![[用語] パーキンソン病](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2021/02/80F3D755-3019-49C6-BDAE-47D137C87826.jpeg)
世界のSLE患者数は、500万人と言われている。中脳にある黒質のドパミン神経細胞が変性し神経伝達物質ドパミンの産生が減少することが原因です。
Viceroy社の記事より
2017/8当時の記事です。競合となるアッピィ社のポンプ製剤既存薬との比較、ニューロダーム社の技術、適応症患者数の見積もり、など総合的に評価しています。Viceroy社の結論は、ニューロダーム社の評価はゼロドルであり、この買収案件は、顛末予想とて全額減損となると評価していた。
https://viceroyresearch.org/2017/08/30/田辺三菱製薬は大きな間違いを犯している：-ニュ/
指定難病6
https://www.nanbyou.or.jp/entry/169
編集履歴 2020/11/05 Mr.Harikir
![[Bio-Edu] ウイルスの等電点(pI) – 組換えAAVでは，empty/fullの違いでpIは異なる – 分離精製は工業化の課題である[2021/02/23]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/11/9AF42F79-4BAD-470D-B857-78DB7B3E9802.jpeg)
遺伝子治療用のウイルス・ベクターとしてAAVを使用した場合、目的通りに目的の遺伝子をAAVの殻にパッケージングできるとは限りません。導入する遺伝子の大きさが大きい程、その導入効率は低下してくると考えられます。実際に、動物細胞または昆虫細胞に対して、遺伝子導入試薬を使って目的の遺伝子を導入させ(トランスフェクション)、AAVベクターを作る時、目的遺伝が含まれないAAVも多数産生されます。
AAVはヒトにとって病原性が無く最もよく使われるウイルス・ベクターですが、ウイルスの殻は別です．殻を構成するたんぱく質などの抗原性が問題になるため、極力、目的遺伝子を含まないAAVベクター(Empty)については精製で除去すべきです。
目的遺伝子を含むAAVベクター(Full)との分離には、AAVベクターとしての等電点(pI)の違いを利用することが多く、陰イオン交換体を使用したカラムクロマトグラフィが使用できます。
なぜ、FullとEmptyとで、電荷が異なるかについては明確にはわかっていませんが、遺伝子であるDNAのパッケージの有無に関わることから、DNAのマイナス電荷の有無に関わるものと考えられます。完全にパッケージされているなら、その電荷がウイルスの殻の外に影響するとは考えにくいのですが、完全に否定することはできません。パッケージされることでウイルスの殻を構成していカプシドタンパク質のアミノ酸レベルで、プラスチャージのアミノ酸が殻の内側に向くこともあり得ます。その結果、殻の表面の電荷が変化することもあるでしょう。
また、完全にハッケージされる場合と全くされないという二極化をイメージしてはいけません。物理現象は、連続的なので、そのような短絡的なイメージではなく、途中の状態も存在することも考えてみましょう。例えば、殻が、完全な閉鎖形になっていなくて、例えば、映画「スターウォーズ」の「デススター」のように、表面が欠けている場合です。その欠け方も範囲の小さいものから大きいものまであると考えるべきです。そうすると、一部の遺伝子DNAが殻の隙間から飛び出ているAAV粒子もあることは想像できます
以上、多様な粒子としてAAVベクターが産生されており、その中からFullのみを分離精製することが、医薬品を作り上げていく上で、downstream; 精製工程における工業化の課題となる訳です。一方、upstream; 生産工程における工業化の課題は、パッケージング効率と産生量が工業化の課題となります。
以下，文献によるとウイルスの表面電荷は，およそ酸性から中性域にあります(2.1~8.3)．平均値は，5.0±1.3です．ウイルス精製では，陰イオン交換体クロマトグラフィ(AEX)による吸着/溶出で可能です．等電点とは，環境pHに応じて電気的に中性となるpHを等電点(pI or IEP: isoelectric point)と言います．今回紹介する文献では，公開されているウイルスのIEPを再度検証しています．1938年以降に行われた104のウィルスのIEPのデータがまとめられています．
環境のpHに応じて，カルボキシル基とアミノ基の電荷が変化する．
| Host kingdom | Virus species | Strain | IEP(s) | Method | Purity | Reference |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Animalia | Adeno‐associated virus – 4 | Adeno‐associated virus – 4 | 2·6 | IEF‐DA | High | Salo and Mayor (1978) |
| Animalia | Alastrim | Butler | 3·4 | EM‐LM | High | Douglas et al. (1969) |
| Animalia | Cowpox | Brighton | 4·3 | EM‐LM | High | Douglas et al. (1969) |
| Animalia | Cowpox | Brighton (egg) | 4·3 | EM‐LM | High | Douglas et al. (1966) |
| Animalia | Cowpox | Brighton (rabit) | 4·3 | EM‐LM | High | Douglas et al. (1966) |
| Animalia | Cowpox | Kampen | 5·4 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Cowpox | Leuwarden | 5·2 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Encephalomyocarditis virus | Mengovirus L | 8·1 and 4·6 | IEF‐PA | High | Chlumecka et al. (1973) |
| Animalia | Encephalomyocarditis virus | Mengovirus M | 4·4 and 6·3 | IEF‐PA | High | Chlumecka et al. (1973) |
| Animalia | Encephalomyocarditis virus | Mengovirus M | 8·4 and 4·6 | IEF‐PA | High | Chlumecka et al. (1977) |
| Animalia | Encephalomyocarditis virus | Mengovirus S | 4·6 and 6·8 | IEF‐PA | High | Chlumecka et al. (1973) |
| Animalia | Feline panleukopenia virus | Canine parvovirus | 5·0 | IEF‐A | ? | Weichert et al. (1998) |
| Animalia | Hepatitis A virus | Hepatitis A virus | 2·8 | IEF‐DA | ? | Nasser et al. (1992) |
| Animalia | Human adenovirus C | Human adenovirus 5 | 4·5 | EM‐LS | ? | Trilisky and Lenhoff (2007) |
| Animalia | Human enterovirus B | Human coxsackievirus B 5 | 4·75 and 6·75 | IEF‐DA | Low | Butler et al. 1985 |
| Animalia | Human enterovirus B | Human echovirus 1 | 5·6 and 5·1 | IEF | ? | Murray and Parks 1980 |
| Animalia | Human enterovirus B | Human echovirus 1 | 4·0 | IEF‐DA | Low | Butler et al. (1985) |
| Animalia | Human enterovirus B | Human echovirus 1 (4CH‐1) | 5·5 | IEF‐A | ? | Zerda and Gerba (1984) |
| Animalia | Human enterovirus B | Human echovirus 1 (R115) | 6·2 | IEF‐A | ? | Zerda and Gerba (1984) |
| Animalia | Human enterovirus B | Human echovirus 1 (V212) | 6·4 | IEF‐A | ? | Zerda and Gerba (1984) |
| Animalia | Human enterovirus B | Human echovirus 1 (V239) | 5·3 | IEF‐A | ? | Zerda and Gerba (1984) |
| Animalia | Human enterovirus B | Human echovirus 1 (V248) | 5·0 | IEF‐A | ? | Zerda and Gerba (1984) |
| Animalia | Human enterovirus C | Human coxsackievirus A 21 | 6·1 and 4·8 | IEF | ? | Murray and Parks (1980) |
| Animalia | Human rhinovirus A | Human rhinovirus 2 | 6·8 | CIEF | Low | Schnabel et al. (1996) |
| Animalia | Human rhinovirus A | Human rhinovirus 2 | 6·4 | IEF‐DA | Low | Korant et al. (1975) |
| Animalia | Influenza A virus | H1N1 (Leningrad) | 4·5, 4·35, 4·25, 4·0* | EM‐LM | High | Molodkina et al. (1986) |
| Animalia | Influenza A virus | H3N1 | 6·5–6·8 | IEF‐PA | Low | Brydak (1993) |
| Animalia | Influenza A virus | H3N2 (Leningrad) | 5·0 | EM‐LM | High | Molodkina et al. (1986) |
| Animalia | Influenza A virus | PR8 | 5·3 | EM‐LM | Low | Miller et al. (1944) |
