自働に行うため、専門の技師が必要ではないため、熟練技士の調達という律速がありません。

    取得したサンプルは、加熱処理して滅菌した後、装置にセットするだけで、2時間後には結果が出力されます。

    プレジッション システム サイエンス社、PCR自動測定装置

    http://www.pss.co.jp/product/genelead/lead12plus.html

    でも、装置だけでは測定できない

    測定装置だけでは、PCR測定はできません。装置は、反応を行う条件を自動に設定しますが、その反応そのものは、測定したいサンプルの他に、反応試薬(PCRキット)が必要になります。PCRキットには、核酸抽出試薬、転写酵素、プライマーおよび増幅酵素が含まれます。これらのキットは、高価であるため、機械によって効率的に測定をこなせたとしても、PCRキットの価格が低下してこないと、測定にかかるコストは低くすることは難しいのです。

    PCRキットは、日本製ではありません。日本は、決して世界の技術の中心にはいないのです。

    編集履歴
2020/07/30 はりきり(Mr)
2020/11/21 追記　(装置だけでは測定できない)
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  • [Bio-Edu] 進化するPCR – droplet digital PCRまで – 原理を解説する [2020/07/16]

    [Bio-Edu] 進化するPCR – droplet digital PCRまで – 原理を解説する [2020/07/16]

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    PCR

    Polymerase chained reaction

    デジタルPCRとは。そして更に、ドロップレットPCRの原理は、シンプルで美しい。

    • ~20,000ウェルの微細なナノウェルにDNA分子をランダムに分配する。ナノウェルとは、water in oilの事です。これを考案したの凄いのです。
    • 0個のウェルが存在するようにする(限界希釈)ことで、ポアソン分布を成り立たせ、その統計手法により分子数を定量する
    • エンドポイントPCRにより、分子が0個(ネガティブ)となる数に基づいて、サンプル中のDNA分子数をポアソン統計手法により計算する

    各PCRの説明

    原理説明
    PCRDenature → Annealing → Extension
    Denature : 100℃近い温度で、ダブルストランドのDNAを1本に解く
    Annealing : 50℃~60℃で、Primerを相補結合させる
    Extension : 70℃程度で、耐熱性のDNA polymerase (Tag Polymerase)で伸長反応
    Endo point method、エンドポイント増幅量を標準と比較してして判定、装置が単純(サーマルサイクラー)
    Real time PCRリアルタイム測定(増幅の傾き; 指数増殖フェーズのデータを利用)、蛍光シグナル使用
    統計手法により絶対量を予測、広いダイナミックレンジ、1.5~2倍の濃度差識別
    Digital PCR微細な多数のウェルに分子が0個のものもあように分配(ナノ流体工学に基づくチップ; 数千~数万の反応ウェル)してエンドポイントPCR。ネガティブ・ウェル(必ず必要)の割合と複数分子のウェルからポアソン統計(分子が0,1,2あるいは3個入る場合の確率)、により、絶定数を定量可能。標準曲線不要、PCR反応阻害を受けにくい
    Droplet Digital PCRナノ流体工学に基づくチップを、もっとシンプルな考え方で解決しています。チップでナノのスペースを作るのではなく、water in oilによる微細なエマルジョンの1つ1つを反応ウェルと見なせます。50μLの反応液に数万の反応ウェルが存在することになります。このままPCR反応を行います。エンドポイントの産物は、ドロップレットという粒子として、フローサイトメトリーの原理で一つ一つ数万の粒子ごとに蛍光強度を測定する。
    ThermoFisher と　BIO-RADのサイトから

    Digital PCR

    digital PCR, ThermoFisher

    次世代の定量技術！デジタルPCRの原理とは？ – ThermoFisher –

    https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/digitalpcr1/

    QX200 Droplet Digital PCR システム – BIO-RAD –

    https://www.bio-rad.com/ja-jp/product/qx200-droplet-digital-pcr-system?ID=MPOQQE4VY
    編集情報
2020/07/16 Harikiri(Mr)
  • 満を持して新世代PCR装置発売、コロナウイルスを15分で測定 – ジーンソック (GeneSoC) – キョーリン製薬 (PCR原理を含めたまとめ) – △ID10926

    満を持して新世代PCR装置発売、コロナウイルスを15分で測定 – ジーンソック (GeneSoC) – キョーリン製薬 (PCR原理を含めたまとめ) – △ID10926

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    GeneSoC

    GeneSoc

    遺伝子検査定量装置 GeneSocは、キョーリン製薬が販売する。

    • 原理はリアルタイムPCR法による目的遺伝子の増幅
    • マイクロ流路型サーマルサイクルによる増幅反応サイクルの短時間化に成功
    • 測定時間は、最短5分(~15分)
    • 3波調の蛍光で検出
    • 右側にある4代の検出ユニット構成により最大4検体同時測定

    PCRの手順

    • 検体の前処理
      • 血液からウイルスのDNAを抽出。ウイルスがRNAウイルスの場合RNAを抽出 (手作業)
      • RNAの場合、逆転写酵素というもので、DNAに変換
      • DNA増幅用の酵素(耐熱性)を添加して測定用サンプルとする
    • DNAの増幅(ジーンソック、その他RPC装置)
      • 2重螺旋となっているDNAを1本ずつに解く反応 (denature: 95℃)
      • 目的ウイルスの配列に相補する配列断片(primer)をウイルスDNAに結合させる反応 (annealing: 60℃)
      • primerを足がかりにウイルスDNAの複製化する反応(extension: 75℃)
      • denatureに戻る
      • 以上のサイクルを数十回と重ねてDNAを複製する
    • 最大限増幅されたDNAを定量する

    リアルタイムPCRの原理

    改良されたリアルタイムPCRは、最終産物としてDNAを定量するのではなく、DNA増幅の1つ1つの過程でリアルタイムに増幅されたDNA量を測定するものである。

    人工的にDNAを合成するために添加している原料に蛍光標識してあり、DNA合成に使用された際に蛍光を発するように設計されている。

    最終産物としてのDNAの測定工程が必要でない分、判定結果までの時間が短縮化される。加えて、増幅率としてその傾きがある程度安定した時点で、早期の予測値も可能である。

    今回のGeneSocでは、PCR反応そのものを短時間化した装置となっている。装置が達成する高速化の理由を考察する。

    高速化できた理由

    PCR反応は、denature (例えば95℃), anneal (例えば60℃)及びextension (75℃)にの3つの反応工程で構成されている。すなわち、単純に温度と維持時間の設定をシーケンシャルに変換させていくのみである。

    GeneSocでのマイクロ流路型サーマルサイクルとは、何か。

    因みに、「サーマルサイクル」とは、上記の温度で言えば、95℃→60℃→75℃を1サイクル又は複数サイクルを意味する。

    おそらく、従来より小さな反応空間として少ない反応液量で済む「マイクロ流路」というものを開発したと考えられる。瞬時の温度調節が可能になり、反応温度設定にかかる時間の短縮化も可能となる。

    具体的に検証してみる。

    サーマルサイクルとして一般的な回数30サイクル、GeneSocが謳う15分で測定が完了すると過程する。

    1サイクルは、0.5分となる。各温度調節工程であるdenature, annealing及び extensionに10秒ずつかかる計算となる。

    測定時間が5分のケースでは、1/3の時間になるので、各温度調節工程にかかる時間は3秒ずつとなる。

    参考文献

    PCRを始めませんか、長崎大学医学部附属動物実験施設、大沢一貴さん

    http://www.med.nagasaki-u.ac.jp/lac/PCR.html