| Animalia | Influenza A virus | Influenza A virus | 6·5–7·0 | EDN‐FET | ? | Patolsky et al. (2004) |
| Animalia | Mammalian orthoreovirus | Serotype 3 (Dearing) | 3·8 | EM‐LM | Low | Taylor and Bosmann (1981b) |
| Animalia | Mammalian orthoreovirus | Serotype 3 (Dearing) | 3·9 | IEF‐DA | Low | Floyd and Sharp (1978) |
| Animalia | Monkeypox | Chimpanzee Paris | 6·2 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Monkeypox | Copenhague | 6·5 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Monkeypox | Denmark | 3·4 | EM‐LM | High | Douglas et al. (1969) |
| Animalia | Neuro‐Vaccinia | Levaditi | 4·2 | EM‐LM | High | Douglas et al. 1969 |
| Animalia | Norwalk virus | Funabashi | 5·9 | CIEF | ? | Goodridge et al. (2004) |
| Animalia | Norwalk virus | Hawaii virus | 6·0 | CIEF | ? | Goodridge et al. (2004) |
| Animalia | Norwalk virus | Kashiwa | 5·5 | CIEF | ? | Goodridge et al. (2004) |
| Animalia | Norwalk virus | Narita | 5·5 | CIEF | ? | Goodridge et al. (2004) |
| Animalia | Norwalk virus | Norwalk virus | 5·9 | CIEF | ? | Goodridge et al. (2004) |
| Animalia | Norwalk virus | Seto | 6·0 | CIEF | ? | Goodridge et al. (2004) |
| Animalia | Papillomavirus | Papillomavirus | 5·0 | Aggregation | High | Beard and Wyckoff (1938) |
| Animalia | Poliovirus | PV‐1 | 7·4 and 4·0 | IEF‐DA | ? | Nasser et al. (1992) |
| Animalia | Poliovirus | PV‐1 | 6·9 | IEF | ? | Brioen et al. (1985) |
| Animalia | Poliovirus | PV‐1 Brunender | 7·4 and 3·8 | IEF‐DA | ? | La Colla et al. (1972) |
| Animalia | Poliovirus | PV‐1 Brunhilde | 7·1 | IEF‐A | ? | Zerda and Gerba (1984) |
| Animalia | Poliovirus | PV‐1 Brunhilde | 7·1 and 4·5 | IEF‐DA | High | Mandel (1971) |
| Animalia | Poliovirus | PV‐1 Chat | 7·5 and 4·5 | IEF‐PA | ? | Ward (1978) |
| Animalia | Poliovirus | PV‐1 LSc2ab | 6·6 | IEF‐A | ? | Zerda and Gerba (1984) |
| Animalia | Poliovirus | PV‐1 LSc2ab | 6·6 | ? | ? | Murray and Parks (1980) |
| Animalia | Poliovirus | PV‐1 LSc2ab | 6·75 and 4·1 | IEF‐DA | Low | Butler et al. (1985) |
| Animalia | Poliovirus | PV‐1 LSc2ab | 6·75 and 4·5 | IEF‐DA | Low | Butler et al. (1985) |
| Animalia | Poliovirus | PV‐1 Mahoney | 8·3 | IEF‐DA | Low | Floyd and Sharp (1978) |
| Animalia | Poliovirus | PV‐2 Sabin T2 | 6·5 and 4·5 | IEF | ? | Murray and Parks (1980) |
| Animalia | Rotavirus A | Simian rotavirus A/SA11 | 8·0 | IEF‐DA | Low | Butler et al. (1985) |
| Animalia | Smallpox | Butler | 5·7 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Smallpox | Djibouti | 5·6 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Smallpox | Harvey | 5·9 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Smallpox | Harvey | 3·4 | EM‐LM | High | Douglas et al. (1969) |
| Animalia | Smallpox | Moloya | 5·6 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Smallpox | Sidi Amock | 5·9 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Smallpox | Teheran | 5·6 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Smallpox | Vannes | 5·6 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Vaccinia | Chaumier | 5·0 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Vaccinia | Connaught | 4·9 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Vaccinia | Lister | 5·1 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Vaccinia | Lister | 3·9 | EM‐LM | High | Douglas et al. (1969) |
| Animalia | Vaccinia | Lister (egg) | 3·7 | EM‐LM | High | Douglas et al. (1966) |
| Animalia | Vaccinia | Lister (rabit) | 3·0 | EM‐LM | High | Douglas et al. (1966) |
| Animalia | Vaccinia | Rabbitpox (Utrecht) | 2·3 | EM‐LM | High | Douglas et al. (1969) |
| Animalia | Vaccinia | WR | 4·8 | EM‐LM | Low | Taylor and Bosmann (1981b) |
| Animalia | White cowpox | Brighton | 2·8 | EM‐LM | High | Douglas et al. (1969) |
| Animalia | Whitepocks | 64.72.55 | 5·1 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Whitepocks | 64.72.75 | 4·9 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Whitepocks | Chimp 9 | 4·8 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Whitepocks | MK7.73 | 5·3 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Whitepocks | RZ.10.71 | 5·1 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Animalia | Whitepocks | RZ.38.75 | 5·2 | IEF‐DA | Low | Mouillot and Netter (1977) |
| Bacteria | Acholeplasma phage O1 | Acholeplasma phage O1 | 4·0 | ? | ? | Pawlitschek et al. (1962) |
| Bacteria | Actinomycetes phage MSP8 | Actinomycetes phage MSP8 | 3·5 | IEF‐A | High | Kolstad and Bradley (1966) |
| Bacteria | Bacillus phage φ29 | Bacillus phage φ29 | 4·2 | Moving boundary | Low | Rubio et al. (1974) |
| Bacteria | Enterobacteria phage BZ13 | Enterobacteria phage GA | 2·1, 2·3* | EM‐LS | High | Langlet et al. (2008b) |
| Bacteria | Enterobacteria phage F1 | Enterobacteria phage SP | 2·1, 2·6* | EM‐LS | High | Langlet et al. (2008b) |
| Bacteria | Enterobacteria phage MS2 | Enterobacteria phage f2 | 4·0 | IEF‐DA | Low | Butler et al. (1985) |
| Bacteria | Enterobacteria phage MS2 | Enterobacteria phage MS2 | 3·9 | IEF‐A | ? | Zerda and Gerba (1984) |
| Bacteria | Enterobacteria phage MS2 | Enterobacteria phage MS2 | 3·5 | EM‐LS | High | Penrod et al. (1995) |
| Bacteria | Enterobacteria phage MS2 | Enterobacteria phage MS2 | 3·1, 3·9* | EM‐LS | High | Langlet et al. (2008b) |
| Bacteria | Enterobacteria phage MS2 | Enterobacteria phage MS2 | 3·9 | Moving boundary | High | Overby et al. (1966) |
| Bacteria | Enterobacteria phage MS2 | Enterobacteria phage MS2 | 3·9 | IEF‐DA | ? | Nasser et al. (1992) |
| Bacteria | Enterobacteria phage MS2 | Enterobacteria phage MS2 | 2·2, 3·3, 3·5* | EM‐LS | Low | Yuan et al. (2008) |
| Bacteria | Enterobacteria phage PRD1 | Enterobacteria phage PR722 | 3·8–4·2 | Chromatofocusing | Low | Brorson et al. (2008) |
| Bacteria | Enterobacteria phage Qβ | Enterobacteria phage Qβ | 2·7, 1·9* | EM‐LS | High | Langlet et al. (2008b) |
| Bacteria | Enterobacteria phage Qβ | Enterobacteria phage Qβ | 5·3 | Moving boundary | High | Overby et al. (1966) |
| Bacteria | Enterobacteria phage T4 | Enterobacteria phage T2 | 4·2 | Aggregation | ? | Sharp et al. (1946) |
| Bacteria | Enterobacteria phage T4 | Enterobacteria phage T4 | 2·0 | EM‐LS | ? | Aronino et al. (2009) |
| Bacteria | Enterobacteria phage T4 | Enterobacteria phage T4 | 4·0–5·0 | IEF‐PA | Low | Childs and Birnboim (1975) |
| Bacteria | Enterobacteria phage λ | CI47 | 3·8 | EM‐LS | High | Penrod et al. (1995) |
| Bacteria | Enterobacteria phage μ2 | Enterobacteria phage μ2 | 4·0 | IEF‐PA | Low | Piffaretti and Pitton (1976) |
| Bacteria | Enterobacteria phage ϕX174 | Enterobacteria phage S13 | 7·0 | ? | High | Aach (1963) |
| Bacteria | Enterobacteria phage ϕX174 | Mutants | 7·4 | ? | High | Aach (1963) |
| Bacteria | Enterobacteria phage ϕX174 | Wild type | 6·6 | ? | High | Aach (1963) |
| Bacteria | Enterobacteria phage ϕX174 | Enterobacteria phage ϕX174 | 6·0–7·0 | Chromatofocusing | Low | Brorson et al. (2008) |
| Bacteria | Enterobacteria phage ϕX174 | Enterobacteria phage ϕX174 | 2·6 | EM‐LS | ? | Aronino et al. (2009) |
| Bacteria | Enterobacteria phage ϕX174 | Enterobacteria phage ϕX174 | 6·6 | CIEF | Low | Horkáet al. (2007) |
| Bacteria | Enterobacteria phage ϕX174 | Enterobacteria phage ϕX174 | 6·6 | Aggregation | High | Sinsheimer (1959) |
| Bacteria | PM 2 | PM 2 | 7·3 | IEF | ? | Schaefer et al. (1974) |
| Bacteria | Pseudomonas phage PP7 | Pseudomonas phage PP7 | 4·3–4·9 | Chromatofocusing | Low | Brorson et al. (2008) |
| Plantae | Belladonna mottle virus | Belladonna mottle virus | 6·3 | IEF‐A | Low | Petrzik (1993) |
| Plantae | Cowpea chlorotic mottle virus | Cowpea chlorotic mottle virus | 3·8 | EM‐LS | High | Suci et al. (2005) |
| Plantae | Erysimum latent virus | Erysimum latent virus | 4·7 | IEF‐A | Low | Petrzik (1993) |
| Plantae | Red clover necrotic mosaic virus | Serotype A | 5·0 | IEF‐A | Low | Gallo and Musil (1984) |
| Plantae | Red clover necrotic mosaic virus | Serotype B | 4·8 | IEF‐A | Low | Gallo and Musil (1984) |
| Plantae | Red clover necrotic mosaic virus | Serotype C | 4·6 | IEF‐A | Low | Gallo and Musil (1984) |
| Plantae | Scrophularia mottle virus | Anagyris | 4·4 | IEF‐A | Low | Honetslegrova et al. (1994) |
| Plantae | Scrophularia mottle virus | Czech isolate | 3·9 | IEF‐A | Low | Honetslegrova et al. (1994) |
| Plantae | Scrophularia mottle virus | Scrophularia mottle virus | 4·0 | IEF‐A | Low | Petrzik (1993) |
| Plantae | Southern bean mosaic virus | Variant 1 | 6·0 | IEF‐DA | High | Magdoff‐Fairchild (1967) |
| Plantae | Southern bean mosaic virus | Variant 2 | 5·6 | IEF‐DA | High | Magdoff‐Fairchild (1967) |
| Plantae | Southern bean mosaic virus | Variant 3 | 5·0 | IEF‐DA | High | Magdoff‐Fairchild (1967) |
| Plantae | Southern bean mosaic virus | Variant 4 | 4·0 | IEF‐DA | High | Magdoff‐Fairchild (1967) |
| Plantae | Tobacco mosaic virus | Cucumber virus 4 | 4·9 | Aggregation | Low | Oster (1951) |
| Plantae | Tobacco mosaic virus | Green aucuba | 4·5 | Aggregation | Low | Oster (1951) |
| Plantae | Tobacco mosaic virus | Holmes’ masked | 3·9 | Aggregation | Low | Oster (1951) |
| Plantae | Tobacco mosaic virus | Holmes’ rip‐gras | 4·5 | Aggregation | Low | Oster (1951) |
| Plantae | Tobacco mosaic virus | J14D1 | 4·2 | Aggregation | Low | Oster (1951) |
| Plantae | Tobacco mosaic virus | Ordinary | 3·9 | Aggregation | Low | Oster (1951) |
| Plantae | Tobacco mosaic virus | Yellow aucuba | 4·6 | Aggregation | Low | Oster (1951) |
| Plantae | Turnip yellow mosaic virus | Turnip yellow mosaic virus | 3·6 | IEF‐A | Low | Petrzik (1993) |
Isoelectric points of viruses – B. MichenT. GrauleFirst published: 09 July 2010 https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2010.04663.xCitations: 63 –
https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1365-2672.2010.04663.x
以下の文献には，表面構成タンパク質について個別にpIを算出されていますが，ウイルス粒子を構成する天然の状態でのpIは，表面に出ているアミノ酸の分布割合に依存します。そのため、正確なpIが算出されているとは考えにくと考えられます．やはり，実際にAEXなどのクロマト法などで検定されている結果の方が信頼できると思われます．
しかし，組換えAAVでは，以下の「AAV8, AAV9のpI」で示したようにEmpty/Fullの違いでpIが異なることが知られています．すなわち，GOIの配列によってもpIは異なると考えられます．単純計算ではいかないようですね．
Calculated pI values for AAV1 to AAV12.
https://www.researchgate.net/figure/Calculated-pI-values-for-AAV1-to-AAV12-The-histogram-of-the-pI-values-for-the-AAV_fig1_235682725
AAV8とAAV9のpIを分析カラムメーカーSCIEX社が報告しています．
Determination of Full, Partial and Empty Capsid Ratios
for Adeno-Associated Virus (AAV) Analysis
Tingting Li, Tie Gao, Hongxu Chen, Zuzana Demianova, Fang Wang, Mukesh Malik, Jane Luo,
Handy Yowanto, Sahana Mollah
SCIEX, Brea, CA
https://sciex.com/Documents/tech%20notes/2019/AAV-Full-Partial-Empty.pdf
参考まで，AAV系統樹について示しておきます．pIの関連があるかも知れません．今後調査するかもです．
Expanded Repertoire of AAV Vector Serotypes Mediate Unique Patterns of Transduction in Mouse Brain
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616320755
2020/11/04 Mr.Harikiri 2021/02/08 文言整備 2021/02/23 追記 (「はじめに」を追加し、工業化の課題について言及)
![[アニメ] 氷菓 (2012) – 高校生の文化祭はこう楽しむべきだったのか – 今更に擬似体験して満足する [2020/11/04]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/11/896E1178-29A9-48DC-8A23-55DBEEBEF3E5.jpeg)
2012年、TV全22話、京都アニメーションの作品です。神山高校の文化祭を中心にして、エルが「興味があります」に逆らえない同級の男子高校生が謎を推理していく。中々面白く視聴できました。よく似たシチュエーション設定のアニメとして、「やはり俺の青春ラブコメはまちがっている。」があります。これも一度どうぞ。
編集履歴 2020/11/04 Mr. Harikiri
![[アニメ] ザ・サード〜蒼い目の少女〜 (2006) – ３つ目の眼を額にもつ「ザ・サード」が人類を管理している世界 [2020/10/20]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/10/1FB95525-9A17-482A-8715-9C070F226F58.jpeg)
2006年、TV全24話、人類が犯した過ちを2度と起こさせないために、3つ目の眼を額に持つ「ザ・サード」と呼ばれる存在から管理されている人類。ソードダンサーと呼ばれる少女がいました。この世界では、技術革新は許されず、高度な進歩は、人類には許されないのでした。でも、人工知能はソードダンサーのbuddyだったりします。
本編に出てくる砂漠を走る戦車が、かっちょ良いです。僕が幼少の頃、こんな頑丈な乗り物で、どこへでもいけて、中では寝泊まりや食事もできる、そんな乗り物中心の生活に漠然と憧れていたことを思い出します。後半では、この戦車は3Dグラフィックで描かれています。クラフトしたくなります。
編集履歴 2020/10/20 Mr. Harikiri
![[アニメ] 終わりのセラフ – 人対吸血鬼 – 大人の事情と子供の理想は相ゆずれない [2020/10/28]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/10/CB823037-BF82-4356-8881-89D60DAFA8E4.jpeg)
2015年、TV全24話、吸血鬼が世界を支配している世界と、一部の人の軍隊組織は、吸血鬼から人の世界を取り戻そうとしており、その攻防を背景に、家族というテーマを描いてます。しかし、大人の事情は、子供たちの家族の理想などには、お構いなしに推し進められていくのでした。
編集履歴 2020/10/28 Mr. Harikiri
![今日の英語 – we are excited to announce ~ – 報告できることを嬉しく思っている表現 [2020/10/28]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/11/F12C8F86-A0B0-4334-9DAD-E75022893870.jpeg)
![[アニメ] ヒロイック・エイジ – 宇宙戦闘も迫力、エイジの純粋な存在が物語を作っていく [2020/10/20]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/10/06F6F38C-502D-4345-892F-A97C75224C0B.jpeg)
2007年、TV全26話、宇宙物/宇宙戦艦物/宇宙や人類の発祥の不思議を描いています。3話くらいまでは我慢して視聴してください。おそらく、TVで毎週リアルタイムで観るには退屈な部分もあったのかも知れませんが、一気に観るには長編として楽しめます。長編物では、後半に従い盛り上がってきますが、この作品も類に漏れずです。純粋な1人の青年を中心に、世界は向かうべき未来に向かっていくのでした。
本編は、手描きのアニメーションですが、戦艦は、3Dグラフィックで描かれていて、なかなかカッチョよく仕上がっています。OPは昭和の歌謡曲風で好みです。EDもいい。
本編から拾い出したキーワードです。
Prime Videoでは視聴できませんが、dアニメストアで視聴できます(2020/12現在)。
編集履歴 2020/10/20 Mr. Harikiri
![[Bio-Edu] Plasmid DNA (pDNA)のデザイン及び、その製造方法に関する調査 [2020/12/24]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/10/15419700-C78D-4749-B076-A287382D4681.jpeg)
2本鎖DNAを輪っか状にデザインした物をPlasmid DNA (pDNA)と言います。完全なpDNAでは、輪ゴムをよじった状態(super coil)となり輪っか状ではなくなります。そのことで、見かけ上の分子量は小さくなります。もしも、2本の内1本に切断箇所(ニック)が存在すると、super coilではなくなり、輪っか状になります。さらに、もう一方の鎖に切断箇所があると、輪っか状も崩れて、直鎖のDNAの形態になります。完全体であるsuper coilのpDNAは、以上の状態の変化による性質の違いを利用して精製されます。
既存のベクターをデザインするには、既存の知られた遺伝子部品を組み合わせることが基本です。リンクした以下のサイトは、標準のプラスミド・ベクターや、AAVベクター、レンチウイルス・ベクターなど、数十種類のベクターをバックボーンにして、好みのベクターをデザインすることができます。
ベクター・ビルダー
https://www.vectorbuilder.jp/design.html
plasmid DNA (pDNA)の製造で最もクリティカルな工程は、その抽出です。pDNAを生産する細胞にE.coliを用いた場合、E.coliのgenomeと目的のpDNAを効率よく分離抽出することが重要です。pDNAは、スーパーコイル(輪ゴムが更によじれている物をイメージするとわかりやすい)となっており、E.coliのgenomeとは物理的強度が異なることを利用して、アルカリ抽出やガラスピーズのミル抽出が一般的に行われます。
ベーリンガー社が、CDMOとしてpDNAの効率的な製造方法を考案している。参考文献 3)、その主たる内容は、1~200L規模のcGMPに適用できるpDNAの製造において、高い効率で抽出できるアルカリ抽出およびビーズを用いた方法である。
参考文献 1)より。大腸菌を使って生産させるのが一般的です。工業的には生産性が高いためです。
| Item | pVGXI1, pVGXI2 |
| Size | 4.2kb, 4.6kb |
| bad case | OD < 15, 0.6g plasmid/10L fermentor |
| optimization | OD >40, 2.4 g ~ 3.0 g plasmid/10L fermentor |
| 考慮事項 | pVGXI2は、高いpoly A, 低いGC比率 |
その他の精製方法として、以下のフローも参考の一つとして示します。特記する点は、ろ過助剤により細胞を効率的に回収している点である。
1) Large Scale Production and Scale Up of DNA Plasmid Vectors With Complex Gene Inserts (2014)
プラスミドベクターを大腸菌で大規模に生産するために、(1)細胞株の最適化と (2)配列の最適化を実施した。
プラスミドpVGXI1（4.2kb）は、最初は10L発酵スケールで増殖は不良（OD <15、プラスミド収量：0.6g / 10L）であった。 細胞株の最適化により改善することができたOD> 40、プラスミド収量2.4g / 10L）。 このプロセスは、100Lおよび400Lスケールまで効果的にスケールアップ可能であった。
プラスミド、pVGXI2（4.6kb）は、その配列の高いA残基の繰り返しと低いGC％で構成されていたが、 3つの異なる大腸菌細胞株で10Lスケールで検討した結果、各細胞株では、増殖は不良(OD <10）であり、プラスミドがほとんど生成されなかった（プラスミド収量：0.7g / 10L）。
配列の最適化を行うことにより、pVGXI2は、標準的な大腸菌株で高い増殖性（OD> 50）およびプラスミド収量（3g / 10L）を10Lスケールで確認できた。
さらに、プロセス最適化により、これらの2つのプラスミドは、発酵収率が4倍に改善し、スケールアップも達成できた。さらに、これらのプラスミドの精製により、臨床使用に適した高品質のDNA産物を得ることができた。
https://www.cell.com/molecular-therapy-family/molecular-therapy/fulltext/S1525-0016(16)35244-3
2) 医薬品グレードの大規模プラスミドDNA製造プロセス(2015)
プラスミドDNAの製薬用途には、直接的または間接的に、特定の品質基準が必要です。ヒトの「適正製造基準」（GMP）グレードへの直接遺伝子導入は必須ですが、ウイルスベクター（AAVなど）などのGMP生産では、使用するプラスミドDNAを必ずしもGMPで生産する必要はないとの記載があります。このような規制の側面に加えて、研究室規模（最大数ミリグラム）から工業規模（ミリグラムからグラム規模）へのプラスミドDNA生産プロセスの拡大がここで扱われる問題です。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24715291/
3) プラスミドDNAの工業生産 (2008)
ベーリンガーの新しいcGMP生産システムに関する。pDNAの抽出方法は、アルカリ抽出法とビーズミル抽出法の併用であると理解しました。本当のところ、詳細については不明なのでわかりません。
プラスミドDNAを製造する場合、適正製造基準は慎重なベクター設計から始まります（図1）。真核生物のプロモーター、遺伝子配列、およびポリA部位は主に治療効果に影響を与えますが、ベクターの残りの部分は製造にとって重要です。
ベクターバックボーンのすべての要素、機能、および特性は、プロセスの堅牢性と製品の品質に関して評価する必要があります。
ベーリンガーインゲルハイムオーストリアは、天然のColE1 / pUCoriに基づいた抗生物質を含まないプラスミド選択のためのホストベクターシステムを開発しました。
生産性は、2.4g/L
supercoiled plasmidについての記載あり。培養終了時には、90% supercoiled plasmidであるpDNA均一性を目標とする。
https://www.genengnews.com/magazine/86/industrial-manufacturing-of-plasmid-dna/
4) Efficient Disruption of Escherichia coli for Plasmid DNA Recovery in a Bead Mill (2017)
概要 – 要約：ビーズミルによるpDNAの抽出に関する研究。総pDNA（pDNA（t））およびスーパーコイル状pDNA（pDNA（sc））について、抽出に関するモデルを開発を目的に、ミル頻度、セル濃度、およびビーズサイズの2つのレベル23要因を検討。
その結果は、応答曲面法によって分析した。
pDNA（t）の最適化抽出条件として、13.26 mg / g dcw（93.41％の回収率）、30 Hzのミル周波数、0.10〜0.25 mmのビーズサイズ、および20 g wcw / Lのセル濃度を決定。
pDNA（sc）の最適化抽出条件として、7.65 mg / g dcw（92.05％の回収率）、15 Hzのミル周波数、0.10〜0.25 mmのビーズサイズ、10 g wcw / Lのセル濃度を決定。
考察 – ビーズミルでの細胞破壊は、アルカリ処理と比較して、pDNA（t）およびpDNA（sc）の放出に効率的であることが証明された。
https://res.mdpi.com/d_attachment/applsci/applsci-08-00030/article_deploy/applsci-08-00030.pdf
5) Hot-Alkaline DNA Extraction Method for Deep-Subseafloor Archaeal Communities (2014)
アルカリ処理と加熱を使用した新しいDNA抽出方法をの検討。 1 M NaOHで98°Cで20分間処理すると、さまざまな深さで収集された海底下の堆積物サンプル中の微生物細胞の98％以上が破壊されました。 しかし、DNAの完全性試験では、このような強アルカリ性および熱処理により、DNA分子がPCRでは増幅できない短い断片に切断されることが示されました。
その後、アルカリ条件と温度条件を最適化して、DNAの断片化を最小限に抑え、高い細胞破壊効率を維持しました。 最良の条件は、さまざまな深さからの海底下の堆積物サンプルで50〜80％の細胞破壊率を生み出し、完全な16S rRNA遺伝子（すなわち、約1,500 bp）の増幅に十分なDNAの完全性を保持しました。 最適化された方法では、従来のキットベースのアプローチを使用した抽出と比較して、テストしたすべてのサンプルでより高いDNA濃度も得られました。 リアルタイムPCRと細菌および古細菌の16SrRNA遺伝子のパイロシーケンスを使用した比較分子分析は、新しい方法が古細菌DNAとその多様性の増加をもたらしたことを示し、従来の方法よりも海底下の微生物群集のより良い分析範囲を提供することを示唆しています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3957647/
6) A continuous process to extract plasmid DNA based o Alkaline Lysis (2007)
ここで紹介するプロトコルは、アルカリ溶解プロトコルに基づくスケーラブルな連続プロセスでプラスミドDNAを抽出します。このプロセスでは、採取した細菌を2つの混合チャンバーに制御された速度で通過させて、溶解を行い、アルカリ度を制御します。得られた溶液は、一連の フィルターで汚染物質を除去し、エタノールで沈殿させます。 このプロセスは、粗プラスミドを取得する前にすべての遠心分離ステップを置き換え、より多くの量の需要を満たすために簡単にスケールアップできます。 この手順を使用して、プラスミドを抽出し、50分から90分で、4リットルの大腸菌培養物から精製することができます。 プラスミドの収量は80〜90mg/L 培養です。
細胞の形質転換→細胞増殖→プラスミドの抽出と精製。最も一般的な抽出方法はアルカリ抽出。連続プロセスに適用するには、pDNAの大規模な調製のためのアルカリ溶解法のスケールアップです。 細胞破壊の代替方法は沸騰溶解です。 しかし、このアプローチでは、pDNA収量と純度に一貫性がなく、メソッドも複雑です。最近、熱溶解プロトコルに基づく連続プロセスの開発と最適化の成功を報告しましたが、溶解後も遠心分離ステップが必要でした。アルカリ溶解手順によるpDNAの大規模抽出は、特に次の理由により、問題があると認識されています。 プロセスで使用される3つの溶液、それぞれ0.4M NaOH/C2コンテナ、2% SDS/C3コンテナ、3 M potassium acetate, 5 M acetic acid, and pH 4.8/C4コントなに地蔵しておく。Bacteria懸濁液(100 OD/TE buffer)とC2+C3のミックス液を混和してアルカリ溶解させ、その後、C3の溶液と混和することで、不純タンパク質とGenomeを沈殿化させる。濾液を回収し、70%EtOHで沈殿化させて濾過膜で沈殿を回収する。
Flow rate : 3cm/sec
遠心分離ステップを排除するために、0.2 μmの中空糸カートリッジを使用して細胞を回収。1）細胞溶解後の破片を除去し、プラスミドがエタノールで沈殿した後のRNA汚染を除去するための70μmナイロンフィルター。中空糸カートリッジはさまざまなサイズで製造できるため、適切なカートリッジを選択して、必要な最終容量を回収できます。 発酵細菌。 溶液IIIと混合した後、溶解したバクテリアを孔径が徐々に小さくなる4層のナイロンフィルター（375、186、122、70 μm）に通して、このサイズ範囲の破片やその他の不純物を除去します. 70μmのナイロンフィルターは、エタノール沈殿後のプラスミドとRNAの分離に最も効果的。
スペルミジン圧縮18、CTAB沈殿19、20、ゲルろ過12、磁気ビーズ精製21などのさまざまな後続の下流精製プロトコルに容易に採用できます。 このプロセスは、従来のアルカリ溶解の問題を回避し、DNAワクチン接種、非ウイルスベクターベースの遺伝子治療、RNAi発現コンストラクトおよびその他の関連する臨床および研究アプリケーションのニーズを満たすプラスミドDNAの自動生成のためのプラットフォームを提供します。 この連続システムは操作が簡単ですが、システムのセットアップと最適化には、接続、チューブサイズ、同期ポンプの調整を含む最初のステップが必要です。 流速、混合セルのサイズ、および振とう頻度は、新しい実験条件に合わせて最適化する必要があります。 発酵プロセスとバクテリアの収穫は、収穫されたバクテリアのアルカリ溶解から始まる以下の手順では説明されていません。 発酵は参考文献に記載されているように実施する必要があります。 15、および細菌は、参考文献に記載されているように、このプロトコルで使用するために収穫する必要があります。 15、TEの代わりにソリューションIを使用
https://www.researchgate.net/publication/5576598_A_continuous_process_to_extract_plasmid_DNA_based_on_alkaline_lysis
7) いまさら聞けないプラスミド抽出法の原理 (2011) – 生物工学第89巻 –
アルカリ変性の進み具合は、分子量の大きな染色体と、plasmid DNA(pDNA, スーパーコイルになっているものは特に安定的)とでは異なる。アルカリ抽出の原理を知ることができる。
1. covalently closed circular : ccc (物理的に最も安定)
2. open circular : oc
3. liner : lブラスミドベクターによってコピー数が1桁も違う
https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/8909/8909_yomoyama_1.pdf
1. pUC, pBluescript, pGEM, pTZ, pBR322, pACYC, pSC101
8) US Patent for Plasmid DNA extraction process Patent – Justia Patents – プラスミドDNA抽出プロセス – FujifilmDiosynth Biotechnolgies UK Limited特許 (2010/07/29出願、US特許8889852)
フロースルー装置を用いて、95℃~120℃、10秒未満、5秒を超えて120℃超えないこと。pDNAは通常3kbp~4kbpの範囲。pH4~pH10,好ましくはpH7~9(0~100mM Tris-HCl)。カルシウムなどの細胞壁のカチオンを可溶化するEDATなどのキレート剤を含み得る。ボリオール(スクロースなど)によるpDNAの放出促進として、5%~10%を含み得る。界面活性剤X-100を1~10%を含み得る。カオトロープとして尿素を0.5~8M、好ましくは1~3M。細胞溶解剤リゾチームなどを必要としないが、必要に応じて使用し得る。
https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/8909/8909_yomoyama_1.pdf
9) What is DNA? – QIAGEN –
ウイルス、細菌のgenomeの長さ(bp)と分子量。
pDNAのAEX、Silica-membraneおよびマグネットSilicaによる精製。
https://www.qiagen.com/jp/service-and-support/learning-hub/molecular-biology-methods/dna/
10) Plasmid vs. Genomic DNA Extraction: The Difference (2014)
ゲノムDNA抽出 (gDNA)は、最大限の抽出方法で行います。まず、酵母、植物、細菌の場合、溶解には、原形質膜を機械的に破壊する前に、強くて硬い細胞壁を酵素的に破壊することが含まれます。細胞壁は通常、細胞壁ペプチドグリカンを加水分解するリゾチームとセリンプロテアーゼプロテイナーゼKで消化されます。特定のグラム陽性種の場合、リゾスタフィンは酵素消化をさらに促進します。細胞壁の組成が異なる外来種には、異なる酵素を使用する必要がある場合があります。
その後、機械的な細胞壁破壊は、gDNA抽出のためのより普遍的な溶解方法として、ビーズビートがあります。0.1mmのガラスビーズまたは0.15mmの細かいガーネットビーズを使用して、ミル装置で行います。丈夫な糸状菌（例えば、アスペルギルスおよびフザリウム属）の場合、細胞材料は液体窒素で急速冷凍され、乳棒と乳鉢で粉砕された後、適切な溶解バッファーを含む溶液中で急速にボルテックスされます。
精製は、シリカへの結合を促進するグアニジン塩を添加したフェノール-クロロホルムまたはスピンフィルター膜技術を使用して行うことができます。
大腸菌の染色体は、細胞当たり約0.005ピコグラムにのぼる、サイズはわずか4.5メガバイトです。単一の開始コロニーからの典型的な一晩培養物は、約1-2× 109細胞/ mlを含みます。理論的には、これは、1mlの培養物が109個の細菌細胞あたり約5µgのgDNAを生成することを意味します。選択したアプリケーションに必要なDNAの量を計算するときは、これを考慮に入れてください。
プラスミドDNA(pDNA)はgDNAから分離しておく必要があるため、プラスミドDNAの抽出は少し注意が必要です。この分離はサイズに基づいており、適切な分離は適切な溶解方法の使用に依存します。
pDNA抽出の場合、細胞壁を酵素でかみ砕いたり、ガラスビーズで叩いたりするよりも、溶解をはるかに微妙にする必要があります。BirnboimとDolyは、1979年にアルカリ溶解によるプラスミドDNA抽出のための（事実上）普遍的な方法を発明しました。
溶解バッファーには水酸化ナトリウムとSDSが含まれており、プラスミドとgDNAを完全に変性させます（つまり、DNAを一本鎖に分離します）。過度の変性は不可逆的にプラスミドを変性させる可能性があるため、このステップを迅速に実行することが重要です。次に、サンプルを酢酸カリウム溶液で中和してプラスミドを再生します。これは、プラスミドとgDNAを分離するための鍵です。プラスミドは小さいため、簡単に再アニーリングしてdsDNAを形成できます。ただし、ゲノムDNAは長すぎて完全に再アニーリングできず、代わりに絡み合って相補鎖が分離されたままになる傾向があります。遠心分離中、gDNA（タンパク質に結合）はペレットを形成しますが、プラスミドDNAは可溶性のままです。このステップでは、gDNAが壊れやすいため、サンプルを激しくボルテックスしたり混合したりしないことが重要です。壊れたgDNAは、再アニーリングしてプラスミドと溶解するのに十分小さい場合があります。
pDNAの精製、次に、上清中のプラスミドDNAをエタノール沈殿するか、フェノール-クロロホルムまたはスピンフィルターを使用して精製します。スピンフィルターテクノロジーを使用している場合、中和バッファーにはグアニジン塩が含まれているため、ライセートはシリカに直接結合してさらに洗浄および溶出できます。得られたDNAは、ほとんどの下流の分子生物学アプリケーションにとって十分に純粋です。
トランスフェクションにプラスミドが必要な場合は、陰イオン交換精製が汚染エンドトキシンを除去するためのより良い選択です。より高速なシリカベースの精製セットアップを使用して、エンドトキシンの除去も可能です。高収量のプラスミドDNAを単離するには、対数増殖期後期または定常期初期の培養物を使用します。プラスミド維持のために適切な濃度の新鮮な単一コロニーと新鮮な選択抗生物質を使用して培養物を準備します。プラスミド抽出物にgDNAが混入する可能性があるため、細菌培養物を増殖させないことが重要です。
https://bitesizebio.com/1660/plasmid-v-genomic-dna-extractionthe-difference/
11) DNA Adsorption to and Elution from Silica Surfaces: Influence of Amino Acid Buffers (2014)
正に帯電した（アルギニン（ARG）とヒスチジン（HIS））、負に帯電した（アスパラギン酸（ASP）とグルタミン酸（GLU））、極性中性（GLU）に分類されるアミノ酸を含む溶液からシリカへのDNA吸着への影響を測定しました。アスパラギン（ASN）、グルタミン（GLN）、セリン（SER））、および非極性疎水性（ロイシン（LEU）、プロリン（PRO）、およびグリシン（GLY））。さらに、DNA抽出の固相として2種類のシリカ粒子を選択しました。最初のタイプであるMagPrepシリカコーティング磁性粒子（Merck）は、核酸の固相抽出に一般的に使用されます。ただし、これらの粒子のシリカ表面は、核酸抽出用に最適化されている可能がある
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4097040/
12) プラスミド精製 JP2007500711A – 特許 –
多孔のポアサイズを持つ陰イオン交換レジンによる精製。大きいサイズのプラスミドは、外表面に結合、プラスミドより小さいサイズの負電荷物は、プラスミドがアクセスできないボア内に結合させる。
背景情報には、>80%飽和硫酸アンモニウムによりpDNAを可溶性、ゲノムDNAを不溶性に分離できる特許情報の記載がある(米国特許第６２１４５８６号（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ.)
https://patents.google.com/patent/JP2007525222A/ja
13) Milligram scale parallel purification of plasmid DNA using anion-exchange membrane capsules and
a multi-channel peristaltic pump (2007)低濃度CTAB (0.1-4g/L) 沈殿法によるpDNAとRNA/Endotoxinの分離 : 2g/L or 10g/L CTAB/50mM NaCl溶液を添加し、Incubation20分, cfg(38,000xg 20min, 20℃)/pptを70% EtOHで洗浄し、0.6M NaCl, 25mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.4で氷冷下で溶解。
https://www.researchgate.net/profile/Stefan-Schmidt-27/publication/6232344_Milligram_scale_parallel_purification_of_plasmid_DNA_using_anion-exchange_membrane_capsules_and_a_multi-channel_peristaltic_pump/links/59de01f545851557bde325bd/Milligram-scale-parallel-purification-of-plasmid-DNA-using-anion-exchange-membrane-capsules-and-a-multi-channel-peristaltic-pump.pdf
14) Purification of plasmid (pVaxLacZ) by hydrophobic interaction chromatography (2005)
2.5M AmSO4(硫酸アンモニウム)で沈殿化した後、HICでBindingさせ、1.5M AmSO4でElutionする。
https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-89132005000400014
Using a single hydrophobic-interaction chromatography to purify pharmaceutical-grade supercoiled plasmid DNA from other isoforms (2012)
1. HICカラムにより抽出したpDNAを不純物であるタンパク質、RNA、エンドトキシンなどの宿主汚染物質から分離精製する
2. scpDNAとocpDNAを分離可能。
3. 3 M硫酸アンモニウムの存在下では、scpDNAはocpDNAよりも疎水性が高くなり、ocpDNAは最初にHICから溶出できることで、一部のocpDNAをscpDNAから除去可能
4. 効果的な免疫応答と感染性チャレンジからの保護を引き出すために高いスーパーコイルレベルが必要であることを示されている（Cupillard et al。、2005; Pillai et al。、2008）
5. 製品には細菌ゲノムDNA、RNA、タンパク質、エンドトキシンが含まれていない必要
6. 第二に、pDNA産物は高い均質性でなければなりません。つまり、ほとんどのプラスミドはスーパーコイルアイソフォーム
7. プラスミドの品質分析（アガロースゲル電気泳動、HPLCなど）は、最終pDNAが98±1.2％のスーパーコイル率と検出限外以下の不純物であった。
8. リポソームトランスフェクション実験は、ここで説明する精製pDNAがコントロールpDNAよりも高いトランスフェクション効率を持っていることを示しました。 したがって、この研究で提示された方法は、医薬品グレードのpDNAを製造するための主な要件を満たしている。 ラボ規模の準備から大規模な生産への移行は簡単です。
Figure 3. Plasmid purity analysis by HPLC. Plasmid purity was determined by anion-exchange HPLC on a MONO QTM 5/50 GL column. A linear gradient was performed at 0.5 mL/min by increasing the NaCl 0–1 M in 40 mM Tris/HCl, pH 8.0 for 10 CV at a flow rate of 0.5 mL/min. (A) plasmid sample purified by 2 M ammonium sulfate, (B) plasmid sample purified by 2.5 M ammonium sulfate, (C) plasmid sample purified by 3 M ammonium sulfate.
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.3109/13880209.2012.703678
Improved downstream process for the production of plasmid DNA for gene therapy (2005)
HICにより、OCは最初のピークに、RNAは後のピークに、スーパーコイルであるpDNAは、その間に溶出される。
Figure 4. Performance of the HIC step.
Top: Elution profile of the HIC step (pRZ-hMCP1, 4.9 kbp). Main fractions are indicated by dashed lines. Bottom: Analyti- cal HPLC chromatograms of the HIC fractions; a) the first HIC peak contains impurities and open circular (oc) pDNA; b) the second HIC peak contains mainly supercoiled (ccc) pDNA; c) residual RNA and further im- purities elute when conductivity is suddenly strongly decreased. More strongly bound material is washed out of the column dur- ing regeneration (peak at the end of the HIC chromatogram
分析は、AEC。
http://www.actabp.pl/pdf/3_2005/703.pdf
プラスミドバックボーン – Plasmid backbones –
日本語訳:
https://parts.igem.org/Plasmid_backbones
蛍光レポーターまたはカスタム配列をターゲット部位に挿入するために用いるドナープラスミド構築キットEdit-R HDR Plasmid Donor Kit – FUNAKOSHI –
https://www.funakoshi.co.jp/contents/63964
遺伝子治療のための新規人工遺伝子デリバリーシステム : 多機能性エンベロープ型ナノ構造体の開発 (2007) – YAKUGAKU ZASSHI 127(10) 1685-1691 (2007) –
https://yakushi.pharm.or.jp/FULL_TEXT/127_10/pdf/1685.pdf
[GS02-1] 脾臓選択的遺伝子導入キャリアの開発とDNAワクチンへの応用 – 日本薬学会 第141年会
免疫細胞へ効率的に抗原遺伝子を送達し、発現させることが課題となる。脾臓は多くの免疫細胞 が局在し、全身性免疫を司る臓器であり、DNAワクチンの有望な標的臓器と考えられる。我々が見出した LNPは、脾臓選択的な遺伝子発現を示し、脾臓内において抗原提示細胞に分布していた。
発表表紙はパスワード必要
編集履歴 2020/10/22 Mr.HARIKIRI 2020/10/25 追記 (内容の充実化) 2020/11/19 追記 (ベクター・デザイン) 2020/12/24、追記 (pDNAの物性) 2021/01/05 誤字脱字訂正 2021/05/10 追記 (文献19,20)
![[用語] HEK293細胞 – その他派生種の概説 [2020/12/22]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2020/07/52A14BA1-7FA5-4C9E-BA19-8AB55D61952D.jpeg)
発音は、ヘックニキュサン。ATCCで管理されている。
HEK293 – ATCC –
https://www.atcc.org/Products/All/CRL-1573.aspx
いずれの派生種でも<26時間のポテンシャルはあると考えられるが、培地によってそのポテンシャルは左右される参考3)。
HEK293細胞とHEK293T細胞の違い
https://research-supporters.com/2020/01/19/hek293/
HEK293T細胞
https://ja.wikipedia.org/wiki/HEK293細胞
SMM 293-TI Expression Medium (Serum free, with Glutamine, complete medium)
https://jp.sinobiological.com/other-products/cell-culture-medium-m293ti
The Scattered Twelve Tribes of HEK293
https://biomedpharmajournal.org/vol11no2/the-scattered-twelve-tribes-of-hek293/
2020/09/30 Mr.HARIKIRI 2020/10/21 文言整備 2020/12/22 追記 (参考) 2021/01/20 追記 (ATCC) 2021/03/05 追記 (参考4)
![[Synology] 以前からeo光(1Gコース)なのに速度が遅く感じられていた(100Mbps) – 6A型(CAT6)のネットケーブルで改善 (300 ~ 500Mpbs) [2021/03/30]](https://harikiri.diskstation.me/myblog/wp-content/uploads/2021/02/BBA80493-481A-4463-8AC4-21D8743F7E20.jpeg)
もう数年以来、ネットの速度が遅いなぁ~と思っていたが、ありまり実害が感じ無かったので放置していました。ネットでの実害と言えば、nintendo Swithcの「スプラトゥーン2」をしていて、夜中12になるとそろそろ始まり、1時には、もう頻繁に接続が切れることくらいでした。現在も続いていますが、以下のネットワークケーブルを交換してどうなることは、今後確認してみます。
今回は、単にネットの測定結果として、速度が改善されたという話題です、以下のeo専用のeo光の速度測定サイトから測定します。
コースごとの測定が選べますが、全てのコースで測定しましたが、僕にとっては、どれもそれほど差があると思えないのですが、とりあえず1Gコースがホームネットワークに適用されています。eo光は100Mコースから始めていますが、途中、色々とコースが提供されていました。でも、特に必要性を感じなかったので、これでまで流されてきています。100Mコースが自動的に200Mコースになり、今の1Gコースも多分自動的に適用されたと記憶しています。
今回、上述したようにネトゲの通信問題、WordPressでのあるプラグインで処理した時のtime out問題、少し放置しておくのも限界と思いたました。
朝10時ごろの測定結果を以下の図に示します。下りが131Mbps、上りが76Mbpsと、あっと驚く測定結果でした。まさかと思いました。
ケーブルの交換後、朝11時ごろの測定結果を以下に示します。下りが、1回目で304Mbpsと上りが488Mbps、2回目で364Mbpsと538Mbps、結構な改善効果でした。
参考に、適応されている1Gコースではない、その他のコースで測定した結果を以下に示します。
関西在住者必見「10ギガ」の「eo光」はどのくらい速い？ – ASCII –
ブラウザによつては、ネットの速さはだいぶ違うようだ(はりきり)。
https://ascii.jp/elem/000/001/830/1830511/2/
ケーブルの選択は、同じ過ちをしないために、これまで使用していたスリムタイプでなく、シールドがしっかり施されている従来通りの太いケーブルを選びました(A6, ストレート)。特に「eo光」対応や、A6と記載されている、少し価格帯が高いものです。
ホームネットワークの無線ルーターは、Synology RT2600acです。eo光の終端装置は、富士通のONU3GEF/FE2です。この間の上記ケーブルの5mで接続しました。また、この終端装置は、1Gコースまで使用できるとOptageからアナウンスされている機種です。今後、5G/10Gコースに変更する場合は、変更が必要な終端装置になります。
●バッファローのケーブル表示 E301195 AWM STYLE 2725 V W− — 教えて! goo —
CAT5e相当のケーブルでは、信号線のツイストペアが4本(合計8本)は、平型ケーブルで作られているものがあるが、CAT6では、ツイストペアを確実に分別するために十字の仕切り物があるので、平型は作ることはできない。CAT7では、更に各サイストペアにシールドが施され、コネクタがアースが必須のSTPコネクタとなっており、業務用となっている
https://oshiete.goo.ne.jp/qa/11918302.html
ある時刻になると、途端に接続が断続的に切れたり、繋がったりを1分間隔で発生してます。毎日です。この現象は、24時を過ぎる、あるいは調子がいいとは、1AMまで大丈夫で突然に発生します。~6PM頃でも、同様の現象を経験していますが、時間が一定であることから、eo光側の運用の影響ではないかと強く思っています。
そこで、ネットが切れる現象が生じた時を見計らって、以下のリンクに示したeo光のユーザーサポートにある「回線テストを行う」を実施してみました。その結果、接続に問題なしの判定でした。
この問題は、1年以上前から生じているので、現在のeo光1Gコースから5Gコース、または、10Gコースに変更することを何度か検討しましたが、現在まで保留にしていました。現在(2021/03)、インターネットの切断/接続を繰り返すという原因を掴み切れていませんが、最近、Synology Router のRT2600acのネットワークモニターとNintendo Switchの回線ストを使って確認してみました。ネットワークモニターでは、(1)WiFiは正常につながっているのに、(2)インターネット側で「制限付き接続」という表示が、上記の記載の通りに断続的に表示されます。正常接続を交互に繰り返しています。
Nintendo Switchの回線テストを実施したとき、まず、インターネットの接続状況を判定し、正常であれは、NATタイプ、ダウンロード速度およびアップロード速度を測定します。それぞの値は、通常、~70kbpsと~30kbpsです。この場合、RT2600acのネットワークモニターでのピーク速度は、ダウンロードで300KB/s、アップロードで6KB/sです。一方、ダウンロードで150KB/sを下回ってくるとと、この測定の段階でエラー(接続不良)を報告してきます。
Nintendo Switchでの回線テストを実施しなくても、インターネットの接続は、断続的に接続/切断を繰り返すことを観察できているので、ゲームによる大容量の通信が原因でインターネットの回線が切断されているとは考えられず、eo光側の問題であると思われます。ただ、RT2600acのハードウェア的な問題である可能性も排除できていません。この問題については、もう一台RT2600acを準備してから検討する予定です。
eo光側が原因である可能性というのは、eo光の設備の問題、加入しているコース(1G)の問題も含みますが、コースの問題だとして5Gコースのコース変更は、現在、申し込みが停止されています。新型コロナの問題が発生した初期(2020/~5)では、まだ、コース変更の申し込みは停止されていませんでしたが、現在は、5G/10Gコースへの変更・新規加入は停止されています。世界的に半導体の供給が少ないことが理由であるとOptageは言っています。以上のように、現在まで、長らく続くホームネットワーク問題です。
障害情報一覧 — Optage —
「回線テストを行う」から光回線の状態をテストできます。eo光設備から、宅内のONU(終端装置)までの不具合をチェックできるようです。おそらく、光ファイバーの劣化・断線についてチェックされるものと思われます(2021/03/30, MR.HARIKIRI)
https://support.eonet.jp/ac_list/
[Q] eo光ネット 1ギガコースへ変更したが、コース変更前と速度が変わらない – eo光ネット –
https://support.eonet.jp/usqa/net/4202367_14139.html
編集履歴 2020/10/19 Mr.Harikiri 2021/03/27 ホームネットワークのメンテナンスとしてELECOM Laneed 6A型を1m x 2, 2 m x 3, 3m x 1を購入したので、この機に文言整備、CAT5,6および7の違いについて、教えて!goo、blue_plusさんの回答を参照． 2021/03/30 追記 (eo光の「回線テスト」について)
